UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Institut za prehrambenu tehnologiju i biohemiju

Transcription

1 Relativna obilnost Relativna obilnost UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Institut za prehrambenu tehnologiju i biohemiju Vesna V. Antić Mališa P. Antić Komunalna otpadna voda, Ahen, Nemačka Piroliza Interni standard NVP NVP Industrijska otpadna voda, Pančevo, Srbija m/z Vreme, min. Beograd, 2014.

2 Odlukom Odbora za izdavačku delatnost Poljoprivrednog fakulteta u Zemunu, br. 45-II-2/4 od godine, odobreno je izdavanje udžbenika Hromatografija u analizi hrane I izdanje. Autori Dr Vesna Antić i Dr Mališa Antić HROMATOGRAFIJA U ANALIZI HRANE I izdanje Recenzenti: Dr Biljana Vucelić-Radović, redovni profesor Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Ljiljana Damjanović, Dr Ljubiša Ignjatović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju Univerziteta u Beogradu vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju Univerziteta u Beogradu Izdavač: Univerzitet u Beogradu Poljoprivredni fakultet Nemanjina 6, Zemun Za izdavača: Prof. Dr Dušan Radivojević Naslovna strana: Dr Vesna Antić Tiraž: 100 primeraka ISBN

3 Predgovor Udžbenik Hromatografija u analizi hrane namenjen je studentima diplomskih, specijalističkih i doktorskih akademskih studija Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu, kao i svima koji se bave analitikom organskih jedinjenja, a naročito analitikom jedinjenja iz prehrambenih proizvoda. Tekst udžbenika se zasniva na nastavnom programu predmeta Hromatografske metode u analitici hrane (diplomske akademske studije), a pokriva i delove drugih predmeta različitih nivo studija, kao što su: Hemija i analitika hrane (diplomske akademske studije); Spektroskopske i hromatografske metode u analitici hrane, Analitičke metode u mikrobiologiji hrane i Hemijska kontaminacija hrane (specijalističke akademske studije); Instrumentalne metode analiza i Hemijske i biohemijske transformacije proizvoda biljnog porekla (doktorske akademske studije). U okviru Udžbenika su najpre dati teorijski osnovi hromatografije, a zatim su detaljno opisane sledeće hromatografske tehnike: planarna hromatografija, apsorpciona hromatografija u koloni, gasna hromatografija i tečna hromatografija visokih performansi. Na kraju svakog od Poglavlja u kojima su opisane pojedinačne hromatografske tehnike, dati su brojni primeri njihove primene u analizi hrane. S obzirom da je Udžbenik namenjen višim nivoima studija, pretpostavlja se da je čitalac upoznat sa osnovama organske hemije i fizičke hemije. Zahvaljujemo se recenzentima na pažljivom čitanju rukopisa i korisnim napomenama i sugestijama, koje su doprinele da se tekst značajno poboljša i unapredi. Recenzentima smo takođe zahvalni na mišljenju da se Udžbenik može preporučiti i studentima drugih fakulteta Univerziteta u Beogradu, kao što su studenti fizičke hemije, hemije, farmacije, tehnologije i drugih nauka kojima je hromatografija komplementarna naučna disciplina, kao i svima onima koji se bave hromatografijom u stručnom, istraživačkom i svakodnevnom radu. Budući da je ovo prvo izdanje ovog Udžbenika, autori će biti vrlo zahvalni svima koji u njemu uoče propuste i greške bilo koje vrste, i daju nam usmene ili pismene sugestije za njegovo ispravljanje. Autori

4 SADRŽAJ 1. Principi i podela hromatografije Uvod Osnovi hromatografije Osnovni pojmovi u hromatografiji Hromatogram Gausov profil pika Koeficijent raspodele Teorijski podovi Retencioni parametri Selektivnost i razdvajanje Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima Disperzione sile Polarne sile Jonske sile Hidrofobne i hidrofilne interakcije Podela hromatografskih metoda Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge Podela hromatografskih metoda prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze Planarna hromatografija Hromatografija na papiru Hromatografski papir Priprema i nanošenje uzorka Mobilna faza Razvijanje hromatograma Određivanje položaja zona na hromatogramu Kvantitativna analiza Hromatografija na tankom sloju Stacionarna faza Priprema i nanošenje uzorka Mobilna faza Razvijanje hromatograma Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči Kvantitativna analiza Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane Adsorpciona hromatografija u koloni Stacionarna faza Adsorbensi Silika-gel Aluminijum-oksid... 33

5 Aktivni ugalj Magnezijum-oksid Mobilna faza Tehnika rada Gasna hromatografija Uvod Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji Teorija o gasnoj hromatografiji Gasni hromatograf Noseći gas Unošenje uzorka - isparivači (injektori) Unošenje uzoraka gasa Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim supstancama bez rastvarača Statički Headspace Dinamički Headspace Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction SPME) Gasnohromatografske kolone Pakovane kolone Kapilarne kolone Stacionarne faze Čvrste stacionarne faze Tečne stacionarne faze Selektivnost stacionarne faze Detektori u gasnoj hromatografiji Termoprovodljivi detektor Plameno-jonizacioni detektor Detektor sa zahvatom elektrona Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor Plameno fotometrijski detektor Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji Temperatura kolone Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze Kvalitativna gasnohromatografska analiza Kvantitativna gasnohromatografska analiza Metoda normalizacije površina Metoda internog standarda Metoda standardnog dodatka Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda Tečna hromatografija visokih performansi HPLC Uvod u HPLC Tehnike tečne hromatografije Šta je HPLC? Princip rada tečne hromatografije visokih performansi... 94

6 5.5. Osnovni delovi HPLC sistema Injektor Stacionarna faza kolona Mobilna faza Pumpa Detektor Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om Izokratsko i gadijentno eluiranje Analitički, preparativni i industrijski HPLC Performanse hromatografskog razdvajanja Rezolucija Sposobnost mehaničkog razdvajanja efikasnost Sposobnost hemijskog razdvajanja selektivnost Režimi HPLC razdvajanja Razdvajanje na osnovu polarnosti HPLC normalnih faza HPLC reverznih faza Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena Afinitetna hromatografija Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija Gelhromatograf Materijal za pakovanje kolone nosač stacionarne faze Mobilna faza Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom raspodelom molskih masa Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa Univerzalna kalibracija Primena HPLC tehnike u analizi hrane Literatura

