Áhrif cystatin C mýlildis á THP-1 átfrumur

Transcription

1 Áhrif cystatin C mýlildis á THP-1 átfrumur Áhrif cystatin C mýlildis á sérhæfingu, upptöku og sjálfsát THP-1 átfrumna Hildur Margrét Ægisdóttir Leiðbeinandi: Pétur Henry Petersen, PhD Lokaverkefni til B.Sc. gráðu Háskóli Íslands Heilbrigðisvísindasvið

2 Áhrif cystatin C mýlildis á THP-1 átfrumur Hildur Margrét Ægisdóttir Lokaverkefni til B.Sc.-gráðu í læknisfræði Leiðbeinandi: Pétur Henry Petersen, PhD Læknadeild Heilbrigðisvísindasvið Háskóla Íslands Júní 2012

3 Ritgerð þessi er lokaverkefni til B.Sc. gráðu í læknisfræði og er óheimilt að afrita ritgerðina á nokkurn hátt nema með leyfi rétthafa. Hildur Margrét Ægisdóttir, 2012 Prentun: Háskólaprent Reykjavík, Ísland 2012

4

5 Efnisyfirlit Efnisyfirlit... 1 Ágrip... 3 Listi yfir skammstafanir Inngangur Cerebral amyloid angiopathy Arfgeng íslensk heilablæðing Fyrri rannsóknir á CAA Átfrumur miðtaugakerfisins Monocytar og macrophagar Microglial frumur Ónæmisviðbrögð við mýlildi innan heilans Áhrif mismunandi formgerða mýlildis á átfrumur Upptaka og eyðing átfrumna á mýlildi fyrri rannsóknir Áhrif mýlildis á THP-1 frumur THP-1 frumulínan Þekkt áhrif Aβ mýlildis á THP-1 frumur Fyrri rannsókn á áhrifum cystatin C mýlildis á THP-1 frumur Mýlildi og sjálfsát Um sjálfsát Mikilvægi sjálfsáts í mýlildissjúkdómum í heila Frumueitrunaráhrif mýlildis tengsl við sjálfsát Markmið rannsóknarinnar Efniviður og aðferðir Cystatin C mýlildi Einangrun mýlildis Flúrmerking mýlildis og BSA Mýlildi sett á ræktunargler THP-1 frumur Frumurækt Frumur settar á ræktunargler Sérhæfing frumna Fixering og mótefnalitun Myndgreining Ljóssmásjárgreining Flúrsmásjárgreining Confocal smásjárgreining

6 3 Niðurstöður Sérhæfing THP-1 monocyta yfir í macrophaga Flúrmerking mýlildis THP-1 macrophagar taka upp flúrmerkt prótein (BSA) THP-1 macrophagar taka upp flúrmerkt cystatin C mýlildi Cystatin C mýlildi sérhæfði ekki THP-1 monocyta yfir í virkjaða macrophaga THP-1 macrophagar á cystatin C mýlildi tjá frekar sjálfsátspróteinin LC3 og Lamp Ekki var munur í tjáningu sjálfsátspróteinsins LC3 á flúrmerktu mýlildi Ekki var munur í caspasa-3 tjáningu THP-1 átfrumna á flúrmerktu mýlildi Ályktanir Umræða Sérhæfing átfrumna og upptaka þeirra á mýlildi Þáttur sjálfsáts í niðurbroti mýlildis Próteinflúrmerking á mýlildi Lokaorð Þakkir Heimildaskrá

7 Ágrip ÁHRIF CYSTATIN C MÝLILDIS Á THP-1 ÁTFRUMUR Hildur Margrét Ægisdóttir 1, Pétur Henry Petersen 1,2 1 Læknadeild Háskóla Íslands, 2 Lífvísindasetur Háskóla Íslands Inngangur Cerebral amyloid angiopathy (CAA) er sjúkdómsástand sem einkennist af uppsöfnun torleystra próteina; mýlildis (e. amyloid), innan heilaæða. Undir þann flokk sjúkdóma fellur arfgeng íslensk heilablæðing, en meinvaldur hennar er stökkbreytt prótein, cystatin C, sem myndar mýlildi. Uppsöfnun þráðlaga forms þess er eitruð sléttvöðvafrumum í vegg heilaæðanna og afleiðingarnar eru endurteknar heilablæðingar. Markmið rannsóknarinnar var að kanna áhrif cystatin C mýlildis á mannafrumurnar THP-1 monocyta. Könnuð var upptaka þess, auk sjálfsáts (e. autophagy); ferils frumunnar sem snýr að eyðingu uppsafnaðra próteina. Efniviður og aðferðir Mýlildi úr heilaæðum látinna sjúklinga með arfgenga íslenska heilablæðingu var einangrað og leyst upp fyrir notkun. Fylgst var með örlögum mýlildisins með tilliti til upptöku þess og eyðingu, eftir að THP-1 frumum var bætt á það. Oftast voru frumurnar sérhæfðar með PMA yfir í virkjaðar átfrumur sem festust við undirlag sitt. Mýlildið var flúrmerkt svo hægt væri fylgjast með upptöku þess bæði af fixeruðum og lifandi frumum. Einnig var rannsakað hvort frumurnar tjáðu meira af próteinum sem tengd eru sjálfsáti. Til þess var notast við mótefnalitun. Niðurstöður Eftir að frumunum var komið fyrir á flúrljómandi mýlildi voru teknar myndir daglega. Þær sýndu að ef frumurnar höfðu verið sérhæfðar með PMA festu þær sig frekar á mýlildið og átu það upp. Eftir viku var hægt að sjá að hluta mýlildisins hafði verið eytt. Niðurstöður mótefnalitunar bentu til að prótein tengd sjálfsáti væru tjáð meira í frumum meðhöndluðum með cystatin C mýlildi. Ályktanir Uppsöfnun cystatin C mýlildis er líklega sjúkdómsvaldur arfgengrar íslenskrar heilablæðingar. Rannsóknir á áhrifum þess á frumur og eyðingu þess gætu gagnast til að hægja á eða koma í veg fyrir sjúkdóminn. Mikilvægt er að skilgreina hvaða ferlar koma að henni. Rannsóknir á öðru mýlildi, Aβ, í tilraunadýrum hafa sýnt að ef hæfni til sjálfsáts er aukin í miðtaugakerfinu með einum eða öðrum hætti hamlar það framgangi sjúkdómsins. 3

8 Listi yfir skammstafanir Aβ AML APP BSA CAA FBS Hsc70 IFN-γ IL-6 LPS NGS PBS PMA TNF-α Amyloid β Acute Monocytic Leukemia Amyloid Precursor Protein Bovine Serum Albumin Cerebral Amyloid Angiopathy Fetal Bovine Serum Heat shock cognate 70 Interferon-γ Interleukin-6 Lipopolysaccharide Normal Goat Serum Phosphate Buffer Saline Phorbol 12-Myristate 13-Acetate Tumor Necrosis Factor α 4

9 1 Inngangur 1.1 Cerebral amyloid angiopathy Mýlildi (e. amyloid) er uppsöfnun próteina sem taka á sig torleysta byggingu með krosstengdum β-flötum og geta verið hættuleg umlykjandi lifandi vef (1). Cerebral amyloid angiopathy (CAA) er sjúkdómsástand sem einkennist af uppsöfnun mýlildis í vegg heilaæða. Henni fylgir þrenging æðaholrýmis og veiking æðaveggs (2). Mýlildið sest helst fyrir í návígi við sléttvöðvalag æðanna og er toxískt umlykjandi vöðvafrumum (3, 4) (mynd 1). Helstu afleiðingar telja heilablæðingar, oftast frá æðum til heilabarkar og heilahimna, og vitglöp (e. dementia), sem talin eru tilkomin vegna súrefnisþurrðarskemmda í heilavef. Krufningar á heilum sjúklinga með CAA benda til að þessar skemmdir verði vegna endurtekinna smáblæðinga í heila (2). Algengast er að uppsöfnun mýlildisins eigi sér stað með hækkandi aldri. Samkvæmt rannsókn í Austurríki hefur u.þ.b helmingur fólks á aldrinum Mynd 1. Heilaæð sjúklings með arfgenga íslenska heilablæðingu. Mótefnalitað hefur verið fyrir cystatin C (rauðbrúnt). Æðaveggurinn er sjáanlega fylltur af mýlildi. Myndin er birt með góðfúslegu leyfi Ásbjargar Óskar Snorradóttur. ára CAA af völdum amyloid β (Aβ) mýlildis. Sama mýlildi safnast upp í heilum yfir 90% Alzheimer s sjúklinga og er talið eiga stórt hluverk í meingerð sjúkdómsins (5). Stakstæð (e. sporadic) CAA af þessu tagi er næstalgengasti valdur heilablæðinga og þá oftast í svæði hvirfilblaðs (e. parietal lobe) (6). Þó getur CAA hins vegar einnig verið ættgengt vegna erfðra stökkbreytinga. Það er mun sjaldgæfara og kemur sjúkdómsmyndin fram fyrr á lífsleiðinni. Til dæmis hafa fundist margar mismunandi stökkbreytingar í amyloid precursor protein (APP); forvera próteinsins Aβ, sem valda því að það myndar mýlildi og meðfylgjandi CAA (7, 8). Arfgeng íslensk heilablæðing er dæmi um ættgengt CAA (9). 5

