Određivanje željeza u hrvatskim maslinovim uljima primjenom GF-AAS tehnike

Transcription

1 Margareta Talanga Određivanje željeza u hrvatskim maslinvim uljima primjenm GF-AAS tehnike DIPLOMSKI RAD predan Sveučilištu u Zagrebu Farmaceutsk-bikemijskm fakultetu Zagreb, 2017.

2 Ovaj diplmski rad je prijavljen na klegiju Analitika u razvju farmaceutskih prizvda Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsk-bikemijskg fakulteta i izrađen na Zavdu za analitiku i kntrlu lijekva pd vdstvm izv. prf. dr. sc. Ane Mrnar Turk i suvditeljstvm dr. sc. Daniele Amidžić Klarić, mag. pharm., spec. kliničke farmacije. Zahvaljujem mentrici izv. prf. dr. sc. Ani Mrnar Turk i kmentrici dr. sc. Danieli Amidžić Klarić, mag. pharm., spec. kliničke farmacije na trudu, ulženm vremenu i pmći prilikm pisanja diplmskg rada. Zahvaljujem se i dr. sc. Iliji Klarić na pmći u prvedbi eksperimentalng dijela rada. Takđer se zahvaljujem prf. dr. sc. Biljani Nigvić št je mgućila prvđenje istraživanja buhvaćenih vim diplmskim radm na Zavdu za analitiku i kntrlu lijekva. Psebni zahvalu upućujem Zakladi Adris kja je svjm dnacijm mgućila prvđenje vg istraživanja. Velik hvala mjim rditeljima, sestri, mjj stalj bitelji i prijateljima na ptpri, ljubavi i strpljenju tijekm studiranja.

3 SADRŽAJ 1 UVOD MASLINOVO ULJE Kakvća maslinvg ulja Keficijent ekstinkcije, K Kategrizacija maslinvg ulja Metali u maslinvm ulju ATOMSKA APSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA Atm i atmska spektrskpija Kvantitativna atmska apsrpcijska spektrskpija Vrste atmske apsrpcijske spektrskpije za dređivanje metala Matriks mdifikacija OBRAZLOŽENJE TEME MATERIJALI I METODE MATERIJALI Uzrci maslinvg ulja Radni instrumenti Standardne supstancije Kemikalije Pribr i psuđe Prgramski paketi METODE Spaljivanje uzrka mikrvalnm digestijm Određivanje kncentracije željeza u maslinvm ulju grafitnm tehnikm Priprema standardnih tpina Određivanje keficijenta ekstinkcije primjenm UV-VIS spektrftmetrije REZULTATI I RASPRAVA ZAKLJUČAK LITERATURA SAŽETAK/SUMMARY TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA/ BASIC DOCUMENTATION CARD... 32

4 1 UVOD

5 1.1 Maslinv ulje Maslinv ulje je jestiv ulje kje se dbiva iz plda masline Olea eurpea var. sativa (Oleaceae). Najveći prizvđači maslinvg ulja u Eurpi su Španjlska, Italija i Grčka (Guld, 1992). Ova bitna sastavnica mediteranske prehrane bgata je vitaminm E, plifenlima te zasićenim i nezasićenim masnim kiselinama, među kjima treba istaknuti leinsku kiselinu. Blagdati maslinvg ulja pznate su neklik stljeća, a danas je n predmet brjnih znanstvenih istraživanja vezanih uz razna bljenja. Danas je pznat kak je knzumacija maslinvg ulja usk pvezana sa smanjenim rizikm d kardivaskularnih blesti, ka i smanjenm učestalšću blijevanja d dređenih vrsta zlćudnih blesti ka št su karcinm djke i klna. Nedavna istraživanja su pkazala da plifenli, prisutni u maslinvm ulju, inhibiraju ksidaciju LDL-a i sprječavaju nastajanje atersklertskih plakva. Dijetterapijski učinak maslinvg ulja je u visnsti s njegvm kvalitetm te je iznimn važn utvrditi kvalitetu pjeding uzrka (Zeiner i sur, 2005). Kvalitetu maslinvg ulja mguće je definirati s kmercijalng, nutritivng i senzričkg stajališta (Duran, 1990) Kakvća maslinvg ulja Prema Pravilniku uljima d plda i kmine maslina (NN 7/09; 112/09), kji je izrađen prema međunardnim smjernicama, definirani su snvni pkazatelji kvalitete maslinvg ulja: udi ukupnih slbdnih masnih kiselina izraženih ka leinska kiselina, perksidni brj, keficijent ekstincije K232 i K270 i rganleptička svjstva (miris, kus, bja). Kličina slbdnih masnih kiselina, izražena na leinsku kiselinu je bitan čimbenik klasifikacije maslinvg ulja te je manja d 0,8% kd ekstra djevičanskg maslinvg ulja. Nadalje, relevantan pkazatelj kvalitete maslinvg ulja je i perksidni brj (Bsku, 1996; Rssel, 1986; Salvadr i sur., 2001, 2003). Knačn, na kvalitetu maslinvg ulja utječe način njegva skladištenja te mu se smanjuje i uklik se miješa s drugim uljima. 2

6 1.1.2 Keficijent ekstinkcije, K Tehnika UV/VIS spektrmetrije daje pdatke kvaliteti maslinvg ulja, stupnju ksidacije dnsn čuvansti te prmjenama uzrkvanim tehnlškim pstupkm. Tijekm stajanja u ulju dlazi d vezanja kisika na mjestu dvstruke veze kd linlne i linleinske kiseline uz nastajanje hiperksida. Dakle, dlazi d pucanja dvstruke veze i stvaranja dien knjugata, kji pkazuje apsrbanciju na 232 nm, te trien knjugata kji apsrbira na 268 nm i 232 nm (Slika 1). Slika 1. Strukturni prikaz dien knjugata. Vrijednsti dbivenih apsrbancija izražavaju se ka specijalne ekstincije, K. Valne duljine prema službenj metdi Eurpske unije za vrednvanje maslinvg su na 232 nm (K232) i na 270 nm (K270) (Tablica 1). Tablica 1. K232 i K270 vrijednsti maslinvih ulja različite kvalitete. Vrsta maslinvg ulja K232 K270 Ekstra djevičansk maslinv ulje 3,0 0,18 / 0,20 Djevičansk maslinv ulje 3,0 0,18 / 0,25 Rafiniran maslinv ulje 3,0 / 3,5 1,0 /1,1 3