7 1. Principi i podela hromatografije Cilj poglavlja Upoznavanje sa osnovnim principima hromatografskih metoda. Definisanje pojmova koji se koriste u literaturi posvećenoj hromatografskim metodama: hromatogram, pik, koeficijent raspodele, teorijski pod, međumolekulske sile i interakcije. Definisanje kriterijuma za podelu hromatografskih metoda i podela hromatografskih metoda Uvod Hromatografske metode su danas najčešće korišćene metode za razdvajanje i određivanje supstanci. Hromatografija je metoda za analitičko razdvajanje supstanci, mada se može koristiti i u preparativne svrhe, posebno za izolovanje malih količina supstance, koje se ne mogu drugim metodama izolovati i/ili prečistiti. Hromatografija se može definisati kao skup analitičkih metoda kojima se razdvajaju supstance na osnovu različitih raspodela između pokretne i nepokretne faze. Prvi naučnik koji je opisao metodu razdvajanja, koja se danas može nazvati hromatografskom, jeste ruski botaničar M. Cvet (rus. M. Цвет, engl. M. Tswett). Cvet je tehniku opisao još početkom dvadesetog veka, godine. On je ekstrakt pigmenata iz listova biljaka propuštao kroz kolonu ispunjenu kalcijum-karbonatom i eluiranjem pomoću smeše petroletar/etanol razdvojio više zelenih i žutih pigmenata. Tehniku je nazvao hromatografija (od grčkih reči χρώμα: chroma boja i γραφειν: grafein pisati). Bez obzira na naziv, on je pretpostavio da se tehnika može koristiti i za razdvajanje bezbojnih supstanci i preporučio je za razdvajanje složenih smeša. Međutim, ova tehnika je bila skoro zaboravljena više od dvadeset godina, sve do godine, kada su Kuhn, Winterstein i Lederer na koloni punjenoj istim adsorbensom razdvojili komponente žumanca jajeta i identifikovali lutein i zeaksantin. Početkom pedesetih godina prošlog veka Martin i Synge razdvajaju acetil derivate amino kiselina na koloni punjenoj silika gelom na kome je adsorbovana voda nepokretna faza a rastvarač za eluiranje hloroformom, odnosno pokretna faza. Ovo je početak tečno-tečne hromatografije ili apsorpcione (podeone) hromatografije, engl. partition column chromatography. Martin i Synge su zahvaljujući svojim istraživanjima dobili Nobelovu nagradu za hemiju godine. Kasnije, Martin u saradnji sa Consden-om i Gordon-om razvija hromatografiju na papiru, gde je voda bila nepokretna faza a 1-butanol pokretna faza. Ruski farmaceuti Izmailov i Schreiber postavljaju osnove hromatografije na tankom sloju godine, kada kao nepokretnu fazu koriste vodu adsorbovanu na tankom sloju silika gela koji je nanet na staklenu ploču. Ovu tehniku dalje razvija i unapređuje

8 Principi i podela hromatografije nemački hemičar Stahl šezdesetih godina prošlog veka. U periodu od do godine, naglo raste broj naučnih radova vezanih za hromatografiju i postavljaju se osnove za razvoj savremenih hromatografskih metoda: gasnu hromatografiju (GC), visokoefikasnu tečnu hromatografiju (HPLC), jonsku hromatografiju, itd. Uvođenjem masenog spektrometra kao detektora za gasnu hromatografiju od strane James-a i Martin-a, godine, odnosno kao detektora za tečnu hromatografiju od strane Tal roze-a i Karpov-a, godine, i kasnijim razvojem masene spektrometrije i računara počinje nova era u razvoju gasne i tečne hromatografije. Danas možemo, korišćenjem GC/MS i LC/MS metoda, kvalitativno i kvantitativno određivati i najsloženije smeše organskih jedinjenja, kao i izuzetno male količine supstanci (reda veličnine ppm) u složenim smešama. Vreme trajanja analiza na savremenim GC/MS i LC/MS aparatima je kratko (od nekoliko minuta do jednog sata), rad sa njima je jednostavan, moderni softveri omogućavaju laku intrepetaciju rezultata, sve su manjih dimenzija i, zahvaljući velikom broju proizvođača, cena im je sve niža. Moderne hemijske laboratorije za analizu prehrambenih i poljoprivrednih proizvoda, lekova, uzoraka iz životne sredine, nafte i naftnih derivata i mnogih drugih uzoraka je danas teško zamisliti bez ovih aparata Osnovi hromatografije Osnovni cilj hromatografije je razdvajanje različitih supstanci koje čine smešu. Primene se kreću od jednostavnog određivanja čistoće nekog jedinjenja do identifikacije i kvantitativnog određivanja komponenti neke smeše. Hromatografski sistem sastoji se od nepokretne, tj. stacionarne faze, koja može biti čvrsta ili tečna, i pokretne, tj. mobilne faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno prolazi kroz (preko) stacionarnu fazu. Faze se biraju tako da komponente smeše na različit način interaguju sa nepokretnom fazom, ako se radi o čvrstoj stacionarnoj fazi, odnosno da imaju različitu rastvorljivost u tečnoj stacionarnoj fazi i mobilnoj tečnoj ili gasovitoj fazi. Analizirana smeša se u hromatografski sistem uvodi preko mobilne faze. Različiti afiniteti komponenti smeše prema stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje. Svaka komponenta se zadržava u različitom stepenu na/u stacionarnoj fazi u zavisnosti od afiniteta/rastvorljivosti, odnosno kreće se različitom brzinom kroz stacionarnu fazu u zavisnosti od rastvorljivosti u mobilnoj fazi. Interakcije između komponenti uzorka i stacionarne faze se mogu klasifikovati kao procesi adsorpcije ili apsorpcije. Kod adsorpcije uzorak interaguje sa površinom faze, i to obično sa površinom čvrste supstance stacionarne faze. Sa druge strane, kod apsorpcije uzorak difunduje u unutrašnjost stacionarne faze. Većina hromatografskih razdvajanja su kombinacija adsorpcionih i apsorpcionih procesa. 2

9 Principi i podela hromatografije Kada se šmeša uvede kao rastvor na stacionarnu fazu, mobilna faza nosi komponente kroz nju. Svaka komponenta smeše je u ravnoteži između faza na drugačiji način, pre svega zbog različitog afiniteta prema stacionarnoj fazi. Iz tog razloga, svaka od komponenti ima specifičnu ravnotežnu konstantu i kreće se različitom brzinom, odnosno za različito vreme prolazi kroz stacionarnu fazu. Kao rezultat analize, hromatografski sistem će prvo napustiti komponenta koja se najkraće zadržava na stacionarnoj fazi, a poslednja ona koja se najduže zadržava, odnosno sve komponente smeše će biti razdvojene Osnovni pojmovi u hromatografiji Hromatogram Hromatogram je krajnji rezultat hromatografskog postupka. Svakoj supstanci odgovara zona na hromatogramu, odnosno određeni pik. Zone su razdvojene komponente smeše raspoređene u stacionarnoj fazi. Hromatografski maksimum ili pik je grafički prikaz odziva detektora (koncentracije komponente u eluatu ili neke druge veličine srazmerne koncentraciji) u funkciji vremena ili zapremine eluata. U zavisnosti od tipa hromatografije razlikujemo unutrašnje i spoljašnje hromatograme. Kod unutrašnjih hromatograma komponente smeše prelaze različita rastojanja za isto vreme i detektuju se na stacionarnoj fazi, tj. podlozi (Slika 1.1). Unutrašnje hromatograme susrećemo kod planarne hromatografije. Spoljašnji hromatogrami su rezultat hromatografije u koloni, kada komponente smeše prelaze isti put za različito vreme i detektuju se van stacionarne faze. Spoljašnji hromatogrami mogu biti diferencijalni i integralni. Ako detektor beleži promenu koncentracije komponente u mobilnoj fazi u funkciji vremena eluiranja onda je to diferencijalni hromatogram (Slika 1.2). Kod integralnog hromatograma detektor beleži ukupnu količinu izeluiranih sastojaka u vremenu. Spoljašnji hromatogram predstavlja grafički prikaz hromatografskog razdvajanja. Veličina merenog signala (hromatografskog maksimuma ili pika) se prikazuje u funkciji vremena zadržavanja komponente smeše u koloni ili funkciji zapremine mobilne faze koja je potrebna da eluira (spere) komponentu iz kolone. Slika 1.1. Unutrašnji hromatogram Slika 1.2. Spoljašnji diferencijalni hromatogram 3