10 1.1.1 Arfgeng íslensk heilablæðing Arfgeng íslensk heilablæðing (Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy) er ættgengur sjúkdómur sem hrjáir ákveðnar fjölskyldur innan Íslands eingöngu. Sjúkdómurinn orsakast af punktstökkbreytingu (L68Q) í geninu sem kóðar fyrir cystein próteasa hindranum cystatin C. Um er að ræða ríkjandi A-litnings stökkbreytingu sem veldur því að tjáð er óstöðugra afbrigði af próteininu sem hefur tilhneigingu til að mynda tvenndir og safnast upp sem mýlildi. Það tekur á sig þráðlaga (e. fibrillar), óuppleysanlega byggingu (9). Cystatin C er tjáð í öllum kyrndum frumum líkamans, og getur mýlildið safnast upp í nokkrum líffærum en uppsöfnun þess í heilaæðum sjúklinganna er sá þáttur sem veldur alvarlegustu einkennunum; vitglöpum, lömun og ótímabæru lífláti, vegna endurtekinna heilablæðinga. Flestir berar stökkbreytingarinnar fá heilablæðingar milli 20 og 40 ára aldurs, og meirihluti þeirra lætur lífið í kring um 30 ára aldur (9, 10) Fyrri rannsóknir á CAA Flestar rannsóknir sem gerðar hafa verið á CAA snúa að stakstæðu formi þess, þ.e. Aβ uppsöfnun í Alzheimer s sjúkdómi. Margar rannsóknir hafa verið gerðar á músalíkönum til að auka skilning á þeim ferlum sem valda uppsöfnuninni sem og mögulegum hreinsunarferlum. Niðurstöður rannsókna um hlutverk átfrumna í CAA stangast á og ekki er vitað hvort þær dragi úr eða auki á sjúkdómsástandið. Tilgátur beinast að offramleiðslu umræddra próteina, eða ónógrar eyðingu þeirra. Margar rannsóknir á stakstæðri Aβ uppsöfnun benda til hins síðarnefnda; að gallinn liggi í vanstarfsemi átfrumna, sem myndu annars taka upp mýlildið og eyða því (11-13). 1.2 Átfrumur miðtaugakerfisins Í miðtaugakerfinu eru bólguviðbrögð í lágmarki, enda frumur heilavefs viðkvæmar og endurnýjast nánast aldrei. Af þeirri ástæðu skilur blóð-heila þröskuldur (e. blood brain barrier) ýmsa þætti innan blóðsins frá starfsvef heilans og lengi vel var talið að engum bólguviðbrögðum væri miðlað til eða frá miðtaugakerfinu. Nú er vitað að hvers kyns skemmdir innan þess, t.d. vegna súrefnisþurrðar eða sýkingar, geta virkjað einkjarna átfrumur og vakið upp bólguviðbragð (14). Einkjarna átfrumur eru stór hópur frumna sem eiga uppruna sinn í blóði og blóðmyndandi vef. Þær sinna mikilvægu hlutverki í vefjaniðurbroti t.d. á formi beinátfrumna. Einnig verka þær bæði í sértæka og ósértæka ónæmiskerfinu, með ósértækri eyðingu á sýklum og skemmdum vef og miðlun á sértæku viðbragði T-frumna (15). 6

11 Hér að neðan eru mismunandi einkjarna átfrumur sem finna má í miðtaugakerfinu kynntar. Síðar, þegar samband þeirra við mýlildi er útskýrt með tilliti til fyrri rannsókna, eru þær ekki aðgreindar vegna náins skyldleika milli þeirra nema annað sé tekið fram Monocytar og macrophagar Uppruni monocyta liggur í beinmergnum en þeir færast síðan í blóðrásina (mynd 2). Þar taka þeir þátt í bólgusvari og eru meðal fyrstu hvítra blóðfrumna til að flytjast yfir æðavegginn og inn í sýkta eða skemmda vefi. Í vefjum geta þeir sérhæfst, m.a. í macrophaga; helstu átfrumur líkamans. Macrophaga má finna í flestum vefjum. Þeir taka upp og eyða sýklum eða skemmdum vef. Einnig seyta þeir bólgumiðlinum tumor necrosis factor α (TNF-α) og laða fleiri átfrumur að bólgusvæði (15, 16). Undir streituaðstæðum þar sem bólga er aukin t.d. vegna aukinnar virkni microglial frumna (sjá 1.2.2) flytjast monocytar í auknum mæli gegnum gliðnaðan blóð-heila þröskuld og sérhæfast yfir í macrophaga (17). Mynd 2. MSF=mergstofnfruma (myeloid stem cell), FF=forverafruma (progenitor cell), MB=monoblast, MC=monocyte, MP=macrophage, AF=angafruma (dendritic cell), MGF=microglial fruma. Þroskun og sérhæfing einkjarna átfrumna. Monocytar eru komnir af frumum í blóðmyndandi vef, ferðast með blóðrás um líkamann og geta gefið af sér macrophaga og angafrumur í 7

12 bólguviðbragði. Microglial frumur eru komnar af einkjarna forverafrumum sem setjast að í miðtaugakerfinu í fósturþroska. Þær eru hliðstæður macrophaga í heilanum Microglial frumur Innan heilans má finna sérstakar átfrumur, microglial frumur. Þær eru skyldar macrophögum og eru hliðstæður þeirra í heilanum, en myndast í fósturþroska og eru staðbundnar í heilavef. Þrátt fyrir að vera í svokallaðri hvíldarstöðu í heilbrigðum heilavef eru þær stöðugt að teygja anga sína út í leit að mögulegu virkjunaráreiti (18, 19). Microglial frumur virkjast m.a. við taugaskemmdir. Talið er að lifandi taugafrumur miðli hamlandi boðum á umliggjandi microglial frumur, og þær virkjist þegar dauðar taugafrumur hætta að senda boðin. Við virkjun tjá þær meira magn bólgumiðla og viðtaka fyrir bólgumiðla. Þær færast í átt að skemmdu eða sýktu svæði og hæfileiki þeirra til áts er aukinn (20). 1.3 Ónæmisviðbrögð við mýlildi innan heilans Áhrif mismunandi formgerða mýlildis á átfrumur Mýlildi getur tekið á sig fleiri en eina mynd og það ber að hafa í huga þegar áhrif þess á frumur eru skoðuð. Rannsóknir á mismunandi formgerðum Aβ mýlildis benda til að stökkbreytingar í próteininu ýti undir fjölliðun þess. Með hækkandi styrk þessara próteina geta þau safnast saman í mismunandi form með krosstengdum β-flötum (1, 21) (mynd 3). Mynd 3. Mismunandi formgerðir mýlildis. Stökkbreyting próteins leiðir til galla í vinnslu þess, próteineiningar laðast frekar saman og mynda fjölliður, krosstengdar gegnum β- fleti. Í nógu háum styrk geta próteinin myndað þráðlaga mýlildi eða óskipulagðar heildir. 8