7 1.1.3 Kategrizacija maslinvg ulja Ulja se razvrstavaju u kategrije pd sljedećim nazivima: 1) Djevičanska maslinva ulja a) Ekstra djevičansk maslinv ulje dbiven izravn iz plda masline isključiv mehaničkim pstupcima, sadrži najviše 0,8 g slbdne leinske kiseline na 100 g b) Djevičansk maslinv ulje dbiven izravn iz plda masline isključiv mehaničkim pstupcima, sadrži najviše 2 g slbdne leinske kiseline na 100 g c) Maslinv ulje lampante je djevičansk maslinv ulje neprihvatljivih senzrskih svjstava, sadrži 2 g slbdne leinske kiseline na 100 g ulja 2) Rafiniran maslinv ulje dbiven rafinacijm djevičanskg maslinvg ulja, kje ne sadrži više d 0,3 g slbdne leinske kiseline na 100 g 3) Maslinv ulje sastavljen d rafiniranih maslinvih ulja i djevičanskih ulja, kje ne sadrže više d 1 g slbdne leinske kiseline na 100 g 4) Sirv ulje kmine maslina je dbiven preradm kmine maslina mehaničkim pstupcima i/ili ekstrakcijm kmine maslina rganskim tapalima, bez rafinacije i reesterifikacije s uljima druge vrste 5) Rafiniran ulje kmine je ulje dbiven rafinacijm sirvg ulja kmina masline, kje ne sadrže više d 0,3 g slbdne leinske kiseline 6) Ulje kmine maslina je ulje dbiven miješanjem rafinirang ulja kmina maslina i djevičanskih maslinvih ulja, kja ne sadrže više d 1 g slbde leinske kiseline na 100 g Pdjela maslinvih ulja iznesena je na temelju pdataka dbivenih iz Pravilnika uljima d plda i kmine maslina (NN br. 7/09, članak 2). 4

8 1.1.4 Metali u maslinvm ulju Analiza teških metala i nekih drugih metala u tragvima je bitna za ispitivanje kvalitete maslinvih ulja. Naime, brjni metali iznimn su važni zbg svje metabličke ulge u ljudskm rganizmu. Nadalje, vrsta i kličina metala u tragvima, kju je mguće naći u maslinvm ulju, mže pslužiti i za gegrafsk dređivanje njihva pdrijetla. Pznata je nutritivna vrijednst nekih metala (Zn, Fe i Cu), dk s druge strane treba brinuti da se dređeni metali (Ni, Pb, Cd, As i Hg) ne nalaze u tksičnim dzama (Mendil i sur., 2008). Mguća je kntaminacija metalima pput bakra i željeza tijekm pstupaka prizvdnje ulja. Metali se u ulju takđer mgu naći tak št se iz tla ugrađuju u pld masline ka psljedica zagađeng kliša i blizine prmetnica (Zeiner i sur., 2005, Cindrić i sur., 2006). Na kraju ptrebn je istaknuti kak neki metali ka št su Cu, Fe i Mn mgu umanjiti kvalitetu maslinvg ulja budući da ubrzavaju ksidacijske prcese u ulju, dk su metali ka št su Cd, Cr, Hg, Ag i Pb štetni p zdravlje čvjeka. Stga je Međunardn vijeće za maslinv ulje (eng. Internacinal Olive Oil Cuncill, IOOC) definiral najviše dzvljene kncentracije (NDK) za As (0,1 mg/kg), Pb (0,1 mg/kg), Cu (0,1 mg/kg) i Fe (3 mg/kg) u maslinvm ulju (Tablica 2). Tablica 2. Dzvljene kncentracije za bakar i željez (prilagđen i preuzet IOC, 2015). Metali u tragvima Ekstra djevičansk maslinv ulje Djevičansk maslinv ulje Običn djevičansk maslinv ulje Maslinv ulje lampante Rafiniran djevičansk maslinv ulje Maslinv ulje Sirv ulje kmine maslina Rafiniran ulje kmine maslina Ulje kmine maslina mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Željez (Fe) Bakar (Cu) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Budući da su dzvljene kličine navedenih metala u maslinvm ulju iznimn niske za dređivanje njihve kncentracije ptrebn je kristiti vrl sjetljive analitičke tehnike ka št je najčešće krištena AAS grafitna tehnika. Ddatni analitički izazv predstavlja i priprema uzraka ulja za analizu. Od predanalitičkih tehnika mguće je krištenje tehnika pput suhg spaljivanja, digestije pd viskim tlakm, zagrijavanja u mikrvalnj ili spaljivanja uz pmć plazma-kisika (De Lenardis i sur., 2000). 5