10 Principi i podela hromatografije Gausov profil pika Svi molekuli jedne komponente se ne kreću istom brzinom kroz hromatografsku kolonu, već se jedni kreću brže a drugi sporije. Brzina kretanja na zidu kolone je približno jednaka nuli, dok je brzina kretanja u centru kolone maksimalna. Dalje, postoje i varijacije u broju sorpcija i desorpcija molekula, razlike u koncentraciji u zoni ubrizgavanja, itd. Zbog različite brzine kretanja molekula iste komponente kroz kolonu, molekuli u različito vreme dolaze na detektor, tako da se dobija signal koji, u idealnom slučaju, izgleda kao Gausova kriva raspodele. Realni pikovi vrlo često ne izgledaju kao idealna Gausova kriva, već imaju manja ili veća odstupanja iz već pomenutih razloga. Postoje dva osnovna oblika asimetričnih pikova. Kada je kolona prezasićena komponentom, onda je uzlazni deo pika strmiji od silaznog. U slučaju kada se komponenta jako vezuje za stacionarnu fazu (provodi više vremena na stacionarnoj fazi), onda je silazni deo pika strmiji od uzlaznog. Da bi ovaj nedostatak izbegli ili sveli na najmanju moguću meru, proizvođači daju kapacitet kolone koji je izražen u ng/jedinjenju, i koji omogućava procenu optimalne količine supstance za analizu Koeficijent raspodele Osnovni fizičko-hemijski parametar hromatografije je ravnotežna konstanta K, koja se naziva koeficijent raspodele i koja kvantifikuje odnos koncentracija svakog jedinjenja unutar dve faze. Vrednost koeficijenta raspodele nekog jedinjenja x može se prikazati kao: Kx = [X]S / [X]M gde je [X] S koncentracija jedinjenja u stacionarnoj fazi i [X] M koncentracija jedinjenja u mobilnoj fazi Vrednosti K su vrlo promenljive, jer one mogu biti veoma velike (npr. 1000), kada je mobilna faza gas ili male (npr. 2) kada su i stacionarna i mobilna faza u tečnom stanju. Svako jedinjenje zauzima samo ograničen prostor na koloni, uz promenljive koncentracije na svakom mestu, dakle prave vrednosti [X]S i [X]M variraju u koloni, ali njihov odnos je konstantan. Koeficijent raspodele zavisi od prirode supstance, stacionarne i mobilne faze i temperature, dok je nezavistan je od koncentracije supstance Teorijski podovi Teorijski pod (ili plato) je onaj zamišljeni deo kolone u kome je uspostavljena ravnotežna raspodela koncentracija nekog jedinjenja između stacionarne i mobilne faze. Model teorijskih podova pretpostavlja da se kolona sastoji od serije podova. Raspodela 4

11 Principi i podela hromatografije neke komponente između mobilne i stacionarne faze se javlja na svakom podu. Iz tog razloga, veći broj podova, znači bolje razdvajanje supstanci jer se dešava više ciklusa sorpcije-desorpcije. Broj teorijskih podova (N) je kvantitativna mera efikasnosti kolone i može se dobiti direktno iz hromatograma: N = 16(tr/tw) 2 U jednačini tw je širina osnove pika (širina pika na baznoj liniji), izražena istom jedinicom kao i retenciono vreme, tr, tj. vreme koje protekne od unošenja uzorka u kolonu do pojave maksimuma njegovog pika. N ima približno iste vrednosti za različite pikove nastale pod istim hromatografskim uslovima. To znači da se sa povećanjem retencionog vremena povećava i širina pika što za posledicu ima da pik koji se eluira poslednji ima malu visinu a veoma često ne može da se razlikuje od bazne linije. Vrednost N proporcionalna je dužini kolone pa, ako su ostali faktori konstantni, duža kolona vodi ka povećanju N, odnosno, boljem razdvajanju. Efikasnost kolone se najčešće izražava preko broja teorijskih podova: H = L/N H - vrednost je visina ekvivalentna jednom teorijskom podu (engl. Height Equivalent to a Theoretical Plate - HETP), L je dužina kolone. Iz jednačine se vidi da što je H vrednost manja, to je efikasnost kolone veća, odnosno širenje hromatografskih pikova je manje Retencioni parametri Retencioni parametri su parametri koji definišu brzinu kojom komponetna prolazi kroz hromatografski sistem, odnosno zapreminu mobilne faze koja je potrebna da se komponenta eluira ili dužinu puta koji komponenta pređe za određeno vreme. Retencioni parametri su: retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tm), relativno retenciono vreme (t'r), retenciona zapremina (Vr), Hold-up zapremina ili mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost. Retenciono vreme (tr) je vreme koje protekne od unošenja uzorka u kolonu do pojave maksimuma pika (slika 1.2). Redukovano retenciono vreme (tm) je vreme koje supstanca provede u stacionarnoj fazi. Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog vremena posmatrane komponente i referentne komponente (najčešće mobilne faze). Umesto relativnog retencionog vremena se često koristi korigovano retenciono vreme koje predstavlja razliku između retencionog vremena komponente i retencionog vremena mobilne faze (t0) (hold-up time ili dead time). 5

12 Principi i podela hromatografije Retenciona zapremina (Vr) je zapremina mobilne faze koja je potrebna da komponenta pređe put od početka kolone do detektora. Hold-up zapremina ili mrtva zapremina (VM) je zapremina mobilne faze koja se nalazi u koloni. Retencioni faktor (k) predstavlja meru zadržavanja komponente u koloni. Kada se jedinjenje ukupne mase m unese na kolonu, razdvaja se na dva dela: jedan deo je u mobilnoj fazi, mm - masa u mobilnoj fazi, a drugi deo u stacionarnoj fazi, ms - masa u stacionarnoj fazi. Tokom migracije jedinjena kroz kolonu, ove dve mase ostaju konstantne. Njihov odnos, koji se zove retencioni faktor, je konstantan i nezavisan od ukupne mase jedinjena unete na kolonu (m): k = ms/mm = CS/CM VS/VM = K VS/VM Ovaj parametar uzima u obzir sposobnost kolone (njene stacionarne faze) da zadrži jedinjenje. U idealnom slučaju vrednosti bi trebalo da se kreću od 1 do 5, ali ne više jer bi se u tom slučaju komponenta previše zadržavala na koloni i time neopravdano produžilo vreme analize, odnosno ne manje od jedan jer bi se tada supstanca eluirala sa pikom mobilne faze. Rf vrednost se definiše kao odnos pređenog puta komponente (da) i pređenog puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dm): Rf = da/ dm Na Slici 1.1, na kojoj je prikazan unutrašnji hromatogram, Rf vrednost bi bila jednaka b/a Selektivnost i razdvajanje Selektivnost je sposobnost hromatografskog sistema da napravi razliku između dve komponente na osnovu njihove različite raspodele između mobilne i stacionarne faze. Mera selektivnosti je faktor selektivnosti (α) koji predstavlja meru razdvojenosti dve komponente i smatra se da je za α >> 1 postignuto zadovoljavajuće razdvajanje ispitivanih komponenti. Vrednost α se izračunava iz jednačine: α = ka/kb Faktor selektivnosti se, takodje, zove i relativno zadržavanje. Što je vrednost α veća, to su dve komponente bolje razdvojene. Jedini način da se modifikuje ovaj parametar jeste da se promeni jedna ili obe faze. Rezolucija je stepen razdvajanja između dve komponente. Faktor rezolucije R se može izračunati iz sledećeg izraza: 6