13 Þegar hafa nokkrar rannsóknar sýnt fram á mismikinn hæfileika þessara formgerða til að virkja átfrumur. Til dæmis virðast átfrumur taka frekar upp Aβ mýlildi ef þær eru meðhöndlaðar með þráðlaga formi þess, á meðan fjölliður (e. oligomers) draga úr áti en auka á seytingu bólgumiðla sem geta reynst skaðlegir umlykjandi starfvef (22-24). Þó er rannsóknum ábótavant hvað varðar áhrif og myndun mismunandi formgerða in vivo. Því ber að gæta að því að notkun mismunandi formgerða mýlildis í tilraunum gæti gefið mismunandi niðurstöður Upptaka og eyðing átfrumna á mýlildi fyrri rannsóknir Í þessari rannsókn voru áhrif mýlildisins cystatin C á átfrumur könnuð. Lítið er um fyrri rannsóknir á þess konar mýlildi þar sem sjúkdómurinn sem það veldur er mjög sjaldgæfur og eins og er er aðeins hægt að einangra mýlildið úr krufðum heilum sjúklinga. Stærstur hluti rannsókna hefur eins og áður sagði verið gerður á Aβ mýlildi. Þeir þættir sem taldir eru valda eituráhrifum mýlildis, t.d. krosstengdir β-fletir, eru þó sameiginlegir með öllu mýlildi (21). Því ættu rannsóknir á Aβ mýlildi að geta veitt vísbendingar um áhrif cystatin C mýlildis og öfugt. Samkvæmt rannsóknum á músamódelum veldur offramleiðsla á Aβ mýlildinu því að virkni microglial frumna og macrophaga innan heilans eykst (25, 26). Einnig er talið að uppsöfnun þess valdi gliðnun á blóð-heila þröskuldinum og monocytar flytjist þannig í heilavef og sérhæfist yfir í macrophaga (27, 28). Þó er ekki ljóst hvort aukin virkni átfrumna dragi úr eða auki á sjúkdóminn. Rannsóknir framkvæmdar in vitro benda til að átfrumur heilans geti tekið upp Aβ mýlildi en ekki eytt því (29, 30). Niðurstöður margra in vivo rannsókna gefa að átfrumur brjóti ekki niður mýlildi en ýti hugsanlega undir myndun þráðlaga myndformsins og drepi taugafrumur með bólgumiðlum sínum (31, 32). Tekið saman bendir þetta til að uppsafnað mýlildi, sem verkar eitrandi á starfvef heilans, kalli á aukinn fjölda virkra átfrumna á skemmt svæði sem geti síðan ekki eytt því og auki enn frekar á sjúkdómsástandið. Ekki er þó alger samrómur um að áhrif átfrumna séu í þessu samhengi aðeins skaðleg. Rannsókn á músalíkani þar sem samansöfnun virkra átfrumna var hindruð í heilanum benti til að uppsöfnun Aβ mýlildis gerist hraðar í fjarvist þeirra (33). Einnig eru vísbendingar um að átfrumum mistakist hugsanlega að skapa nógu súrt umhverfi í leysibólum (e. lysosome) sínum til að niðurbrot eigi sér stað, vegna ónógrar örvunar. Í rannsóknum þar sem aukin súrnun leysibólunnar var hvötuð átti niðurbrot mýlildis sér frekar stað (34, 35). 9

14 In vitro rannsóknir á hæfileikum macrophaga til að brjóta niður Aβ mýlildi gefa til kynna að þeir séu betur búnir til þess konar niðurbrots en microglial frumur (36). Hins vegar virðist þessi hæfileiki ekki vera til staðar hjá virkjuðum monocytum úr blóði Alzheimer s sjúklinga, sem gefur til kynna að niðurbrotsgeta þeirra dvíni þegar mikil Aβ uppsöfnun á sér stað (11). Virkjun macrophaga og microglial frumna er flókið fyrirbæri því virkjunarástand þeirra geta verið mismunandi út frá áreiti. Annars vegar ýta þessar átfrumur undir bólgu með bólgumiðlum eins og TNF-α og IL-6 en þær geta einnig virkjast til að hamla bólgu og hefja örmyndun í skemmdum vef (50). Líklega veldur viðvarandi uppsöfnun mýlildis innan heilans stöðugu viðbragði frá átfrumum í mismunandi virkjunarástandi, en virkjunin ein og sér hefur taugahrörnandi áhrif (13, 51) Áhrif mýlildis á THP-1 frumur THP-1 frumulínan Frumurnar sem notast var við í rannsókninni eiga uppruna sinn í blóði drengs með brátt kyrningahvítblæði (e. acute monocytic leukemia (AML)). Um er að ræða frumur sem líkjast monocytum úr mönnum að miklu leyti og henta því vel sem mennskt monocytamódel (37). Hægt er að sérhæfa frumurnar yfir í macrophaga með phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (38) Þekkt áhrif Aβ mýlildis á THP-1 frumur Aβ mýlildið getur sérhæft THP-1 frumur yfir í macrophaga og verður sérhæfingin mest með mýlildi á millistigi milli fjölliðu- og þráðlaga forms þess (39, 40). Þrátt fyrir að frumurnar verði fyrir myndrænum breytingum og seyti fleiri bólgumiðlum við meðhöndlun með Aβ mýlildi virðist upptaka þeirra á mýlildinu vera takmörkuð. Í tilraun þar sem THP-1 frumum var komið fyrir á uppsöfnuðu mýlildi á heilasýni sýndu frumurnar litla sérhæfingu. Þær eyddu ekki mýlildinu nema að litlu leyti þrátt fyrir að vera sérhæfðar sérstaklega með lipopolysakkaríðum (LPS) og interferon-γ (IFN-γ) (41). Því gætu sérhæfingaráhrif Aβ mýlildis á THP-1 frumur verið takmarkaðar við in vitro rannsóknir og háð samsetningu mýlildisins Fyrri rannsókn á áhrifum cystatin C mýlildis á THP-1 frumur Í rannsóknarverkefni Guðrúnar Jónsdóttur (42) til meistaragráðu voru m.a. áhrif cystatin C mýlildis á THP-1 frumur skoðuð. Mýlildið sem hún notaði var einangrað á sama hátt og gert var fyrir þessa rannsókn og leyst upp í ddh 2 O. Þéttni lausnarinnar var þó meiri en þeirrar sem 10

15 notuð var í þessari rannsókn, eða 200µM miðað við 93µM. Hún kannaði form mýlildisins í lausninni með thioflavin litun og komst að þeirri niðurstöðu að það væri á þráðlaga formi. Niðurstöður Guðrúnar voru að cystatin C mýlildi sérhæfði THP-1 frumum yfir í macrophaga, bæði með aukningu bólgumiðlanna TNF-α og interleukin-6 (IL-6) sem og myndrænum breytingum á frumunum. Einnig mynduðu THP-1 macrophagar holur í því mýlildi sem þeim var sáð á, sem bendir til upptöku og niðurbrots (42). 1.4 Mýlildi og sjálfsát Á síðustu árum hefur mikilli athygli verið beint að sjálfsáti (e. autophagy), því ferli frumunnar sem snýr meðal annars að eyðingu uppsafnaðra próteina, í samhengi við niðurbroti á mýlildi. Talið er að sjálfsátsferillinn geti falið í sér möguleg lyfjamörk í framtíðinni Um sjálfsát Til að fjölfruma lífvera starfi eðlilega er samvægi mikilvægt. Of mikil uppsöfnun próteina eða annarra efna fyrir innan eða utan frumuhimnu skapar ólífvænlegar aðstæður fyrir frumurnar. Til að hafa stjórn á uppsöfnun próteina þurfa þær að geta eytt þeim á skilvirkan hátt. Það gera þær m.a. gegnum sjálfsát en lokastig þess ferils er ávallt niðurbrot próteina og annarra frumulíffæra inni í leysibólum (e. lysosomes). Til eru þrjár gerðir af sjálfsáti; (1) smásjálfsát (e. microautophagy), (2) fylgdarpróteinháð sjálfsát (e. chaperone mediated autophagy) og (3) stórsjálfsát (e. macroautophagy). Í smásjálfsáti tekur leysibólan sjálf upp þætti í umfryminu en lítið er vitað um hlutverk þess. Í fylgdarpróteinháðu sjálfsáti eru aðeins þau prótein sem eru bundin við ákveðin fylgdarprótein eins og heat shock cognate 70 (Hsc-70) tekin upp inn í leysibóluna. Stórsjálfsát einkennist af myndun sjálfsátsblöðru (e. autophagosome) innan frumunnar, en það er flókið net stjórnpróteina sem miðla flutningi og samruna sjálfsátsblöðrunnar við súra leysiblöðruna (43). Flestum rannsóknum á sambandi sjálfsáts við mýlildissjúkdóma er beint að stórsjálfsáti og mun sá ferill vera einfaldlega kallaður sjálfsát það sem eftir er þessarar ritgerðar. Uppruni sjálfsátsbólunnar er ekki þekktur með vissu en gæti mögulega verið úr himnum golgi-kerfisins, grófa frymisnetsins eða hvatbera (44). Í upphafi myndast tvöföld himna, þakin sérstökum sjálfsátspróteinum, en meðal þeirra er próteinið LC3. Himnan myndar smám saman blöðru utan um þau prótein eða frumulíffæri sem ætluð eru til niðurbrots (43) (mynd 4). Áður en sjálfsátsblaðran rennur saman við leysiblöðru getur hún runnið saman við innblöðru (e. endosome). Þetta er mikilvægt skref með tilliti til mýlildisuppsöfnunar því 11