9 1.2 Atmska apsrpcijska spektrmetrija Atm i atmska spektrskpija Atm se sastji d jezgre, kja je kružena elektrima. Atm svakg elementa ima jedinstvenu rbitalnu strukturu s tčn dređenim brjem elektrna. Takva knfiguracija kja ima najnižu energiju zve se "snvn stanje". Dvđenjem energije tčn dređene valne duljine, dlazi d apsrpcije i elektrn prelazi u manje stabiln stanje tzv. "pbuđen stanje". S bzirm da je v stanje nestabiln, elektrn se spntan vraća u knfrmaciju snvng stanja emitiranjem energije kja je ekvivalenta jednakj kličini apsrbirane energije. Gre pisani prces prikazan je na Slici 2. (Beaty i Kerber, 1993). Slika 2. Prces ekscitacije i pvratak u pčetn stanje (preuzet d Beaty i Kerber, 1993) Kvantitativna atmska apsrpcijska spektrskpija Kd atmske apsrpcijske spektrskpije se mjeri i analizira valna duljina kd ekscitacije, kja je karakteristična za svaki element. Kličina intenziteta apsrbirang zračenja prprcinalna je kncentraciji Vrste atmske apsrpcijske spektrskpije za dređivanje metala Na temelju načina atmizacije razlikujem neklik tehnika za dređivanje metala: i) plamena (eng.flame Atmic Spectrscpy, FAAS), ii) grafitna (eng.graphite Furnace Atmic Absrptin Spectrscpy, GF AAS), iii) hidridna (eng. Hydride Generatin Atmic Absrbitn Spectrscpy, HG AAS), iv) induktivn spregnuta plazma-atmska emisijska spektrmetrija (eng. Inductively Cupled Plasma Atmic Emissin Spectmetry, ICP-MS) i v) induktivn spregnuta plazma-masena spektrmetrija (eng. Inductively Cuples Plasma Mass Spectrmetry, ICP-MS). Plamena tehnika je ka tehnika analize metala jednstavna, jeftina, brza (za analizu ptrebn je svega neklik sekundi). Granica dkazivanja vm tehnikm je ppb-mg/l razini. 6

10 Ka nedstatak tehnike ističe se mgućnst dređivanja jedng p jedng metala. Uzrak iz psude unsi se u instrument primjenm pdtlaka te se ptm uzrak, kji je tekućem stanju, prensi na plamen gdje se atmizira. Tak nastali atmi apsrbiraju svjetlst iz izvra (Slika 3) (Welz i Sperlin, 1997). Slika 3. Shematski prikaz FAAS tehnike (izvr: Amidžić Klarić, 2016) Grafitna tehnika je skuplja i sprija tehnika d plamene (za analizu je ptrebn neklik minuta). I kd ve tehnike dređuje se element p element, n granice dkazivanja su nešt niže neg u plamenj tehnici. Stga se tehnika prvenstven primjenjuje u analizi elemenata u tragvima. Glavni di instrumenta je grafitna peć kja se sastji d 3 snvna dijela amrtizera, sustava za napajanje i prgrama (Slika 4). Za prvedbe analize grafitnm tehnikm dvljne su male kličine uzrka (µl). Svakak je ptrebn istaknuti kak je za vu tehniku ptrebn veće iskustv analitičara (Welz i Sperlin, 1997). 7

11 Slika 4. Shematski prikaz GF AAS tehnike (izvr: Amidžić Klarić, 2016) Velika prednst same tehnike št se mgu analizirati uzrci različitg sastava matrice, ka št su bilški i gelški uzrci. Ipak, uzrke kji sadrže velike kličine rganskg materijala ptrebn je prikladn pripremiti prije analize. Iak je prblem nastajanje ksida u grafitnj tehnici smanjen, jer se atmizacija dgađa u inertnj atmsferi, mguće su kemijske interakcije. Prilikm analize grafitnm tehnikm prepručljiv je krištenje matriks mdifikatra, a dabir mdifikatr visi analizi, uvjetima i instrumentu. Grafitna kiveta mgućuje ptpunu atmizaciju cijelg uzrka i dulje zadržavanje atma u ptičkm putu neg št je slučaj kd plamene atmizacije. Viska temperatura ptrebna za atmizaciju pstiže se dvđenjem električne energije na krajeve grafitne cijevi, pri čemu se grafitna kiveta užari d temperature d 3000 C (Perkin Elmer, 2000) Matriks mdifikacija Primjena tehnike matriks mdifikacije iznimn je važna u smanjivanju interferencija kd dređivanja metala u tragvima. Primjenm ve tehnike, kemijski blik, a time i fizička svjstva elementa se mijenjaju ddavanjem dgvarajućeg reagensa u uzrak ili standard. Prednsti matriks mdifikacije su te št smanjuje hlapljivst analizirang elementa i sprječava njegv gubitak tijekm tplinskg predtretmana, dk s druge strane pvećava isparivsti sastavnica matriksa i pmaže kd njihvg uklanjanja prije same atmizacije. Većina prizvđača prizvdi autsamplere grafitne pećnice kji imaju mgućnst primjene jedng ili više matriks mdifikatra sekvencinaln ili istvremen (Perkin Elmer, 8

12 2000). U Tablici 3 dane su detaljne infrmacije tme kak primijeniti i pripremiti najčešće krištene tpine matriks mdifikatra kd rutinskih prvjera. Tablica 3. Matriks mdifikatri za rutinske analize kd GFAAS tehnike. Mdifikatr Pd+Mg(NO 3) 2 Pd+Mg(NO 3) 2 P Glavna primjena Ag, As, Au, Bi, Cd, Cu, Ga, Ge, Hg, In, Mn, Sb, Se, Sn,Te, Tl Ptrebna apslutna masa 5 µg Pd + 3 µg Mg(NO 3) 2 20 µg Pd + 5 µg Mg(NO 3) 2 Ptrebna kličina reagensa 1% (10 g/l) Pd + 1% (10 g/l) Mg 1% (10 g/l) Pd + 1% (10 g/l) Mg Radna tpina (ddataka 5 µl mdifikatra) Priprema Razrijediti 1 ml standardne tpine Pd i 0,1 ml standardne tpine Mg u dmjernu tikvicu d 10 ml i nadpuniti deiniziranm vdm (18 m ) d znake. Razrijediti 4 ml standardne tpine Pd i 0,17 ml standardne tpine Mg u dmjernu tikvicu d 10 ml i nadpuniti deiniziranm vdm (18 m ) d znake. Kncentracija 0,1% (1 g/l) Pd + 0,06% (0,6 g/l) Mg(NO 3) 2 0,4% (4 g/l) Pd + 0,1% (1 g/l) Mg(NO 3) 2 Mg(NO 3) 2 Al, Be, C, Cr, Fe, Si 15 µg Mg(NO 3) 2 1% (10 g/l) Mg Razrijediti 0,5 ml standardne tpine Mg u dmjernu tikvicu d 10 ml i nadpuniti deiniziranm vdm (18 m ) d znake. 0,3% (3 g/l) Mg(NO 3) 2 Mg(NO 3) 2 Zn 5 µg Mg(NO 3) 2 1% (10 g/l) Mg Razrijediti 0,17 ml standardne tpine Mg u dmjernu tikvicu d 10 ml i nadpuniti deiniziranm vdm (18 m ) d znake. 0,1% (1 g/l) Mg(NO 3) 2 9