13 Principi i podela hromatografije R = 2Δt/(WA-WB) gde je : Δt razlika u retencionim vremenima komponente A i B (t A t B) W A širina pika komponente A W B - širina pika komponente B Faktor rezolucije treba da ima vrednost veću od 1,2. Rezolucija zavisi od efikasnosti kolone (broja teorijskih podova), selektivnosti i kapaciteta kolone Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima Sve međumolekulske (intermolekulske) sile su po prirodi električne. Postoje tri različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione, polarne i jonske sile. Međumolekulske interakcije proizilaze iz međumolekulskih sila Disperzione sile Disperzione sile nastaju zbog oscilacija naelektrisanja kroz molekul, kao rezultat vibracija elektroni - jezgro. Elektroni u interakciji sa jezgrom daju dipole koji se brzo menjaju i ako se posmatraju kroz veliki broj konfiguracija u molekulu, njihova rezultanta je nula. Međutim, oni su u svakom trenutku u mogućnosti da interaguju sa dipolom iz drugog molekula i na taj način dovedu do interakcije između molekula. Dominantan faktor koji kontroliše jačinu disperzione sile je polarizabilnost. Dakle, disperzione interakcije nisu rezultat lokalizovanih dipola u bilo kom delu molekula, već promenljivi dipoli jednog molekula mogu da u bilo kom trenutku stupe u intrakciju sa promenljivim dipolima drugog molekula. Disperzione interakcije su slabe interakcije, koje se, zbog toga sto se javljaju kod nepolarnih jedinjenja koja se ne rastvaraju u vodi, zovu još i hidrofobne interakcije Polarne sile Polarne interakcije nastaju kao posledica električnih sila (Van der Waals ovih sila) između lokalizovanih naelektrisanja koja su rezultat stalnih ili indukovanih dipola. One se ne pojavljuju izolovano, već zajedno sa disperzionim interakcijama i u nekim slučajevima mogu da se kombinuju i sa jonskim interakcijama. Polarne interakcije su znatno jače od disperzionih interakcija, koje se mogu smatrati i indukovani dipol indukovani dipol interakcijama i uključuju dva tipa interakcija: dipol dipol interakcije, dipol indukovani dipol interakcije. Dipol dipol interakcije se javljaju između polarnih molekula i najače su od svih Van der Waals ovih interakcija. Pozitivan kraj jednog dipola se orijentiše ka negativnom kraju drugog dipola i na taj način se međusobno privlače. Ako u molekulu imamo vezan vodonik za neki izrazito elektronegativan atom koji sadrži bar jedan 7

14 Principi i podela hromatografije slobodan elektronski par, kao što su kiseonik i azot, onda nastaju veoma jake međumolekulske interakcije poznate pod imenom vodonične veze. Vodonične veze su karakteristične za jedinjenja koja sadrže hidroksilnu ili amino grupu: alkoholi, karboksilne kiseline, amini, amidi, itd. Dipol dipol sile se mogu javljati između istovrsnih molekula ali i između različitih polarnih molekula, odnosno, polarni molekuli mogu stupiti u interakciju međusobno ili, ako se nalaze u polarnoj sredini (npr. polarna stacionarna ili mobilna faza) mogu interagovati sa dipolima iz te sredine. Dipol indukovani dipol interakcije su karakteristične za polarizabilne molekule, kao što su molekuli aromatičnih jedinjenja, odnosno, molekuli sa delokalizovanim π elektronima. Kada se takvi molekuli nađu u blizini molekula koji ima stalni dipol, električno polje dipola indukuje dipol u polarizabilnom molekulu. Ovaj, novonastali dipol, tj. indukovani dipol, se ponaša na isti način kao i stalni dipol i dalje indukuje dalje stvaranje dipola, odnosno gradi dipol-dipol interakcije. Ove interakcije su takođe praćene disperzionim interakcijama i slabije su u od interakcija između stalnih dipola Jonske sile Jonske interakcije su interakcije između suprotno naelektrisanih jona. Joni su prisutni u vodenim rastvorima i ovakve interakcije su karakteristične za tečnu hromatografiju. Jonske interakcije su najjače od ranije pomenutih i mogu biti kombinovane sa disperzionim interakcijama, polarnim interakcijama i jon - dipol interakcijama. Praktično, jonske interakcije se koriste u jonizmenjivačkoj hromatografiji Hidrofobne i hidrofilne interakcije U jednom istom molekulu može biti delova koji se razlikuju po polarnosti (npr. masne kiseline), odnosno mogu imati polarni i nepolarni deo. Veliki molekuli kao što su proteini, nukleinske kiseline i polisaharidi, mogu imati na stotine različitih interaktivnih delova širom molekula (polarnih i nepolarnih). Interakcije molekula, kako inter- i intramolekulske, tako i sa mobilnom i stacionarnom fazom, određuju ukupni efekat koji može biti hidrofobni ili hidrofilni. Ako dominiraju nepolarni delovi (disperziona mesta) onda molekul interaguje disperzionim silama i takve molekule svrstavamo u hidrofobne, odnosno liofobne. Ako dominiraju dipolne i polarizabilne grupe, imamo polarne molekule ili hidrofilne, odnosno liofilne molekule. Termin hidrofobnost bukvalno znači strah od vode i podrazumeva neki oblik odbijanja nepolarnih molekula od molekula vode, koji je nemoguć izvan Van der Waalsovih poluprečnika. Hidrofobnost se može objasniti na primeru mešanja nekog nepolarnog disperzionog rastvarača, kao što je heptan sa veoma polarnim rastvaračem, kao što je voda. Heptan i voda su nemešljivi jer su privlačne sile između dva molekula heptana (disperzione sile) i dva molekula vode (vodonične veze) mnogo jače od privlačnih sila između molekula heptana i vode. Voda se u maloj meri ipak rastvara u 8

15 Principi i podela hromatografije heptanu, kao i heptan u vodi. Iako su interakcije voda-voda i heptan-heptan mnogo jače od interakcije voda-heptan, interakcije voda-heptan postoje i dovoljno su jake da omoguće rastvorljivost u maloj meri. Termin hidrofilnost bukvalno znači voli vodu i podrazumeva interakcije polarnih molekula i molekula vode. Polarni i hidrofilni su ekvivalentni termini, jer polarne supstance jako interaguju sa vodom i drugim polarnim rastvaračima. Hidrofobnost i hidrofilnost su termini koji se intenzivno koriste u biotehnologiji radi opisivanja interakcija molekula kao celine, posebno kod biomakromolekula. Na primer polipeptidi sadrže veliki broj aminokiselina od kojih svaka ima grupe različitih polarnosti, od nepolarnih do izrazito polarnih, a isto tako sadrže veliki broj peptidnih veza koje su izrazito polarne, tako da imamo delove različitih polarnosti duž polipeptidnog lanca. Da bi lakše opisali ukupan efekat svih prisutnih interakcija, inter- i intramolekulskih, koriste se termini hidrofobnost i hidrofilnost, iako su oni u osnovi alternativni termini kojima se opisuju disperzione i polarne interakcije Podela hromatografskih metoda Hromatografske metode možemo podeliti na osnovu: primenjene tehnike rada, fizičkog stanja mobilne i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske podloge Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada Metoda frontalne analize se sastoji u tome da se rastvor ispitivane smeše kontinuirano propušta kroz kolonu. Ako smeša sadrži komponente A, B i C sa redosledom koeficijenata raspodele KA > KB > KC, iz kolone prvo izlazi čista komponenta C, jer se najslabije adsorbuje. Zatim izlazi smeša komponenata B i C i na kraju eluat koji sadrži komponente A, B i C u istom odnosu u kome su unete u kolonu. Ovom metodom može se dobiti samo deo čiste komponente C, odnosno komponente koja se najbrže kreće kroz kolonu i iz tog razloga nema veći analitički značaj i retko se koristi. Metoda istiskivanja se izvodi tako što se smeša, koja sadrži komponente A, B i C, nanese na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano propušta rastvor komponente D, koja se mnogo jače vezuje za adsorbens od komponenata analizirane smeše. Komponenta D potiskuje komponente smeše, koje obrazuju zone. Zbog stalnog dejstva komponente D, komponente smeše se ne mogu potpuno razdvojiti, već se zone međusobno dodiruju. Do izlaska iz kolone, sve tri zone se kreću istom brzinom, koja zavisi od brzine kretanja komponente D kroz kolonu. Metoda eluiranja je praktično jedina metoda koja se koristi za razdvajanje u analitičke svrhe, jer se pomoću nje komponente smeše mogu potpuno razdvojiti. Mala količina analizirane smeše, koja sadrži komponente A, B i C, sa redosledom koeficijenata raspodele KA > KB > KC, nanese se na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano 9