16 þannig geta prótein utan frumunnar sem tekin hafa verið upp með innfrymun (e. endocytosis) gengið inn í sjálfsátsferilinn. Að lokum rennur sjálfsátsblaðran saman við leysiblöðru, sem er meðal annars þakin með próteininu Lamp 2. Súrt umhverfi innan leysiblöðrunnar ásamt öflugum vatnsrofsensímum á að sjá til þess að innihald hennar brotni niður (43). Mynd 4. Sjálfsát. Í sjálfsáti myndast sjálfsátsblaðra utan um prótein eða frumulíffæri til niðurbrots. Próteinin geta verið úr umfrymi frumunnar eða komið frá innblöðru. Próteinið LC3-I, sem finna má óbundið í umfryminu þekur sjálfsátsblöðruna og kallast þá LC3-II. Ytri himna sjálfsátsblöðrunnar rennur saman við himnu leysiblöðru þ.a. innihald þeirra sameinast. Utan á leysiblöðru er próteinið Lamp 2. Hægt er að mótefnalita fyrir LC3 og Lamp 2 próteinunum til að fylgjast með samruna himnanna. Myndin er eftir Guðnýju Ellu Thorlacius. 12

17 1.4.2 Mikilvægi sjálfsáts í mýlildissjúkdómum í heila Rannsóknir á músalíkönum sem offramleiða Aβ mýlildi og fá Alzheimer s líkan sjúkdóm benda til að sjálfsátsferillinn skipti miklu máli í uppsöfnun mýlildisins. Samkvæmt þeim hamlar það framgangi sjúkdómsins þegar hæfni til sjálfsáts er aukin í miðtaugakerfinu að því leyti að magn mýlildis í heilanum minnkar og vitsmunaleg geta músanna eykst (45-47). Sú staðreynd að leysibólur í krufðum heilum bæði Alzheimer s sjúklinga og tilraunadýrum með aukna Aβ uppsöfnun innihalda mikið magn ómelts Aβ styður þessar hugmyndir (48, 49). Uppsöfnuninni fylgir aukin taugahrörnun sem stafar af óstöðugum leysibólum sem miðla oxunarskemmdum (48-50). Bendir þetta til, líkt og hjá átfrumum í heilanum, að ávinningur gæti hlotist af að auka virkni leysibólna í frumum heilans Frumueitrunaráhrif mýlildis tengsl við sjálfsát Frumueitrunaráhrif Aβ mýlildis eru vel þekkt, en það getur knúið m.a. taugafrumur, innþelsfrumur í heilaæðum og chinese hamster ovary (CHO) frumur til að fara í stýrðan frumudauða (51-53). Ástæðan gæti verið offramleiðsla hvatbera á fríum radikölum þegar álag uppsafnaða próteinsins er of mikið (52). Þá er virkni sjálfsáts aukin og mýlildið safnast upp í leysibólum frumna með áðurnefndum afleiðingum (54). Uppleyst cystatin C mýlildi er eitrað sléttvöðvafrumum í styrkleikanum 25 µl og hærra (3). Ekki hefur verið könnuð hneigð átfrumna til að fara í stýrðan frumudauða eftir meðhöndlun með cystatin C mýlildi, og hvort einhver tengsl séu við uppsöfnun þess í leysibólum frumnanna vegna aukins sjálfsáts. 13

18 Markmið rannsóknarinnar Markmið þessarar rannsóknar voru: 1. Að kanna sérhæfingu og upptöku THP-1 átfrumna á cystatin C mýlildi 2. Að kanna hvort THP-1 átfrumur brytu niður cystatin C mýlildi með sjálfsáti 3. Að kanna stýrðan frumudauða hjá THP-1 átfrumum á cystatin C mýlildi 14

19 2 Efniviður og aðferðir 2.1 Cystatin C mýlildi Einangrun mýlildis Mýlildið var fengið úr heilum látinna sjúklinga með arfgenga íslenska heilablæðingu. Það var einangrað með viðurkenndum hætti (55) af Indíönu Elínu Ingólfsdóttur, auk þess sem hún raðgreindi og massagreindi próteinið. Fyrir tilraunir mýlildið leyst upp í ddh 2 O í styrkleikanum 1,25 mg/ml eða 93 µm. Eftir það var hluti lausnarinnar flúrmerktur. Mýlildið var geymt við 4 C Flúrmerking mýlildis og BSA Til flúrmerkingar á cystatin C mýlildinu var notast við Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit. 100 µl af lausninni voru blandaðir við 10 µl af 1M NaHCO 3. Svo var 4 µl af 11,3 nmól/µl Alexa 488 flúrlit bætt út í lausnina. Litnum var leyft að bindast við mýlildið í 15 mínútur við stofuhita. Til að skola þann lit úr lausninni sem bast ekki við cystatin C var lausninni bætt á resin perlur og spunnið niður gegnum filter í 1 mínútu við g. Til að meta bindingu litsins var 1 µl dropi settur á smásjárgler, auk samsvarandi dropa af ómerktri cystatin C lausn. Merkti dropinn flúrljómaði greinilega meira við smásjárskoðun, en virtist innihalda leifar af resin geli eftir skolunina. Því var merkta lausnin spunnin niður aftur í 1 mínútu við g. Eftir það var flúrljómandi mýlildi úr þeirri lausn notað. Samsvarandi próteinflúrmerking var gerð á bovine serum albumin (BSA) próteinlausn, en sú lausn var 1 mg/ml og því gáfu reikningar í verkferilslýsingu að 2 µl skyldir settir af lit út í 50 µl af lausn Mýlildi sett á ræktunargler Flúrmerktu og ómerktu cystatin C mýlildi var komið fyrir í 1 µl dropum á nokkur 8 klefa ræktunargler frá BD Falcon. Hver klefi innihélt því einn dropa og var 0,7 cm 2 að flatarmáli. 2.2 THP-1 frumur Frumurækt Frumurnar voru fengnar frá Ólafi E. Sigurjónssyni í Blóðbankanum, Landspítala háskólasjúkrahúsi. Þeim var viðhaldið í ræktunarskáp í RPMI 1640 æti með 10% fetal bovine 15

20 serum (FBS), 100 µg/ml streptomycin og 100 U/ml penicillin. Þær voru ræktaðar í 25 cm 2 ræktunarflöskun frá BD Falcon og þeim skipt tvisvar í viku. Við skiptingu voru þær spunnar niður í 10 mínútur við 1200 RPM og æti bætt við þannig að þéttnin yrði um 2,5x10 5 frumur/ml. Þær voru taldar í trypan blue lit með Countess frumutalningarvél fyrir og eftir skiptingu Frumur settar á ræktunargler Frumurnar voru settar á 8 klefa ræktunargler, ýmist í klefa með mýlildi eða án þess. Þéttni þeirra í tilrauninni var 5,0x10 5 frumur/ml. Þær voru hafðar á glerjunum í ræktunarskáp í RPMI 1640 æti með 2% FBS, 100 µg/ml streptomycin og 100 U/ml penicillin Sérhæfing frumna Notast var við PMA til að sérhæfa THP-1 monocytunum yfir í macrophaga. Notast var við styrk 25ng/ml. 2.3 Fixering og mótefnalitun Áður en frumur voru mótefnalitaðar voru þær fixeraðar samkvæmt verkferlunum hér að neðan. Þegar mýlildið var mótefnalitað eitt og sér voru aðeins framkvæmd skref Frumur þvegnar 2-3x með phosphate buffer saline (PBS). Þetta var endurtekið eftir hvert skref. 2. Hafðar í 100% ísköldu metanóli við -20 C í 10 mínútur 3. Blokkaðar í blokkbuffer (1xPBS / 5% normal goat serum (NGS) / 0,3% Triton X-100) í 60 mínútur við stofuhita. 4. Settar í frummótefnabuffer (1xPBS / 1% bovine serum albumin (BSA) / 0,3% Triton X-100 / frummótefni í mismiklum styrk*) í 120 mínútur við stofuhita. *Um mótefni gegn próteinum og styrk þeirra Gegn cystatin C Gegn lamp 2 Gegn LC3 Gegn virkjuðum caspasa-3 anti-cystatin C anti-lamp 2 anti-lc3a/b anti-cleaved caspase-3 Millipore : # DSHB: H4B4-c Cell Signaling : #4108S Cell Signaling : #9661S styrkur: 1/1000 styrkur: 1/500 styrkur: 1/1000 styrkur: 1/500 16