13 2 OBRAZLOŽENJE TEME

14 Teški metali i metali u tragvima imaju negativan učinak na samu kvalitetu maslinvg ulja. Željez ptiče ksidaciju masnih kiselina, među kjima treba istaknuti leinsku kiselinu. Sastav metala u maslinvm ulju visi različitim čimbenicima: srti masline, vrsti tla, blizine prmetnica te samj tehnlgiji dbivanja ulja i njegva skladištenja. U analitičkm pgledu, dređivanje metala u maslinvm ulju predstavlja izazv zbg slženg rganskg matriksa s jedne strane te male kličine prisutnih analita s druge strane. Iz gre navedenih razlga, cilj vg diplmskg rada bi je: drediti kncentraciju željeza u 35 uzraka maslinvih ulja pribavljenih s različitih pdručja Republike Hrvatske usprediti dbivene kncentracije željeza s najvećm dzvljenm kncentracijm željeza u maslinvm ulju (3,0 mg/kg), kje su prpisane pravilnicima Međunardng vijeća za maslinv ulje (eng. Internatinal Olive Oil Cuncil, IOOC) te kategrizirati analizirana maslinva ulja na temelju ekstinkcijskg keficijenta dređeng prema službenj metdi kmisije za vrednvanje maslinvih ulja. 11

15 3 MATERIJALI I METODE

16 3.1 Materijali Uzrci maslinvg ulja 35 uzraka maslinvg ulja sakupljenih iz različitih dijelva Republike Hrvatske Radni instrumenti Atmski apsrpcijski spektrmetar AAnalyst 800 THGA (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Pećnica za mikrvaln spaljivanje uzraka ETHOS UP (Milestne, Srisle, Italija) UV-VIS spektrftmetar Lambda 25 (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Analitička vaga (Mettler Tled, Švicarska) Sustav za prčišćavanje vde (Milipre, Bedfrd, MA, SAD) Standardne supstancije GF-AAS smjesa standarda: Al, As, Pb, Sb, Se, Tl (100 mg/l); Ba, C, Cu, Ni (50 mg/l); Cr, Fe, Mn (20 mg/l); Ag (10 mg/l); Be, Cd (5 mg/l) (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Kemikalije Izktan (2,2,4-trimetilpentan) HPLC čistće, min. 99,5% (LGC Standards GmbH, Njemačka) Mdifikatr matriksa: Mg(NO 3) 2 (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Nitratna kiselina TraceSELECT Ultra, za analizu elemenata u tragvima, 65-71%, (Sigma- Aldrich GmbH, Buchs, Švicarska) Vdikv perksid TraceSELECT Ultra, za analizu elemenata u tragvima, 30%, (Sigma- Aldrich GmbH, Buchs, Švicarska) Vda: za pripremu svih tpina krištena je ultračista vda tprnsti 18.2 MΩ cm (25 ºC) dbivena krištenjem Milipre sustava za prčišćavanje (Bedfrd, MA, SAD) Pribr i psuđe Grafitne kivete - THGA (End Cap) (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Lampa sa šupljm katdm HCL (engl. Hllw Cathde Lamp) pjedinačna lampa za željez (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) PTFE psude za mikrvaln spaljivanje (Milestne, Srisle, Italija) Autmatske jednkanalne pipete pdesivg vlumena za pipetiranje uzraka (Rainin, Švicarska) Plastične dmjerene tikvice (Vitlab, Grßstheim, Njemačka) Plastična psuda za grafitnu tehniku Kapaljke (ISOLAB, Wertheim, Njemačka) 13

17 3.1.6 Prgramski paketi AA WinLab Versin 32 (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) EasyCntrl sftware (Milestne, Srisle, Italija) UV WinLab (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD) Micrsft Office Excel (Micrsft, Seattle, WA, SAD) Statistica ver (StatSft, Tulsa, OK, SAD) 3.2 Metde Spaljivanje uzrka mikrvalnm digestijm Maslinv ulje sadrži viski udi lipidnih sastavnica te predstavljaju slžen rganski sustav za dređivanje metala. U cilju dbivanja hmgene tpine prikladne za dređivanje metala grafitnm tehnikm svi analizirani uzrci prethdn su spaljeni mikrvalnm digestijm. Ukratk, 0,2 0,3 g uzrka dvagan je u PTFE psudu za mikrvaln spaljivanje te ddan 9 ml nitratne kiseline (65-71%) TraceSELECT Ultra i 1 ml vdikv perksid ( 30%) TraceSELECT Ultra za analizu elemenata u tragvima. Zatim su PTFE psude zatvrene te prveden prgram mikrvalne digestije (Tablica 4). Nakn spaljivanja i hlađenja, uzrak je kvantitativn prenesen u plastičnu dmjernu tikvicu, nakn čega je slijedi pstupak dređivanja metala grafitnm tehnikm. Tablica 4. Prgram mikrvalne digestije Krak Vrijeme Temperatura ( C) Snaga (W) 1 00:20: :10: Određivanje kncentracije željeza u maslinvm ulju grafitnm tehnikm Kncentracija željeza u maslinvm ulju dređena je metdm grafitne tehnike, GF- AAS. Ka inertni plin nsitelj u analizi grafitne tehnike krišten je argn, dk je pjedinačna lampa za željez bila izvr zračenja. Za ptrebe prvedbe analize krišten je PVC labratrijsk psuđe. Prikladni labratrijski pribr i psuđe držani su 24 sata prije uptrebe u 5% HNO3, zatim isprani ultračistm vdm te krišteni u prvedbi analize. 14