16 Principi i podela hromatografije propušta mobilna faza, tzv. eluent, odnosno vrši eluiranje. Ako su razlike u vrednostima koeficijenata raspodele komponenti dovoljno velike, postižu se potpuna razdvajanja, pri čemu iz kolone prvo izlazi komponenta C, koja se najslabije vezuje za stacionarnu fazu Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja Adsorpciona hromatografija se zasniva na razlici između adsorpcionih afiniteta komponenti uzorka prema aktivnoj površini čvrste, odnosno, stacionarne faze (IUPAC definicija). Takođe se još naziva tečno-čvrsta hromatografija. Adsorbenti su uglavnom aktivne, porozne čvrste supstance sa velikom površinom, kao što su silika-gel, aluminijum-oksid, magnezijum-silikat, aktivni ugalj itd. Adsorbensom može biti napunjena kolona, može biti nanesen na neku podlugu u obliku tankog sloja a takođe adsorbensom može biti impregniran i porozni papir. Aktivni delovi stacionarne faze interaguju sa funkcionalnim grupama komponenti smeše koja se razdvaja i zahvaljujući tome mogu se razdvojiti različite klase jedinjenja. Na primer, silika-gel jako interaguje sa polarnim funkcionalnim grupama, a slabo sa nepolarnim grupama i na taj način se mogu odvojiti polarna od nepolarnih jedinjenja (npr. alkoholi od ugljovodonika). Podeona (particiona) hromatografija se zasniva na različitoj rastvorljivosti komponenti uzorka u stacionarnoj fazi (gasna hromatografija) ili na različitoj rastvorljivosti komponenti u mobilnoj i stacionarnoj fazi (tečna hromatografija) (IUPAC definicija). Kod tečne hromatografije komponente uzorka se, prema rastvorljivosti, raspoređuju između dve faze koje se međusobno ne mešaju. Tečna stacionarana faza je ravnomerno raspoređena na čvrstom inertnom nosaču i različite je polarnosti od tečne mobilne faze, da bi se izbeglo mešanje ove dve faze. Obično je stacionarna faza polarna a mobilna nepolarna i u tom slučaju se radi o hromatografiji normalnih faza. U obrnutom slučaju kada je stacionarna faza nepolarana a mobilna faza polarna onda je to tečna hromatografija obrnutih ili reverznih faza. Jonoizmenjivačka hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u rastvoru, prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje poseduju neki adsorbensi. Takvi adsorbensi mogu biti neorganskog i organskog porekla, sintetički i prirodni. Prema tome da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone, dele se na katjonske i anjonske izmenjivače. Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, razdvajanje jona, razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje koncentracije jona. Najčešće se kao jonski izmenjivači koriste visokopolimerne smole koje sadrže aktivne kiselinske ili bazne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora. Katjonski izmenjivači sadrže kiselinske grupe, kao što su SO3H i COOH, a anjonski izmenjivači sadrže bazne grupe, kao što su OH ili amino NH2, NHR i NR2 grupe. Pomoću katjonskih izmenjivača razdvajaju se aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza 10

17 Principi i podela hromatografije koje su rastvorne u vodi. Anjonski izmenjivači se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, hemoglobina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase i drugih jedinjenja. Gel hromatografija ili gel filtracija (engl. Exclusion Chromatography) se zasniva na razlikama u veličini molekula i/ili oblika ili naelektrisanja. Kada se razdvajanje zasniva na veličini molekula, u engleskom jeziku se takođe koristi naziv Size-Exclusion Chromatography. Termini gel filtracija i gel-propusna hromatografija (GPC) su korišćeni ranije da se opiše ovaj proces kada je stacionarna faza u obliku nabubrelog gela. Engleski naziv Ion-Exclusion Chromatography se specifično koristi za razdvajanje jona u vodenoj fazi (IUPAC definicija). Razdvajanje gel hromatografijom se razlikuje od razdvajanja drugim hromatografskim metodama po tome što se zasniva na veličini molekula, a ne na hemijskim i fizičko-hemijskim fenomenima. Stacionarna faza je hemijski inertna i dolazi do selektivne difuzije molekula uzorka iz mobilne faze u pore stacionarne faze, koja može biti gel ili porozna neorganska čvrsta supstanca. Stepen zadržavanja zavisi od veličine molekula uzorka u odnosu na veličinu pora. Manji molekuli će prodirati u sve pore, molekuli srednje veličine će prodirati samo u neke pore, dok će veliki molekuli prolaziti kroz kolonu bez zadržavanja. Ova metoda se najčešće koristi za međusobno razdvajanje (frakcionisanje) polimera i biopolimera, odnosno, molekula velikih molskih masa, kao i za razdvajanje (prečišćavanje) velikih molekula od malih molekula. Afinitetna hromatografija se zasniva na različitom afinitetu komponenti smeše, najčešće proteina, prema specifičnim hemijskim grupama ligandima. Ligandi su vezani za čvrsti nosač i predstavljaju stacionarnu fazu, dok je mobilna faza najčešće neki pufer. Interakcije između liganada i proteina su vrlo specifične i selektivne, tako da se određeni proteini vezuju samo za određene ligande, odnosno ligand može biti specifičan samo za jedan protein iz uzorka biološkog materijala. Iz tog razloga se interakcije protein ligand, još zovu i ključ brava interakcije. Najčešće protein ligand interakcije su: enzim-inhibitor, hormon-receptor, antitelo-antigen, protein-ugljeni hidrat, enzimkoenzim i metaloprotein-jon metala Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge Hromatografija u koloni je tehnika razdvajanja kod koje se stacionarna faza nalazi u koloni (cevi). Stacionarnu fazu čine čestice čvrste supstance ili čestice čvrste supstance obložene tankim kapilarnim slojem tečnosti kojima je ispunjena kolona (pakovana kolona) ili stacionarnom fazom može biti obložen unutrašnji zid kolone (tubularna kolona). Mobilna faza se kreće kroz stacionarnu fazu ili duž stacionarne faze. Hromatografske kolone mogu biti otvorene i kroz njih se moblna faza kreće pod dejstvom sile Zemljine teže. To su najčešće staklene cevi ispunjene stacionarnom fazom, na čiji vrh se nanosi uzorak i dodaje rastvarač (eluent) ili više rastvarača koji sa sobom nosi komponente uzorka. Kod zatvorenih hromatografskih kolona mobilna faza se kroz kolonu kreće pod pritiskom (pritisak gasa ili pumpa). U zavisnosti od jačine interakcija 11