21 5. Settar í lausn með flúrljómandi seinna mótefni (1xPBS / 0,1% seinna mótefni) í 60 mínútur í myrkri við stofuhita. 6. Gler þvegin í síðasta skipti með PBS og leyft að þorna í myrkri. 7. Fluoromount sett á glerin og þekjugler yfir. Þekjuglerið fest á með glæru naglalakki. 2.4 Myndgreining Ljóssmásjárgreining Ljóssmásjá gerir kleift að sjá myndrænar breytingar og breytingar í fjölda frumna. Hins vegar nemur hún ekki flúrljómun sérstaklega. Notast var við Leica DMI3000 B smásjá Flúrsmásjárgreining Flúrsmásjá nemur flúrmerkt mýlildi og því var meðal annars hægt að fylgjast með hvort það var tekið upp í frumurnar meðan þær var lifandi og hvort magn þess minnkaði. Notast var við Leica DMI3000B smásjá Confocal smásjárgreining Confocal smásjá getur numið flúrljós af mismunandi bylgjulengdum og þannig gert kleift að skoða rautt, grænt og blátt ljós. Notast var við smásjána Zeiss LSM 5 Pascal og myndir voru teknar og skoðaðar með Zeiss LSM Image Examiner. 3 Niðurstöður 3.1 Sérhæfing THP-1 monocyta yfir í macrophaga Fylgst var með myndrænum breytingum THP-1 frumnanna eftir að bætt hafði verið PMA út í ætið. Frumurnar flöttust út og mátti greinilega sjá sumar mynda anga. Þær voru óreglulegar og stærri en kringlóttu monocytarnir (mynd 5). 17

22 Mynd 5. Ósérhæfðir THP-1 monocytar (til vinstri) og THP-1 macrophagar, eftir sérhæfingu með PMA (til hægri). Macrophagarnir eru greinilega útflattari og óreglulegri. Myndir teknar með 40x linsu. 3.2 Flúrmerking mýlildis Eftir próteinflúrmerkingu flúrljómuðu bæði BSA og mýlildið í smásjá við bylgjulengdina 488 nm. Við mótefnalitun fyrir cystatin C á bæði ómerktu og flúrmerktu mýlildi reyndist hið flúrmerkta neikvætt fyrir cystatin C mótefnalitun (mynd 6B). Hins vegar reyndist ómerkta mýlildið jákvætt (mynd 6A). Mögulega kom flúrmerkingin í veg fyrir að cystatin C mótefnið gæti bundist við mýlildið. Þegar gerð var Bradford mæling þar sem BSA var notað sem stuðull mældist styrkleiki bæði ómerktu og flúrmerktu mýlildislausnarinnar mikið lægri en búist hefði mátt við (tafla 1). Þar sem fyrirfram þekktur styrkur á ómerkta mýlildinu var 1,25 mg/ml, en styrkur í mælingunni var 0,25 mg/ml er líklegt að Bradford liturinn hafi ekki bundist jafn vel við mýlildið og hann gerði við BSA próteinið. 18

23 A B Mynd 6. Cystatin C mótefnalitun á A) ómerktri mýlildisdoppu og B) flúrmerktri mýlildisdoppu. Cystatin C er rautt (vinstri) en flúrmerkt prótein er grænt (hægri). Cystatin C mótefnið bast nánast ekkert við flúrmerkta mýlildið miðað við hið ómerkta. Myndir teknar með confocal smásjá. Bradford próteinmæling á flúrmerktri og óflúrmerktri mýlildislausn Ljósgildi BSA Styrkur BSA (staðall) Ljósgildi mýlildis Styrkur mýlildis 0,154 0,0 mg/ml Flúrmerkt: 0,164 0,02 mg/ml 0,174 0,25 mg/ml Ómerkt: 0,189 0,25 mg/ml 0,240 0,5 mg/ml 0,273 1,0 mg/ml 0,369 2,0 mg/ml Tafla1. Bradford próteinmæling á flúrmerktu og óflúrmerktu mýlildi. Samkvæmt þekktum BSA próteinstaðli. Samkvæmt þessum gildum er mun lægri styrkur í bæði ómerktu og flúrmerktu mýlildislausninni. 19

24 3.3 THP-1 macrophagar taka upp flúrmerkt prótein (BSA) THP-1 átfrumurnar voru færar um að taka upp BSA sem hafði verið flúrmerkt með áðurnefndri aðferð (mynd 7). Því var mýlildi flúrmerkt á sama hátt og fylgst með upptöku. Dagur 1 20x Dagur 3 20x Mynd 7. THP-1 macrophagar á flúrljómandi BSA eftir 24 klst (vinstri) og 72 klst (hægri). Eftir þrjá daga eru frumurnar greinilega byrjaðar að taka upp flúrmerkt prótein. Frumum var sérhæft með 25ng/ml PMA. Stækkunar mynda getið í neðra hægra horni. 3.4 THP-1 macrophagar taka upp flúrmerkt cystatin C mýlildi Þegar THP-1 frumurnar voru sérhæfðar yfir í virkjaða macrophaga með 25 ng/ml PMA tóku þær greinilega upp mýlildið (mynd 8). Fjórum dögum eftir að þeim var sáð á mýlildisdoppuna voru farnar að myndast holur í mýlildið í kring um frumurnar. Á degi 6 voru sums staðar greinilega glopur í mýlildinu þar sem voru þyrpingar af macrophögum. Það gæti bent til þess að frumurnar hafi ekki aðeins tekið mýlildið upp heldur einnig eytt því. 20

25 Dagur 1 20x Dagur 3 20x Dagur 4 20x Dagur 6 10x Mynd 8. THP-1 macrophagar á flúrljómandi cystatin C mýlildi. Frumurnar taka greinilega upp mýlildið og eftir 6 daga hafa myndast glopur í návist við frumuþyrpingar. Frumum var sérhæft með 25 ng/ml PMA. Stækkunar mynda getið í neðra hægra horni. 3.5 Cystatin C mýlildi sérhæfði ekki THP-1 monocyta yfir í virkjaða macrophaga Í þessari rannsókn sérhæfðust THP-1 monocytar ekki yfir í macrophaga við það eitt að vera sáð á cystatin C mýlildi, hvort sem það var flúrmerkt eða ómerkt (mynd 9). Ekki var að sjá neinar myndrænar breytingar á monocytunum, en þeir voru að mestu kringlóttir. Með tímanum fjölguðu monocytarnir sér greinilega og mynduðu þéttar þyrpingar. Upptaka monocytanna á flúrmerktu mýlildi var einnig minni en macrophaganna í

26 Dagur 4 20x Dagur 4 20x Mynd 9. Ósérhæfðir THP-1 monocytar á ómerktu cystatin C mýlildi (til vinstri) og flúrmerktu mýlildi (til hægri). Frumurnar hafa verið á mýlildinu í fjóra daga. Monocytarnir virðast ekki sérhæfast, og fjölga sér. Þeir taka flúrmerkta mýlildið upp í minna mæli en þeir sem voru sérhæfðir með PMA. Stækkunar myndanna er getið í neðra hægra horni. 3.6 THP-1 macrophagar á cystatin C mýlildi tjá frekar sjálfsátspróteinin LC3 og Lamp 2 Frumum sem hafði verið sáð á cystatin C mýlildi og voru sérhæfðar með PMA voru fixeraðar og mótefnalitaðar fyrir LC3 og Lamp 2. Frumurnar höfðu verið í 4 daga á mýlildinu. Tjáning próteinanna var sjáanlega meiri miðað við samanburðarfrumur sem höfðu ekki verið á mýlildi (mynd 10). Hins vegar var sama staðsetning á próteinunum (e. colocalization) en það hefði komið fram sem hefði komið fram í gulum lit á myndunum. Leysibólurnar (Lamp 2) virðast afmarka sig innan frumnanna frekar en sjálfsátsbólurnar (LC3) sem eru dreifðari í umfryminu. 22