18 3.2.3 Priprema standardnih tpina Radna tpina analizirang metala za izradu baždarng pravca pripremljena je razrjeđivanjem standardne tpine željeza ultračistm vdm u prikladnm mjeru, a kncentracija krištenih radnih tpina metala prikazana je u Tablici 5. Nadalje, radna tpina mdifikatra matriksa krištena u analizi metala grafitnm tehnikm pripremljena je razrjeđivanjem s ultračistm vdm u dgvarajućem mjeru. Analitički parametri za dređivanje željeza u maslinvm ulju GF-AAS tehnikm prikazan je u Tablici 5. Tablica 5. Analitički parametri za dređivanje željeza u maslinvm ulju GF-AAS tehnikm Element Fe Valna duljina (nm) 248,3 Otvr puktine mnkrmatra (nm) 0.2 Lampa HCL Struja lampe (ma) 30 Tip signala Način mjerenja Vrijeme mjerenja (s) AA-BG pvršina pika 3 s Standard (µg/l) 5, 10, 15, 20 Injektirani vlumen uzrka (µl) 20 Mdifikatr matriksa mg Mg(NO3)2 Vlumen mdifikatra matriksa (µl) 5 Legenda: AA - atmska apsrpcija; BG - pzadinska krekcija 15

19 Slika 5. Temperaturni prgram rada grafitne pećnice za dređivanje željeza GF-AAS tehnikm (1. isparavanje tapala; 2. sušenje uzrka; 3. pirliza uzrka, "burn ff"; 4. atmizacija; 5. čišćenje kivete) Određivanje keficijenta ekstinkcije primjenm UV-VIS spektrftmetrije Kvaliteta maslinvg ulja dređuje se mjerenjem karakteristika spektara pri valnim duljinama d 200 d 300 nm. Navedeni spektri pvezani su s knjugiranim dienskim i trienskim sustavima. Niska apsrbancija u vm pdručju mjerenja ukazuje na viskkvalitetn ekstra djevičansk maslinv ulje, dk rafinirana/krivtvrena ulja pkazuju veću razinu apsrbancije u vj pdručju. K vrijednst dređena je prema službenj metdi eurpske kmisije za vrednvanje maslinvih ulja na dvije valne duljine 232 i 270 nm, krištenjem UV-VIS spektrftmetra Lambda 25 (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD). Uzrci maslinvg ulja razrijeđeni su iz-ktanm (2,2,4-trimetilpentanu). Nakn pripreme uzrci su izmjereni u dgvarajućim kvarcnim kivetama (ptička duljina puta: 10 mm), dk je slijepa prba bi iz-ktan. 16

20 Nakn tga, prveden je pstupak mjerenja apsrbancije tpine pri valnim duljinama d 232, 266, 270 i 274 nm. K vrijednsti izračunate su prema navedenj jednadžbi K = K 270 K K Čistću maslinvg ulja mguće je drediti na temelju tri parametra: K232 apsrbancija mjerena pri valnj duljini d 232 nm K270 apsrbancija mjerena pri valnj duljini d 270 nm K Tablica 6. Maksimaln dpuštene vrijednsti prema Uredbi Kmisije (EEZ) br. 2568/91 (EEC Cmmissin number 2568/91) Vrsta maslinvg ulja K232 K270 K Ekstra djevičansk maslinv ulje 2,4 0,20 0,01 Djevičansk maslinv ulje 2,5 0,25 0,01 Maslinv ulje 3.3 1,0 0,13 17

21 4 REZULTATI I RASPRAVA

22 Određivanje kncentracije željeza u 35 uzraka maslinvg ulja prijeklm iz Republike Hrvatske prvedena je metdm atmske apsrpcijske spektrmetrije grafitnm tehnikm na instrumentu AAnalyst 800 THGA (PerkinElmer, Waltham, MA, SAD). Prvedena je verifikacija već pstjeće metde (Perkin Elmer, 2000; Welz i Sperling 1997), te su ispitane validacijske značajke: radn pdručje, linearnst, granica detekcije, granica dkazivanja i pnvljivst mjerenja uzrka (Tablica 7.). Pri tme je granica dkazivanja (LOD) i dređivanja (LOQ) za vaj element dređena uzastpnim mjerenjem (n=10) slijepe prbe te izračunata srednja vrijednst i standardna devijacija mjerenja. Trstruka vrijednst standardne devijacije uzeta je ka LOD, a deseterstruka vrijednst standardne devijacije ka LOQ. Nakn tga prvedena je analiza uzraka. U uzrcima je prije prvedbe analize prvedena mineralizacija prcedurm mikrvalne digestije (pglavlje 3.2.1). Kncentracija metala prisutna u uzrku maslinvg ulja dređena je iz kalibracijske krivulje, visnsti pvršine pika kncentraciji metala. Dbiveni rezultati prikazani su u Tablici 7 te Slikama 6 i 7. Slika 6. Prikaz pika dbiveng tijekm mjerenja kncentracije željeza navedenm metdm. 19

23 (a) (b) Slika 7. Kalibracijska krivulja, visnsti pvršine pika kncentraciji metala željeza u radnj tpini ( vrijednst dbivena mjerenjem tpine standarda, vrijednst dbivena mjerenjem tpine uzrak). 20