18 Principi i podela hromatografije komponenti uzoraka sa stacionarnom fazom one kroz kolonu putuju različitim brzinama i na taj način se razdvajaju. Planarna hromatografija je tehnika razdvajanja u kojoj je stacionarna faza ravan ili se nalazi na ravni. Stacionarna faza može biti papir, tačnije voda vezana za papir, ili papir impregniran stacionarnom fazom i ta vrsta hromatografije se zove hromatografija na papiru. Takođe, stacionarna faza može biti tanki sloj čvrstih čestica nanetih na ravnu površinu, najčešće staklenu, kada se radi o hromatografiji na tankom sloju. Ova hromatografija se još naziva i hromatografija u otvorenoj koloni. Kod hromatografije na papiru stacionarna faza je voda kojom je zasićena celuloza, dok je mobilna faza neki organski rastvarač ili smeša rastvarača. Tehnika se izvodi tako što se na papir nanese uzorak i papir postavlja u sud tako da rastvarač kroz papir prolazi horizontalno, nadole ili nagore. Prema načinu na koji mobilna faza prolazi kroz papir razlikuju se: horizontalna (kružna) hromatografija, silazna i uzlazna hromatografija na papiru. Kod hromatografije na tankom sloju stacionarnu fazu čini tanak sloj nekog adsorbensa nanet na ravnu podlogu staklenu ploču. Izbor adsorbensa zavisi od prirode supstanci koje se razdvajaju. Najčešće se koriste: silikagel, aluminijum-oksid, celulozni prah, magnezijum-oksid, itd. Danas se koriste i komercijalne ploče sa nekom od ovih podloga ili sa podlogom koja sadrži specifične aditive. Kao i kod hromatografije na papiru i kod ove tehnike se, u zavisnosti od načina prolaska mobilne faze kroz stacionarnu, razlikuju tri tehnike: horizontalna, uzlazna i silazna Podela hromatografskih metoda prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze Mobilna faza može biti gas ili tečnost, a stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna. Prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze sve hromatografske metode možemo podeliti na: gasno (mobilna faza) tečnu (stacionarna faza), gasno čvrstu, tečno tečnu i tečno čvrstu hromatografiju. U zavisnosti od korišćene tehnike, vrste stacionarne faze i podloge, ove hromatografske tehnike se mogu svrstati u neku od već pomenutih podela. Rezime poglavlja Hromatografski sistem sastoji se od nepokretne, stacionarne faze, koja može biti čvrsta ili tečna, i pokretne, mobilne faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno prolazi kroz (preko) stacionarnu fazu. Različiti afiniteti komponenti smeše prema stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje. Osnovni pojmovi u hromatografiji su: hromatogram, pik, koeficijent raspodele, teorijski pod, retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tm), relativno 12

19 Principi i podela hromatografije retenciono vreme (t'r), korigovano retenciono vreme, retenciona zapremina(vr), hold-up zapremina ili mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost. Međumolekulske interakcije u hromatografskim sistemima proizilaze iz međumolekulskih sila. Postoje tri različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione, polarne i jonske sile. Hromatografske se dele na osnovu: primenjene tehnike rada, fizičkog stanja mobilne i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske podloge. Pitanja za proveru znanja ili diskusiju 1. Definisati pojmove: hromatogram, koeficijent raspodele, teorijski pod, retencioni faktor i Rf vrednost. 2. Definisati retencione parametre. 3. Objasnite međumolekulske interakcije izazvane polarnim silama. 4. Šta su to hidrofobne i hidrofilne interakcije? 5. Kako se dele hromatografske metode prema mehanizmu razdvajanja? Objasniti mehanizme razdvajanja. Literatura 1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380, A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd, Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp , A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, 5th Edition, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold- Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G. Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography, Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp , R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 1, Library4science,

20 2. Planarna hromatografija Cilj poglavlja Upoznavanje sa metodama planarne hromatografije: hromatografija na papiru i tankoslojna hromatografija. Definisanje i opis: stacionarne faze (hromatografski papir, silika-gel, Al2O3, itd.), pripreme i nanošenja uzorka, mobilne faze, razvijanja i izazivanja hromatograma, kvalitativne i kvantitativna analize Hromatografija na papiru Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije i veoma je intenzivno korišćena u prošlosti. Prvo hromatografsko razdvajanje na papiru uradili su Consden, Gordon i Martin godine, oni su razdvajali amino-kiseline na trakama papira. Danas je papirna hromatografija zamenjena tankoslojnom hromatografijom za većinu aplikacija ali se i dalje koristi. Glavne prednosti ove metode su: jednostavnost, niske cene, nema komplikovanih operacija, kvantitativno određivanje se pože postići bez upotrebe instrumenata itd Hromatografski papir Papir koji se koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a stacionarna faza je voda adsorbovana na molekulima celuloze. Dakle, hromatografija na papiru je podeona, tečno tečna, hromatografija. Mnogobrojne hidroksilne grupe u molekulu celuloze čine njenu površinu hidrofilnom odakle potiče njen afinitet prema molekulima polarnih rastvarača. Međutim, ne sme se zanemariti adsorpcija komponenata mobilne faze i analizirane smeše na molekule celuloze, kao i jonska izmena. Adsorpcija i jonska izmena se mogu kontrolisati podešavanjem eksperimentalnih uslova, ukoliko se želi da se uticaj ovih faktora svede na najmanju moguću meru, onda se rastvarači koji čine mobilnu fazu prethodno zasite vodom. Za hromatografiju na papiru najčešće se koristi nemodifikovana pamučna celuloza, koju karakteriše vlaknasta struktura. Papir se sastoji od velikog broja celuloznih vlakana koja obrazuju trodimenzionalnu mrežu u čijoj strukturi se nalazi slobodan prostor. Stacionarna faza se adsorbuje na površini vlakana, dok mobilna faza protiče preko ove površine i adsorbovanog sloja i puni slobodne prostore. Ako su vlakna na manjem rastojanju slobodan prostor je redukovan i brzina proticanja mobilne faze se smanjuje. Brzina protoka mobilne faze zavisi od njenog viskoziteta, a za datu smešu rastvarača brzina zavisi od fizičke prirode hartije. Proizvodi se papir različite gustine i 14

21 Planarna hromatografija debljine. Deblja hartija iste gustine povećava brzinu protoka, pod kojim se podrazumeva pomeranje fronta rastvarača a ne zapremina tečnosti koja protiče u jedinici vremena. Danas postoje veoma raznovrsne vrste papira napravljene od nemodifikovane celuloze: - papiri male gustine, koji omogućavaju brži protok mobilne faze - glatki papiri veće gustine - papiri isprani kiselinom - papiri bez rastvorljivih supstanci u lipidima - papiri za preparativnu hromatografiju, itd. Pored pomenutih proizvode se i papiri od modifikovane celuloze koji su pogodni za hromatografisanje polarnih, nepolarnih ili jonskih supstanci. Za razdvajane polarnih supstanci u molekul celuloze se uvode polarne grupe. Na primer celuloza sa povećanim sadržajem karboksilnih grupa je pogodna za odvajanje polarnih jedinjenja kao što su amini, amino-kiseline i katjoni. Papir koji sadrži jonoizmenjivačke smole pogodan je za razdvajanje jonskom izmenom. Za razdvajanje hidrofobnih jedinjenja koristi se papir impregniran suspenzijom dijatomejske zemlje ili papir napravljen od celuloznih estara, na primer, acetilovani papir. Takođe, papir može biti impregniran silikonskim uljem smešom cikličnih i acikličnih oligomera polisiloksana, može da sadrži adsorbente poput glinice ili silika-gela itd. Za razdvajanje smeša koje sadrže korozivne supstance koriste se papiri sa staklenim vlaknima, kod njih su i adsorpcioni efekti minimizirani i za analizu je potrebno značajno manje vremena Priprema i nanošenje uzorka Čvrsti uzorci moraju biti rastvoreni u lako isparljivom rastvaraču, kao što su etanol i aceton, odnosno uz primenu odgovarajućih mera bezbednosti i hloroform (trihlormetan) i metilen hlorid (dihlormetan). Količina uzorka koja se nanosi zavisi od mogućnosti njegove detekcije i mora se voditi računa da se ne preoptereti sistem, odnosno da se ne nanese velika količina uzorka. Poželjno je da se nanese oko 10 μl rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u obliku kružne mrlje koja sadrži od µg uzorka. Ako je koncentracija uzorka u rastvoru niska, ona se može povećati na jedan od sledećih načina: - ekstrakcijom uzorka iz rastvora i koncentrovanjem novog rastvora - nanošenje rastvora uzorka više puta na papir u malim porcijama - jonske supstance iz bioloških materijala mogu se koncentrovati korišćenjem jonoizmenjivačkih papira. Uzorci koji sadrže velike količine supstanci koje nisu od interesa za analizu moraju se pre hromatografisanja prečistiti. Na primer uzorci koji se koriste za praćenje zagađenja zemljišta ili vode, uzorci hrane, uzorci hrane za životinje, uzorci bioloških materijala itd. 15