27 Mynd 10. Tjáning LC3 (rautt) og Lamp 2 (grænt) hjá THP-1 macrophaga án cystatin C mýlildis (efri) og með mýlildi (neðri). Merkið er sterkara hjá frumum á mýlildi sem bendir til meiri tjáningar próteinanna. Hins vegar staðsetja sjálfsátsbólur og leysibólur sig ekki saman. 23

28 3.7 Ekki var munur í tjáningu sjálfsátspróteinsins LC3 á flúrmerktu mýlildi Þegar frumum var komið fyrir á flúrmerktu mýlildi í stað ómerkts (sjá 3.6), var tjáningin á sjálfsátspróteininu LC3 ekki meiri en í frumum án mýlildis (mynd 11). Ennfremur virtist mýlildið ekki vera staðsett sérstaklega innan sjálfsátsbólna. Þessar niðurstöður stangast við niðurstöður úr 3.6. a) 40x b) 40x c) 40x Mynd 11. a) LC3 (rautt) tjáning THP-1 macrophaga á flúrmerktu mýlildi (grænt) lengst til vinstri. b) Í miðjunni er LC3 tjáning macrophaga á flúrljómandi mýlildi án merkis frá mýlildinu. c)lengst til hægri er LC3 tjáning macrophaga sem hafa ekki verið á mýlildi. 3.8 Ekki var munur í caspasa-3 tjáningu THP-1 átfrumna á flúrmerktu mýlildi Kannað var hvort frumur sem tækju upp cystatin C mýlildi hefðu hneigð til að fara í stýrðan frumudauða (e. apoptosis) með mótefnalitun fyrir virkjuðum caspasa-3. Ekki sást munur milli THP-1 macrophaga á flúrmerktu cystatin C mýlildi og macrophaga sem ekki voru á mýlildi. (mynd 12). 40x 40x Mynd 12. Tjáning caspasa-3 (rautt) hjá THP-1 macrophögum á flúrmerktu mýlildi (til vinstri) og án mýlildis (til hægri). Ekki er afgerandi munur á caspasa-3 tjáningu þessara tveggja hópa. 24

29 4 Ályktanir THP-1 monocytar sérhæfðust yfir í macrophaga þegar þeir voru meðhöndlaðir með PMA eins og við var að búast. Hins vegar átti það ekki við THP-1 monocyta sem var sáð á cystatin C mýlildi án meðhöndlunar með PMA, sem stangast á við fyrri rannsóknir Guðrúnar Jónsdóttur. Í þessari rannsókn tóku THP-1 macrophagar upp cystatin C mýlildi og virtust eyða því, hugsanlega gegnum sjálfsát. Hins vegar er þörf á að endurtaka tilraunina til að fylgjast betur með örlögum flúrmerkts mýlildis í lifandi frumum, t.d. með LysoTracker, sem merkir leysiblöðrur en þá væri hægt að greina þær í umfryminu ásamt flúrljómandi mýlildi. Í mótefnalitun fyrir sjálfsátspróteinunum LC3 og Lamp2 hjá THP-1 macrophögum á ómerktu mýlildi sást meiri tjáning umrædda próteina. Það bendir til að sjálfsátsferillinn sé meira virkjaður í frumum sem eru að taka upp cystatin C mýlildið, en ekki liggja nægar upplýsingar fyrir til að sanna niðurbrot þess með þessum ferli. Hugsanlega hafði próteinflúrmerking á mýlildislausninni áhrif á eiginleika hennar, og bentu mótefnalitun fyrir cystatin C og Bradford próteinmæling til að magn mýlildis í lausninni væri mun minna en fyrir flúrmerkingu. Hugsanlegt er þó að flúrmerking mýlildisins hafi hindrað bindingu mótefna og Coomassie Blue litarins. Þegar mótefnalitað var fyrir LC3 hjá THP-1 macrophögum á flúrmerktu mýlildi var ekki að sjá aukna tjáningu miðað við frumur án mýlildis. Þetta er í ósamræmi við fyrri niðurstöður þar sem mótefnalitað var fyrir LC3 hjá frumum á ómerktu mýlildi. Hugsanlega tengist þetta breytingum sem orðið hafa við flúrmerkingum mýlildisins, þ.e. að flúrmerkingin hafi haft hindrandi áhrif á sjálfsátssvörun frumnanna. Mótefnalitað var gegn virkjuðum caspasa-3 í þeim tilgangi að meta stýrðan frumudauða átfrumna á flúrmerktu mýlildi miðað við eins frumur án mýlildis. Við sjónrænt mat sást ekki munur milli þessara tveggja hópa frumna, sem bendir ekki til að flúrmerkt cystatin C mýlildi knýji frumur til að fara í stýrðan frumudauða. Þó þyrfti að endurtaka þessa mótefnalitun hjá frumum á ómerktu mýlildi. 25

30 5 Umræða 5.1 Sérhæfing átfrumna og upptaka þeirra á mýlildi Í þessari rannsókn sérhæfði uppleyst cystatin C mýlildi ekki THP-1 frumur yfir í macrophaga eitt og sér, þrátt fyrir að það hafi gerst í sambærilegri rannsókn Guðrúnar Jónsdóttur (42). Þó að mýlildið hafi verið einangrað og leyst upp á sama hátt hefur hugsanlega verið munur á formi mýlildisins sem olli þessu. Samkvæmt fyrri rannsóknum getur mýlildið Aβ á formi fjölliða sérhæft THP-1 frumur yfir í macrophaga (39). Ekki gerðist það sama í annarri rannsókn þegar THP-1 monocytum var sáð beint á Aβ mýlildi í krufðum heila Alzheimer s sjúklings (41). Í síðara tilvikinu er líklegt að mýlildið hafi verið af mörgum mismunandi formgerðum en ekki aðeins fjölliður. Þessi munur gefur að ákjósanlegt hefði verið að skilgreina betur á hvaða formi mýlildið sem notað var í rannsókninni. Ekki er ljóst hvaða áhrif mýlildisuppsöfnun í heila hefur á átfrumur í kring. Rannsóknir bæði in vivo og in vitro gefa til kynna að átfrumur séu færar um að taka upp Aβ mýlildi en niðurbrot þess sé mjög takmarkað og frumurnar sjálfar auki á sjúkdómsástand mýlildissjúkdóma í heila (29-32). Í þessari rannsókn tóku THP-1 macrophagar upp flúrmerkt cystatin C mýlildi og virtust eyða því. Þetta er í samræmi við rannsókn Guðrúnar (42). Hins vegar er þörf á að endurtaka tilraunina til að fylgjast betur með örlögum flúrmerkts mýlildis í lifandi frumum, t.d. með því að merkja leysibólur. Einnig væri ákjósanlegt að endurtaka tilraunina með átfrumum úr blóði sjúklinga með arfgenga íslenska heilablæðingu. 5.2 Þáttur sjálfsáts í niðurbroti mýlildis Vísbendingar eru um að átfrumur Alzheimer s sjúklinga hafa mjög takmarkaða hæfni til losa heilavef við uppsafnað mýlildi og hið sama gæti gilt fyrir sjúklinga með aðra mýlildissjúkdóma í heila. Því er ljóst að samanlögð áhrif mýlildisins og átfrumna gætu verið meginvaldur meingerðar sjúkdómsins (12, 26). Helstu hugmyndir um lyfjamörk snúast annars vegar um að auka átgetu frumna í miðtaugakerfinu eða á hinn bóginn draga úr virkjun þeirra (14). Svarið gæti legið í virkni leysibóla bæði hjá átfrumum og taugafrumum innan heilans. Sífellt bætast við vísbendingar um vanvirkni leysibóla og sjálfsátsferilsins í uppsöfnun Aβ mýlildisins (45-47). Þegar sýrustig leysibóla lækkar leiðir það til aukins niðurbrots mýlildis (34). Í þessari rannsókn voru próteinin LC3, sem finnst utan á sjálfsátsbólum, og Lamp 2, sem finnst utan á leysibólum, tjáð í meiri mæli hjá macrophögum á cystatin C mýlildi. Þetta bendir 26