24 Tablica 7. Značajke validacije za dređivanje željeza u maslinvm ulju GF-AAS tehnikm. Element Fe Radn pdručje (µl/l) 5-20 Kalibracijska krivulja (n=4) y = x Keficijent krelacije LOD (µg/kg) a 15,0 LOQ (µg/kg) a 50,0 LOD (µg/l) b 0,15 LOQ (µg/l) b 0,5 Pnvljivst mjerenja uzrka (%) 2,48 a na temelju dvage 0,250 g uzrka b na temelju dgvarajuće slijepe prbe U literaturi su dstupni brjni pdaci negativnim učincima elemenata u tragvima (npr. željez, bakar) na ksidativnu stabilnst maslinvg ulja i ljudsk zdravlje zat je kncentracija navedene skupine metala u maslinvm ulju jedan je d parametara kvalitete vg tradicinalng ulja. Oksidacija kja vdi d razvja nepvljnih mirisa i kusa jedan je d glavnih razlga smanjene kvalitete maslinvih ulja. Čimbenici kji najviše utječu na brzinu ksidacije su: stupanj nezasićensti, kličina kisika, temperatura, svjetlst i prisutnst metala (uglavnm prijelaznih metala ka št su Fe i Cu). Navedeni metali pvećavaju brzinu ksidacije jestivih ulja pvećavanim stvaranja slbdnih radikala iz masnih kiselina ili hidrperksida ka primarnih prizvda autksidacije (Meira i sur., 2011; Benedet i Shibamt, 2007; Sikwese i Dudu, 2007). Sadržaj željeza u maslinvm ulju rezultat je prirdng prijekla vg elementa u tragvima iz plda masline i antrpgenih izvra. Kncentracija željeza u analiziranim maslinvim uljima kretala se u raspnu d 0,120 d 3,461 mg/kg, uz SV d 0,677 mg/kg (RSD: 0,28-4,46%). Budući da je najviša dzvljena kncentracija željeza u maslinvm ulju 3 mg/kg, kncentracija željeza u ispitivanim uzrcima bila je ispd dzvljenih vrijednsti, sim u jednm uzrku maslinvg ulja (3,461 mg/kg). Osim tga, primijećen je kak se dbiveni raspn za kncentracije željeza u maslinvim uljima u ptpunsti slaže sa drugim maslinvim uljima (Ieggli i sur., 2011) i t španjlskim (d 120 ng/g) i turskim (SV: 139,0 µg/g) maslinvim uljima (Llrent-Martinez i sur., 2011; Llrent-Martinez i sur., 2010; Mendil i sur, 2008). 21

25 Knjugirani dieni i triena nastaju ksidacijm ulja te apsrbiraju u ultraljubičastm dijelu spektra (Slika 8). Vrijednsti navedenih apsrbancija izražene su ka keficijent ekstincije, K (Tablica 8). Kd pet prikupljenih uzraka vrijednsti K232, K270 dnsn ΔK su bile veće d 2,50, 0,22 dnsn 0,01 stga prema Uredbi Kmisije (EEZ) br. 2568/91 i Pravilniku uljima d plda i kmine maslina kjeg je dnijel Ministarstv pljprivrede, ribarstva i ruralng razvja tih pet uzraka nije klasificiran ka ekstra djevičansk maslinv ulje već ka djevičansk maslinv ulje. Slika 8. Spektri snimljenih uzraka (n=35) pri valnim duljinama d 220 d 300 nm. Tablica 8. K vrijednsti u analiziranim maslinvim uljima Vrijednst SV Medijan Raspn kvantificiranih vrijednsti Interkvartil K232 2,0604 2,0356 1,3719-2,5490 1,8912-2,2272 K270 0,1722 0,1474 0,0867-0,5611 0,1318-0,1936 K266 0,1695 0,1509 0,0876-0,4082 0,1305-0,1947 K274 0,1538 0,1393 0,0847-0,3497 0,1228-0,1762 Δ K 0,0106 0,0030 0,0001-0,1822 0,0019-0,0063 Legenda: SV srednja vrijednst triplikata 22

26 5 ZAKLJUČAK

27 Na temelju prvedeng istraživanja, dbivenih rezultata i rasprave mguće je zaključiti sljedeće: 1. Prvedenim istraživanjem učene su prednsti dređivanja kncentracije željeza grafitnm tehnikm nakn uklanjanja slženg matriksa spaljivanjem uzraka mikrvalnm digestijm. 2. Niske RSD vrijednsti upućuju na iznimnu/zadvljavajuću pnvljivst i pstupka mikrvalne digestije i dređivanja kncentracije metala grafitnm tehnikm. 3. Na temelju dbivenih vrijednsti LOD i LOQ te definirane NDK prveden metda grafitne tehnike mže se smatrati prikladnim za dređivanje kncentracije željeza u maslinvim uljima. 4. Kncentracije željeza u istraživanim maslinvim uljima bile su ispd najviše dzvljene kncentracije definirane važećim pravilnikm, sim u jednm uzrku te upućuje na ddatn praćenje vg elementa u hrvatskim maslinvim uljima. 5. Istraživana maslinva ulja kategrizirana su ka ekstra djevičansk maslinv ulje, dk je pet uzraka klasificiran u skupinu djevičansk maslinv ulje. 6. Kncentracija željeza i keficijent ekstinkcije u maslinvim uljima prijeklm iz Republike Hrvatske ne razlikuju se u dnsu na maslinva ulja prijeklm iz drugih zemalja. Ptrebna su daljnja istraživanja u kviru zastupljensti drugih metala u maslinvm ulju.

28 6 LITERATURA

29 Amidžić Klarić D, Primjena atmske spektrmetrije u kntrli kvalitete lijekva i ddataka prehrani, predavanje, Hrvatsk farmaceutsk društv, Beaty RD, Kerber JD. Cncepts, Instrumentatin and Techniques in Atmic Absrptin Spectrphtmetry. Nrwalk, The Perkin - Elmer Crpratin, 1993, str ; ; ; Benedet JA, Shibamt T. Rle f Transitin Metals, Fe(II), Cr(II), Pb(II), and Cd(II) in Lipid Perxidatin. Fd Chem, 2007, 107, Bsku D. Olive Oil Quality in Bsku D. (Ed.) Olive Oil: Chemistry and Technlgy AOCS Press, Champaign, IL, USA Cindrić IJ, Zeiner M, Steffan I. Trace Elemental Characterizatin f Edible Oils by ICP- AES and GFAAS. Micrchem J, 2006, 85, Cdex standard fr live ils and live pmace ils, 1981., pristupljen De Lenardis A, Maccila V, De Felice M. Cpper and irn determinatin in edible vegetable ils by graphite furnace atmic absrptin spectrmetry after extractin with diluted nitric acid. Int J Fd Sci Technl, 2000, 35, Duran RM. Relatinship between the cmpsitin and ripening f the live and the quality f the il. Acta Hrtic., 1990, 286, Guld WA. Ttal quality management fr the fd industries. Baltimre, USA: CTI Publicatins Inc.,