22 Planarna hromatografija Informacija o rastvorljivosti supstance koja se analizira, kao i o rastvorljivosti pratećih supstanci je od velikog interesa. Ako je je analizirana supstanca rastvorna u nekom rastvaraču, a prateće nisu, onda je ekstrakcija odgovarajućim rastvaračem dovoljna za prečišćavanje i koncentrovanje. Neorganske supstance se mogu ukloniti korišćenjem rastvarača koji selektivno rastvara komponente od interesa ili jonoizmenjivačke smole. Proteini se mogu ukloniti taloženjem sa volframovom kiselinom, koagulacijom na povišenoj temperaturi, koagulacijom u prisustvu metanola ili acetona. Lipidi se mogu ukloniti ekstrakcijom sa nepolarnim (lipofilnim) rastvaračem. alternativno, hromatogram može biti razvijen sa lipofilnim rastvaračem za uklanjanje lipida iz uzorka gde se određuju supstance koje nisu lipofilne. Analit se zatim hromatografiše odgovarajućim rastvaračem. Kod nekih uzoraka je pre hromatografisanja potrebno da jednu ili više komponenti uzorka hemijskom reakcijom prevedemo u odgovarajući derivat. Uobičajeni načini derivatizacije za uvođenje hromofora su dati u Tabeli 2.1. Tabela 2.1. Uobičajeni načini derivatizacije za uvođenje hromofora Jedinjenje Reagens Derivat Derivatizacija je pogodna iz sledećih razloga: - Bolja je detekcija analiziranih komponenti - Smanjuje se isparljivost analiziranih komponenti - Uklanjaju se supstance koje nisu od interesa za analizu - Poboljšava se razdvajanje analiziranih komponenti. 16

23 Planarna hromatografija Izbor reagensa za derivatizaciju zavisi od prisustva i reaktivnosti funkcionalnih grupa u analiziranoj supstanci. U idealnom slučaju reakcija derivatizacije treba da bude brza, kvantitativna, bez ili sa minimumom sporednih proizvoda. Pošto se za detekciju najčešće koristi UV spektrometar, cilj derivatizacije je da se poveća UV apsorbanca jedinjenja od interesa, vezivanjem hromofore sa visokim molarnim koeficijentom ekstincije. Reakcija sa specifičnom funkcionalnom grupom ne samo da daje željeni derivat, već smanjuje i polarnost i često derivat ima bolja hromatografska svojstva od polazne supstance. Derivatizuju se najčešće jedinjenja koja sadrže amino-, karboksilnu- ili hidroksilnu grupu. U Tabeli 2.1 su pokazani najčešći reagensi za uvođenje hromofora odnosno povećanje UV apsorbcije, a u Tabeli 2.2 reagensi za dobijanje derivata sa većom fluorescencijom. Treba napomenuti da se derivatizacija izvodi samo ako je neophodno, jer taj postupak produžava vreme analize i zahteva pažljivo izvođenje da ne bi došlo do gubitaka. Reakcije derivatizacije se mogu koristiti i za bolju detekciju zona nakon razvijanja hromatograma (vidi deo Detekcija). Tabela 2.2. Uobičajeni načini derivatizacije za povećanje fluorescencije Jedinjenje Reagens Derivat 17

24 Planarna hromatografija Mobilna faza Mobilna faza je rastvarač ili smeša rastvarača zasićena vodom. Koristi se veliki broj mobilnih faza u zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju (hidrofilne, umereno polarne, hidrofobne). U Tabeli 3. su prikazani najčešće korišćeni rastvarači u papirnoj hromatografiji. Osim rastvarača u mobilnu fazu se dodaju i različite supstance, kao što su kiseline, baze, kompleksirajući agensi, sa ciljem da se poveća ili smanji rastvorljivost pojedinih supstanci u analiziranoj smeši. Tabela 2.3. Najčešće korišćeni rastvarači u papirnoj hromatografiji Mešljiv sa vodom u svim odnosima Formamid Metanol Sirćetna kiselina Etanol 2-propanol (Izopropanol) Aceton 1-propanol Nepotpuno mešljiv sa vodom 2-metil-2-propanol (t-butanol) 1-butanol 1-pentanol (amil alkohol) Etil-acetat Dietil etar Toluen Petrol etar Razdvajanje supstanci hromatografijom na papiru se zasniva na raspodeli između celuloze, za koju je vezana voda, i pokretnog rastvarača koji je zasićen vodom. S obzirom da se na celulozi nalazi sloj molekula vode, vezanih za nju vodoničnim vezama i da stacionarna faza adsorbuje molekule supstance iz mobilne faze, praktično ne postoji dodirna površina rastvarač-rastvarač, već postepena promena sastava rastvarača u pravcu suprotnom od površine celuloze i to od najpolarnijeg rastvarača (vode) do manje polarnog organskog rastvarača. Dok mobilna faza prolazi kroz vlakna papira, celuloza teži da adsorbuje više vode iz nje, tako da što rastvarač više napreduje sadrži manje vode, pa sastav mobilne faze nije konstantan duž hromatografske hartije, odnosno, postoji suvi i mokri front rastvarača. Za razdvajanje hidrofilnih supstanci najčešće se koriste mobilne faze koje se sastoje od: 1-butanola/sirćetne kiseline/vode ili 2-propanola/amonjaka/vode. Za razdvajanje umereno polarnih supstanci kao osnovni rastvarač se koristi formamid kombinovan sa polarizabilnim organskim rastvaračima: formamid/hloroform, formamid/toluen. U toluen i hloroform se često dodaju različite količine cikloheksana za poboljšavanje razdvajanja. Kada se koristi formamidna mobilna faza, hromatografski papir se impregnira 40 % rastvorom formamida u etanolu u koji se mogu dodati (do 5 %) amonijumformijat ili mravlja kiselina za zakišeljavanje stacionarne faze. Za razdvajanje hidrofobnih supstanci najčešće se koriste dve smeše rastvarača: dimetilformamid/cikloheksan (za impregnaciju papira koristi se 50 % DMF u etanolu) i parafinsko ulje/dimetilformamid/metanol/voda (za impregnaciju papira koristi se 10 % rastvor parafinskog ulja u nekom aromatičnom ugljovodoniku). 18