31 til að sjálfsátsferlið sé virkjað hjá átfrumum sem taka upp cystatin C mýlildi, en ekki var ljóst með mótefnalitun einni og sér hvort fullkomið niðurbrot ætti sér stað á þann hátt. Þrátt fyrir að ekki hafi verið munur á tjáningu virkjaðs caspasa-3 hjá macrophögum á flúrmerktu mýlildi miðað við frumur án mýlildis, hefði verið ákjósanlegt að framkvæma mótefnalitunina aftur á ómerktu mýlildi. Þó virðist aðferðin, mögulega vegna mótefnisins, ekki hafa heppnast því viðmiðunarfrumur sýndu merki um virkjaðan caspasa, sem ekki er eðlilegt. Þess má geta að tilraunir til að meta stýrðan frumudauða með Annexin V og PI gáfu heldur ekki góða raun. Þar sem sást meiri tjáning sjálfsátspróteina hjá macrophögum á ómerktu mýlildi er forvitnilegt að vita hvort þær fari frekar í stýrðan frumudauða vegna t.d. oxunarálags með tilfallandi frjálsum radikölum. 5.3 Próteinflúrmerking á mýlildi Þar sem cystatin C mótefnalitun og Bradford próteinmæling bentu báðar til að styrkur mýlildis í flúrmerktu lausninni væri mjög lágur er erfitt að segja til um gildi niðurstaðna þar sem hún var notuð. Þó ber að geta að hugsanleg ástæða þess er að bindiset próteina sem bundin eru flúrljómandi sameindum af þessu tagi gætu verið hindruð og því aðgengi cystatin C mótefnisins og Coomassie Blue litarins í Bradford mælingunni takmarkað. Einnig skal tekið fram að styrkur ómerkts mýlildis mældist mun lægri í Bradford próteinmælingunni en talið var að raunstyrkur væri. Því er hugsanlegt að liturinn hafi bundist BSA próteininu meira en mýlildinu. Mikilvægt er í framhaldstilraunum að merkja einungis hluta efnisins eða að tryggja að próteinin séu merkt sem minnst. 5.4 Lokaorð Uppsöfnun mýlildis innan heilaæða er ekki óalgeng heldur er hún til staðar í meirihluta fólks yfir 70 ára aldri. Afleiðingar hennar telja vitglöp og heilablæðingar sem reynast vestrænu samfélagi dýrt heilbrigðisvandamál. Erfitt er að greina sjúkdóminn út frá nokkru öðru en einkennum, sem oft eru talin eðlileg fyrir aldrað fólk. Því fer greining oftast ekki fram fyrr en við krufningu (2, 5). Meðferð við mýlildissjúkdómum í heila er mjög takmörkuð. Þrátt fyrir fjölda rannsókna er enn vafamál hvernig uppsöfnunin á sér nákvæmlega stað, að hluta til vegna óvissu um starfsemi ósértæka ónæmiskerfisins í miðtaugakerfinu, en mikilvægt er að auka þekkingu á aðkomandi þáttum til að finna möguleg lyfjamörk eða lækningarleiðir. 27

32 Þakkir Ég vil þakka leiðbeinandanum mínum Dr. Pétri Henry Petersen fyrir leiðsögn og stuðning í verkefninu og ómetanlega hjálpsemi í vinnuferlinu. Einnig vil ég þakka Indíönu Ingólfsdóttur fyrir að einangra cystatin C mýlildið fyrir mig, og Blóðbankanum fyrir THP-1 frumurnar. Að lokum vil ég þakka Guðnýju Ellu Thorlacius, Steinunni Guðmundsdóttur, Agli E. Hákonarsyni, Stefáni Árna Hafsteinssyni og öðrum á Lífvísindasetri Háskóla Íslands á Læknagarði fyrir þá aðstoð sem þau veittu mér. 28

33 Heimildaskrá 1. Herczenik E, Gebbink MF. Molecular and cellular aspects of protein misfolding and disease. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2008;22(7): Epub 2008/02/ Mehndiratta P, Manjila S, Ostergard T, Eisele S, Cohen ML, Sila C, et al. Cerebral amyloid angiopathy-associated intracerebral hemorrhage: pathology and management. Neurosurgical focus. 2012;32(4):E7. Epub 2012/04/ Vilhjalmsson DT, Blondal H, Thormodsson FR. Solubilized cystatin C amyloid is cytotoxic to cultured human cerebrovascular smooth muscle cells. Experimental and molecular pathology. 2007;83(3): Epub 2007/10/ Kawai M, Kalaria RN, Cras P, Siedlak SL, Velasco ME, Shelton ER, et al. Degeneration of vascular muscle cells in cerebral amyloid angiopathy of Alzheimer disease. Brain research. 1993;623(1): Epub 1993/09/ Attems J, Lauda F, Jellinger KA. Unexpectedly low prevalence of intracerebral hemorrhages in sporadic cerebral amyloid angiopathy: an autopsy study. Journal of neurology. 2008;255(1):70-6. Epub 2008/01/ Hirohata M, Yoshita M, Ishida C, Ikeda SI, Tamaoka A, Kuzuhara S, et al. Clinical features of non-hypertensive lobar intracerebral hemorrhage related to cerebral amyloid angiopathy. European journal of neurology : the official journal of the European Federation of Neurological Societies. 2010;17(6): Epub 2010/02/ Haass C, Hung AY, Selkoe DJ, Teplow DB. Mutations associated with a locus for familial Alzheimer's disease result in alternative processing of amyloid beta-protein precursor. The Journal of biological chemistry. 1994;269(26): Epub 1994/07/ Bornebroek M, De Jonghe C, Haan J, Kumar-Singh S, Younkin S, Roos R, et al. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Dutch type (AbetaPP 693): decreased plasma amyloid-beta 42 concentration. Neurobiology of disease. 2003;14(3): Epub 2003/12/ Palsdottir A, Snorradottir AO, Thorsteinsson L. Hereditary cystatin C amyloid angiopathy: genetic, clinical, and pathological aspects. Brain pathology (Zurich, Switzerland). 2006;16(1):55-9. Epub 2006/04/ Palsdottir A, Helgason A, Palsson S, Bjornsson HT, Bragason BT, Gretarsdottir S, et al. A drastic reduction in the life span of cystatin C L68Q carriers due to life-style changes during the last two centuries. PLoS genetics. 2008;4(6):e Epub 2008/06/ Fiala M, Lin J, Ringman J, Kermani-Arab V, Tsao G, Patel A, et al. Ineffective phagocytosis of amyloid-beta by macrophages of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 2005;7(3):221-32; discussion Epub 2005/07/ Hickman SE, Allison EK, El Khoury J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2008;28(33): Epub 2008/08/ Jimenez S, Baglietto-Vargas D, Caballero C, Moreno-Gonzalez I, Torres M, Sanchez-Varo R, et al. Inflammatory response in the hippocampus of PS1M146L/APP751SL mouse model of Alzheimer's disease: age-dependent switch in the microglial phenotype from alternative to classic. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2008;28(45): Epub 2008/11/ Wyss-Coray T, Mucke L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 2002;35(3): Epub 2002/08/ Murphy K, Travers P, Walport M, Janeway C. Janeway's immunobiology. New York: Garland Science; Gordon S, Taylor PR. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 2005;5(12): D'Mello C, Le T, Swain MG. Cerebral microglia recruit monocytes into the brain in response to tumor necrosis factoralpha signaling during peripheral organ inflammation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2009;29(7): Epub 2009/02/ Parkhurst CN, Gan WB. Microglia dynamics and function in the CNS. Current opinion in neurobiology. 2010;20(5): Epub 2010/08/14. 29