30 Ieggli CVS, Bhrer D, D Nasciment PC, De Carvalh LM. Flame and graphite furnace atmic absrptin spectrmetry fr trace element determinatin in vegetable ils, margarine and butter after sample emulsificatin. Fd Addit Cntam Part A, 2011, 28, Llrent-Martinez EJ, Ortega-Barrales P, Fernandez-de Crdόva ML, Dminguz-Vidal A, Ruiz-Medina A. Analysis f the Legistated Metals in Different Categries f Olive and Olive-pmace Oils. Fd Cntrl, 22, 2010, Llrent-Martinez EJ, Ortega-Barrales P, Fernandez-de Crdόva ML, Dminguz-Vidal A, Ruiz-Medina A. Investigatin by ICP-MS f Trace Element Levels in Vegetable Edible Oils Prduced in Spain. Fd Chem, 2011, 127, Meira M, Quintella CM, ds Sants Tanajura A, da Silva HGR, Fernand JDS, da Csta Net PR, Pepe JM, Sants MA, Nasciment LL. Determinatin f the Oxidatin Stability f Bidiesel and Oils by Spectrflurimetry and Multivariate Calibratin. Talanta, 2011, 85, Mendil D, Uluözlü ÖD, Tüzen M, Sylak M. Investigatin f the Levels f Sme Element in Edible Oil Samples Prduced in Turkey by Atmic Absrptin Spectrmetry. J Hazard Mater, 2008, 165, Perkin Elmer. Analytical methds fr atmic absrptin spectrmetry. Nrwalk, Pravilnik uljima d plda i kmine maslina, 2009, Zagreb, Nardne nvine, brj 7 (NN/7/2009). Rssell JB. Classical analysis f ils and fats. (Eds), In Hamiltn RJ and Rssell JB, Elsevier Applied Science Publishers, Ltd, England,

31 Salvadr MD, Aranda F, Gómez-Alns S, Fregapane G. Crnicabra virgin live il: a study f five crp seasns. Cmpsitin, quality and xidative stability. Fd Chem, 2001, 74, Salvadr MD, Aranda F, Gmez-Alns S, Fregapane, G. Influence f Extractin System, Prductin Year and Area n Crnicabra Virgin Olive Oil: A Study f Five Crp Seasns. Fd Chem, 2003, 80, Sikwese FE, Dudu KG. Antixidant Effect f A Crude Phenlic Extract frm Srghum Bran in Sunflwer Oil in the Presence f Ferric Ins. Fd Chem, 2007, 104, Welz B, Sperling M. Atmabsrptins-spektrmetrie. 4. Neubearbeitete Auflage, Weinheim, Wiley-VCH, 1997, str.4. Zeiner M, Steffan I, Juranvic Cindric I. Determinatin f trace elements in live il by ICP - AES and ETA AES. Micrchem J, 2005, 81,

32 7 SAŽETAK/SUMMARY

33 Budući da elementi u tragvima imaju negativne učinke na ksidativnu stabilnst maslinvg ulja i ljudsk zdravlje, cilj vg rada bi je drediti kncentraciju željeza, elementa važng u prcjeni kvalitete maslinvih ulja. Analiza vg elementa u tragvima u 35 uzraka maslinvg ulja prijeklm iz Republike Hrvatske prvedena je metdm atmske apsrpcijske spektrmetrije grafitnm tehnikm. Uzrci maslinvg ulja sadrže viski udi lipidnih sastavnica te predstavljaju slžen rganski sustav za dređivanje metala. U cilju dbivanja hmgene tpine prikladne za dređivanje metala grafitnm tehnikm svi analizirani uzrci prethdn su spaljeni mikrvalnm digestijm. Prvedenim istraživanjem učene su prednsti dređivanja kncentracije željeza grafitnm tehnikm nakn uklanjanja slženg matriksa spaljivanjem uzraka mikrvalnm digestijm. Niske RSD vrijednsti upućuju na zadvljavajuću pnvljivst i pstupka mikrvalne digestije i dređivanja kncentracije metala grafitnm tehnikm. Na temelju dbivenih vrijednsti LOD i LOQ te definirane NDK, prvedene metde grafitne tehnike mgu se smatrati prikladnim za dređivanje analizirang metala u maslinvim uljima. Kncentracije željeza u istraživanim maslinvim uljima bile su ispd najviše dzvljene kncentracije definirane važećim pravilnikm sim u jednm uzrku te upućuju na ddatn praćenje zastupljensti vg metala u hrvatskih maslinvih ulja. Ptrebna su daljnja istraživanja u kviru zastupljensti drugih metala u maslinvm ulju. Istraživana maslinva ulja kategrizirana su ka ekstra djevičansk maslinv ulje, dk je manji brj uzraka klasificiran u skupinu djevičansk maslinv ulje. 30

34 Since heavy metals and trace elements have negative effects n the xidative stability f live il and human health, the aim f this study was t determine the cncentratins f irn, the element imprtant fr the assessment f live il quality. The analysis f this trace element, in 35 samples f live il, riginating frm the Republic f Cratia, were perfrmed by atmic absrptin spectrmetry using graphite technique. The samples f live il cntain a high prprtin f lipid cmpnents, and thus represent a cmplex rganic system fr the determinatin f metal. In rder t btain a hmgeneus slutin suitable fr the determinatin f metal by graphite technique, all analyzed samples were previusly prepared using a micrwave digestin system. The btained results have shwn the advantages f irn cncentratin determinatin by graphite technique after remval f cmplex matrix by burning samples by micrwave-assisted digestin. Lw RSD values pint ut the exceptinal/satisfactry repeatability f micrwave digestin prcedures and the metal cncentratin determinatin by graphite technique. Based n the btained LOD and LOQ values as well as the defined NDK, cnducted graphite technique methds can be cnsidered as suitable t determine the analyzed metal in live ils. The cncentratins f irn in the investigated live ils were belw their maximum permissible cncentratins as defined by the valid rulebk, except in ne sample. The presented data pint t the exceptinal quality f Cratian live ils. Further research shuld be cnducted t evaluate the presence f ther metals in the investigated live il samples. The investigated live ils are categrized as extra virgin live il, while a small number f samples are classified int the grup f virgin live il. 31

35 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA/ BASIC DOCUMENTATION CARD

36 Temeljna dkumentacijska kartica Sveučilište u Zagrebu Farmaceutsk-bikemijski fakultet Studij: Farmacija Zavd za analitiku i kntrlu lijekva A. Kvačića 1, Zagreb, Hrvatska Diplmski rad Određivanje željeza u hrvatskim maslinvim uljima primjenm GF-AAS tehnike Margareta Talanga SAŽETAK Budući da elementi u tragvima imaju negativne učinke na ksidativnu stabilnst maslinvg ulja i ljudsk zdravlje, cilj vg rada bi je drediti kncentraciju željeza, elementa važng u prcjeni kvalitete maslinvih ulja. Analiza vg elementa u tragvima u 35 uzraka maslinvg ulja prijeklm iz Republike Hrvatske prvedena je metdm atmske apsrpcijske spektrmetrije grafitnm tehnikm. Uzrci maslinvg ulja sadrže viski udi lipidnih sastavnica te predstavljaju slžen rganski sustav za dređivanje metala. U cilju dbivanja hmgene tpine prikladne za dređivanje metala grafitnm tehnikm svi analizirani uzrci prethdn su spaljeni mikrvalnm digestijm. Prvedenim istraživanjem učene su prednsti dređivanja kncentracije željeza grafitnm tehnikm nakn uklanjanja slženg matriksa spaljivanjem uzraka mikrvalnm digestijm. Niske RSD vrijednsti upućuju na zadvljavajuću pnvljivst i pstupka mikrvalne digestije i dređivanja kncentracije metala grafitnm tehnikm. Na temelju dbivenih vrijednsti LOD i LOQ te definirane NDK, prvedene metde grafitne tehnike mgu se smatrati prikladnim za dređivanje analizirang metala u maslinvim uljima. Kncentracije željeza u istraživanim maslinvim uljima bile su ispd najviše dzvljene kncentracije definirane važećim pravilnikm sim u jednm uzrku te upućuju na ddatn praćenje zastupljensti vg metala u hrvatskih maslinvih ulja. Ptrebna su daljnja istraživanja u kviru zastupljensti drugih metala u maslinvm ulju. Istraživana maslinva ulja kategrizirana su ka ekstra djevičansk maslinv ulje, dk je manji brj uzraka klasificiran u skupinu djevičansk maslinv ulje. Rad je phranjen u Središnjj knjižnici Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsk-bikemijskg fakulteta. Rad sadrži: 34 stranica, 8 grafičkih prikaza, 8 tablica i 23 literaturna navda. Izvrnik je na hrvatskm jeziku. Ključne riječi: željez, maslinv ulje, nečišćenja, grafitna AAS, mikrvalna digestija Mentr: Kmentr: Ocjenjivači: Dr. sc. Ana Mrnar Turk, izvanredna prfesrica Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutskbikemijskg fakulteta Dr. sc. Daniela Amidžić Klarić, znanstvena suradnica Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutskbikemijskg fakulteta Dr. sc. Ana Mrnar Turk, izvanredna prfesrica Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutskbikemijskg fakulteta Dr. sc. Daniela Amidžić Klarić, znanstvena suradnica Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutskbikemijskg fakulteta Dr. sc. Željan Maleš, redviti prfesr Sveučilišta u Zagrebu Farmaceutsk-bikemijskg fakulteta Rad prihvaćen: rujan

37 Basic dcumentatin card University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry Study: Pharmacy Department f Pharmaceutical Analysis A. Kvačića 1, Zagreb, Cratia Diplma thesis Determinatin f irn in Cratian live ils using GF-AAS technique Margareta Talanga SUMMARY Since heavy metals and trace elements have negative effects n the xidative stability f live il and human health, the aim f this study was t determine the cncentratins f irn, the element imprtant fr the assessment f live il quality. The analysis f this trace element, in 35 samples f live il, riginating frm the Republic f Cratia, were perfrmed by atmic absrptin spectrmetry using graphite technique. The samples f live il cntain a high prprtin f lipid cmpnents, and thus represent a cmplex rganic system fr the determinatin f metal. In rder t btain a hmgeneus slutin suitable fr the determinatin f metal by graphite technique, all analyzed samples were previusly prepared using a micrwave digestin system. The btained results have shwn the advantages f irn cncentratin determinatin by graphite technique after remval f cmplex matrix by burning samples by micrwave-assisted digestin. Lw RSD values pint ut the exceptinal/satisfactry repeatability f micrwave digestin prcedures and the metal cncentratin determinatin by graphite technique. Based n the btained LOD and LOQ values as well as the defined NDK, cnducted graphite technique methds can be cnsidered as suitable t determine the analyzed metal in live ils. The cncentratins f irn in the investigated live ils were belw their maximum permissible cncentratins as defined by the valid rulebk, except in ne sample. The presented data pint t the exceptinal quality f Cratian live ils. Further research shuld be cnducted t evaluate the presence f ther metals in the investigated live il samples. The investigated live ils are categrized as extra virgin live il, while a small number f samples are classified int the grup f virgin live il. The thesis is depsited in the Central Library f the University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry. Thesis includes: 34 pages, 8 figures, 8 tables and 23 references. Original is in Cratian language. Keywrds: Mentr: C-Mentr: Reviewers: irn, live il, impurities, graphite furnace AAS, micrvawe digestin Ana Mrnar Turk, Ph.D. Assciate Prfessr, University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry Daniela Amidžić Klarić, Ph.D. Research Assciate, University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry Ana Mrnar Turk, Ph.D. Assciate Prfessr, University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry Daniela Amidžić Klarić, Ph.D. Research Assciate, University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry Željan Maleš, Ph.D. Full Prfessr, University f Zagreb Faculty f Pharmacy and Bichemistry The thesis was accepted: September