34 19. Ginhoux F, Greter M, Leboeuf M, Nandi S, See P, Gokhan S, et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science (New York, NY). 2010;330(6005): Epub 2010/10/ Cho BP, Song DY, Sugama S, Shin DH, Shimizu Y, Kim SS, et al. Pathological dynamics of activated microglia following medial forebrain bundle transection. Glia. 2006;53(1): Epub 2005/10/ Fandrich M. Oligomeric Intermediates in Amyloid Formation: Structure Determination and Mechanisms of Toxicity. Journal of molecular biology Epub 2012/01/ Pan XD, Zhu YG, Lin N, Zhang J, Ye QY, Huang HP, et al. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid is attenuated by oligomeric beta-amyloid: implications for Alzheimer's disease. Molecular neurodegeneration. 2011;6:45. Epub 2011/07/ Michelucci A, Heurtaux T, Grandbarbe L, Morga E, Heuschling P. Characterization of the microglial phenotype under specific pro-inflammatory and anti-inflammatory conditions: Effects of oligomeric and fibrillar amyloid-beta. Journal of neuroimmunology. 2009;210(1-2):3-12. Epub 2009/03/ Yamamoto M, Kiyota T, Walsh SM, Liu J, Kipnis J, Ikezu T. Cytokine-mediated inhibition of fibrillar amyloid-beta peptide degradation by human mononuclear phagocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2008;181(6): Epub 2008/09/ Dhawan G, Floden AM, Combs CK. Amyloid-beta oligomers stimulate microglia through a tyrosine kinase dependent mechanism. Neurobiology of aging Epub 2011/12/ Morgan D, Gordon MN, Tan J, Wilcock D, Rojiani AM. Dynamic complexity of the microglial activation response in transgenic models of amyloid deposition: implications for Alzheimer therapeutics. Journal of neuropathology and experimental neurology. 2005;64(9): Epub 2005/09/ Fiala M, Zhang L, Gan X, Sherry B, Taub D, Graves MC, et al. Amyloid-beta induces chemokine secretion and monocyte migration across a human blood--brain barrier model. Molecular medicine (Cambridge, Mass). 1998;4(7): Epub 1998/08/ Humpel C. Basolateral aggregated rat amyloidbeta(1-42) potentiates transmigration of primary rat monocytes through a rat blood-brain barrier. Current neurovascular research. 2008;5(3): Epub 2008/08/ Frackowiak J, Wisniewski HM, Wegiel J, Merz GS, Iqbal K, Wang KC. Ultrastructure of the microglia that phagocytose amyloid and the microglia that produce beta-amyloid fibrils. Acta neuropathologica. 1992;84(3): Epub 1992/01/ Chung H, Brazil MI, Soe TT, Maxfield FR. Uptake, degradation, and release of fibrillar and soluble forms of Alzheimer's amyloid beta-peptide by microglial cells. The Journal of biological chemistry. 1999;274(45): Epub 1999/11/ Wegiel J, Wang KC, Tarnawski M, Lach B. Microglia cells are the driving force in fibrillar plaque formation, whereas astrocytes are a leading factor in plague degradation. Acta neuropathologica. 2000;100(4): Epub 2000/09/ Wegiel J, Wang KC, Imaki H, Rubenstein R, Wronska A, Osuchowski M, et al. The role of microglial cells and astrocytes in fibrillar plaque evolution in transgenic APP(SW) mice. Neurobiology of aging. 2001;22(1): Epub 2001/02/ El Khoury J, Toft M, Hickman SE, Means TK, Terada K, Geula C, et al. Ccr2 deficiency impairs microglial accumulation and accelerates progression of Alzheimer-like disease. Nature medicine. 2007;13(4): Epub 2007/03/ Majumdar A, Cruz D, Asamoah N, Buxbaum A, Sohar I, Lobel P, et al. Activation of microglia acidifies lysosomes and leads to degradation of Alzheimer amyloid fibrils. Molecular biology of the cell. 2007;18(4): Epub 2007/02/ Majumdar A, Capetillo-Zarate E, Cruz D, Gouras GK, Maxfield FR. Degradation of Alzheimer's amyloid fibrils by microglia requires delivery of ClC-7 to lysosomes. Molecular biology of the cell. 2011;22(10): Epub 2011/03/ Majumdar A, Chung H, Dolios G, Wang R, Asamoah N, Lobel P, et al. Degradation of fibrillar forms of Alzheimer's amyloid beta-peptide by macrophages. Neurobiology of aging. 2008;29(5): Epub 2007/01/ Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, Kobayashi Y, Konno T, Tada K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 1980;26(2): Epub 1980/08/01. 30

35 38. Tsuchiya S, Kobayashi Y, Goto Y, Okumura H, Nakae S, Konno T, et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer research. 1982;42(4): Epub 1982/04/ Crouse NR, Ajit D, Udan ML, Nichols MR. Oligomeric amyloid-beta(1-42) induces THP-1 human monocyte adhesion and maturation. Brain research. 2009;1254: Epub 2008/12/ Ajit D, Udan ML, Paranjape G, Nichols MR. Amyloid-beta(1-42) fibrillar precursors are optimal for inducing tumor necrosis factor-alpha production in the THP-1 human monocytic cell line. Biochemistry. 2009;48(38): Epub 2009/08/ Hashioka S, Miklossy J, Schwab C, Klegeris A, McGeer PL. Adhesion of exogenous human microglia and THP-1 cells to amyloid plaques of postmortem Alzheimer's disease brain. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 2008;14(3): Epub 2008/07/ Jónsdóttir G. Áhrif cystatin C mýlildis og T-Chos á THP-1 frumur. Ritgerð til MA-prófs. 2011;Heilbrigðisvísindasvið Háskóla Íslands. 43. Yang Z, Klionsky DJ. Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation. Current opinion in cell biology. 2010;22(2): Epub 2009/12/ Tooze SA, Yoshimori T. The origin of the autophagosomal membrane. Nature cell biology. 2010;12(9): Epub 2010/09/ Pickford F, Masliah E, Britschgi M, Lucin K, Narasimhan R, Jaeger PA, et al. The autophagyrelated protein beclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid beta accumulation in mice. The Journal of clinical investigation. 2008;118(6): Epub 2008/05/ Yang DS, Stavrides P, Mohan PS, Kaushik S, Kumar A, Ohno M, et al. Reversal of autophagy dysfunction in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease ameliorates amyloid pathologies and memory deficits. Brain : a journal of neurology. 2011;134(Pt 1): Epub 2010/12/ Yang DS, Stavrides P, Mohan PS, Kaushik S, Kumar A, Ohno M, et al. Therapeutic effects of remediating autophagy failure in a mouse model of Alzheimer disease by enhancing lysosomal proteolysis. Autophagy. 2011;7(7): Epub 2011/04/ Abramowski D, Rabe S, Upadhaya AR, Reichwald J, Danner S, Staab D, et al. Transgenic expression of intraneuronal Abeta42 but not Abeta40 leads to cellular Abeta lesions, degeneration, and functional impairment without typical Alzheimer's disease pathology. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2012;32(4): Epub 2012/01/ De Kimpe L, van Haastert ES, Kaminari A, Zwart R, Rutjes H, Hoozemans JJ, et al. Intracellular accumulation of aggregated pyroglutamate amyloid beta: convergence of aging and Abeta pathology at the lysosome. Age (Dordrecht, Netherlands) Epub 2012/04/ Zheng L, Terman A, Hallbeck M, Dehvari N, Cowburn RF, Benedikz E, et al. Macroautophagygenerated increase of lysosomal amyloid beta-protein mediates oxidant-induced apoptosis of cultured neuroblastoma cells. Autophagy. 2011;7(12): Epub 2011/11/ Folin M, Baiguera S, Fioravanzo L, Conconi MT, Grandi C, Nussdorfer GG, et al. Caspase-8 activation and oxidative stress are involved in the cytotoxic effect of beta-amyloid on rat brain microvascular endothelial cells. International journal of molecular medicine. 2006;17(3): Epub 2006/02/ Bartley MG, Marquardt K, Kirchhof D, Wilkins HM, Patterson D, Linseman DA. Overexpression of amyloid-beta protein precursor induces mitochondrial oxidative stress and activates the intrinsic apoptotic cascade. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 2012;28(4): Epub 2011/12/ Jarvis K, Assis-Nascimento P, Mudd LM, Montague JR. Beta-amyloid toxicity and reversal in embryonic rat septal neurons. Neuroscience letters. 2007;423(3): Epub 2007/08/ Zheng L, Kagedal K, Dehvari N, Benedikz E, Cowburn R, Marcusson J, et al. Oxidative stress induces macroautophagy of amyloid beta-protein and ensuing apoptosis. Free radical biology & medicine. 2009;46(3): Epub 2008/11/ Vilhjalmsson DT, Ingolfsdottir IE, Thormodsson FR. Isolation of amyloid by solubilization in water. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2012;849: Epub 2012/04/25. 31