25 Planarna hromatografija Razvijanje hromatograma Podeona hromatografija na hartiji izvodi se u staklenoj posudi (hromatografskoj kadi) sa poklopcem koji dobro zatvara. Atmosfera posude mora biti zasićena parama rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa hartije. Širina zone izdvojene komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Pomoću kalibrisane kapilare ili mikropipete nanese se rastvor uzorka na nekoliko centimetara od kraja trake od hartije, koja se nalazi u horizontalnom položaju.uzorak se nanosi u obliku zone, koja ne treba da ima prečnik veći od 5 mm, ili u obliku što tanje crte. Hartija sa nanetom zonom uzorka može se postaviti u sud tako da rastvarač kroz hartiju prolazi horizontalno, nadole ili nagore. Prema tome, razlikuju se: horizontalna (kružna), silazna i uzlazna hromatografija na papiru. Horizontalna ili kružna hromatografija na papiru izvodi se tako što se hartija kružnog oblika stavi u komoru zasićenu parama mobilne faze i uzorak nanese u centar kružne hartije. Pre toga se od ivice ka centru kruga iseče uzana traka i savije normalno na ravan hartije. Kraj trake se uroni u rastvarač, koji kroz traku dospeva do centra hartije i radijalno se širi. Na taj način formiraju se odvojene zone komponenti smeše u obliku koncentričnih krugova (Slika 2.1). Slika 2.1. Kružna hromatografija na papiru Silazna hromatografija na papiru izvodi se tako što se kraj trake na koji je nanet uzorak pričvrsti za dno rezervoara sa rastvaračem, koji se nalazi na vrhu posude (Slika 2.2). Protok rastvarača kroz hartiju ostvaruje se pomoću kapilarnog pritiska, dok front rastvarača ne pređe zid rezervoara. Dalje se rastvarač kreće i pod uticajem sile gravitacije, pomerajući zonu uzorka, koji je nanet izvan rezervoara, naniže. Ova tehnika se koristi za razdvajanje komponenata koje imaju male ili vrlo bliske Rf vrednosti. Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom hartije i visinom posude. 19

26 Planarna hromatografija Slika 2.2. Silazna hromatografija na papiru Dvodimenzionalna hromatografija na papiru se koristi kod supstanci sa bliskim Rf vrednostima. Kad se završi razdvajanje silaznom tehnikom, traka se osuši, okrene za 90 i protok rastvarača, najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog rastvarača (Slika 2.3). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni rastvarač potpuno ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač. I razvijanje rastvarač 1 II razvijanje rastvarač 2 smer Slika 2.3. Dvodimenzionalna hromatografija na papiru Uzlazna hromatografija na papiru je tehnika koja se najviše koristi, a izbegava se samo kad su Rf vrednosti komponenata suviše bliske. Ovde se rastvarač sipa na dno suda, a hartija postavi tako da donji deo hartije bude potopljen u rastvarač (Slika 2.4). Mesto nanošenja uzorka mora biti dovoljno udaljeno od donjeg kraja i mora biti iznad nivoa rastvarača, u kome bi se inače uzorak rastvorio. Pošto rastvarač kod ove tehnike prodire kroz hartiju pod dejstvom kapilarnih sila, zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na određenoj visini. 20

27 Planarna hromatografija Slika 2.4. Uzlazna hromatografija na papiru Parametar kojim se izražava ponašanje analizirane supstance kod hromatografije na ravnim površinama jeste brzina kretanja ili faktor zadržavanja, Rf vrednost. U Poglavlju 1 je već definisana Rf vrednost kao odnos pređenog puta komponente (da) i pređenog puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dm): Rf = da/ dm Kod hromatografije na ravnim površinama merenje puteva vrši se od središta zone nanetog uzorka (analizirane smeše), koje se zove startna linija, do središta zone komponente, odnosno do fronta rastvarača (Slika 2.5). Najveću Rf vrednost imaće komponenta koja se najbolje rastvara u organskom rastvaraču (mobilnoj fazi), jer se brže kreće od komponente koja se bolje rastvara u stacionarnoj fazi. Smatra se da su komponente dobro razdvojene ako je ΔRf > 0,05. Rf vrednost je karakteristična za svaku komponentu u definisanom hromatografskom sistemu i služi za identifikaciju komponente u analiziranoj smeši, što nije uvek sigurno s obzirom na veliki broj faktora koji utiču na ovaj parametar. To je u prvom redu sastav rastvarača, čija i najmanja promena može da dovede do znatnih razlika u Rf vrednostima, zatim temperatura, koja utiče na podeone koeficijente i viskozitet mobilne faze, samim tim i na brzinu protoka i ravnotežu u sistemu. Pored toga na Rf vrednosti utiču i kvalitet hromatografskog papira, veličina posude u kojoj se razvijanje vrši, kao i priroda analizirane smeše. Za identifikaciju je najpouzdanije istovremeno hromatografisanje analiziranog uzorka i standarnog rastvora pod potpuno istim uslovima na jednom hromatografskom papiru. 21

28 Planarna hromatografija Slika 2.5. Određivanje Rf vrednosti kod uzlazne hromatografije na papiru Određivanje položaja zona na hromatogramu Kada se završi razvijanje hromatograma, papir se uklanja iz hromatografske kade, obeležava front rastvarača i suši. Ako su analizirane supstance obojene onda su one vidljive i zone se lako mogu obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance bezbojne (nevidljive), koriste se fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona. Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne (supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje radioktivnosti. Hemijskim metode se sastoje od reakcije supstance sa reagensom koji daje obojeni proizvod. Na primer, H2S sa metalnim jonima daje obojene sulfide, amino kiseline daju obojeni kompleks sa ninhidrinom, dok AgNO3 sa redukujućim supstancama kao što su šećeri daje srebrno ogledalo. U Tabeli 2.4. su prikazani neki selektivni reagensi koji se u obliku spreja nanose na hromatogram i daju odgovarajuće obojene proizvode. Tabela 2.4. Selektivni sprej reagensi Reagens Boja zone Primena Pare joda Braon Nezasićena organska jedinjenja 2, 7 - Dihlorofluororescein Žuto-zelena ispod UV svetlosti na 254 nm Veliki broj organskih jedinjenja 0,1-0,5 % Bromkrezol zeleno Žuta Karboksilne kiseline 50 % SbCl 3 u CH 3COOH Različite boje Steroidi, karotenoidi, aliciklični vitamini 0,3 % Ninhidrin u 1-butanolu sa 3% CH 3COOH Roze-ljubičasta Amino kiseline 22

29 Planarna hromatografija Kvantitativna analiza Kvantitativna analiza komponenata može se uraditi na dva načina: direktnim određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom supstance iz zone pogodnim rastvaračem. Supstance se određuju u izdvojenim zonama direktno na papiru (in situ), pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere transparenciju, refleksiju ili fluorescenciju. U tu svrhu se koriste denzitometri i spektrofotometri. Denzitometri su podešeni tako da direktno skeniraju hromatografske trake: svetlosni zrak prolazi kroz prorez preko površine hartije i u zavisnosti od koncentracije supstabce dolazi do različitog propuštanja svetlosti što se registruje na detektoru kao kriva koja odgovara Gausovoj krivoj. Površina ispod krive srazmerna je koncentraciji analizirane supstance. Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom količinom rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski, spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom Hromatografija na tankom sloju Hromatografija na tankom sloju se, zajedno sa hromatografijom na papiru, zove još hromatografija u otvorenoj koloni. Izvodi se na tankom sloju stacionarne faze kojom je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala (staklo, aluminijum ili polietilen). Ideju za tankoslojnu hromatografiju dali su ruski naučnici Izmailov i Schreiber godine, kada su upotrebili adsorbens u obliku tankog sloja nanetog na inertan nosač. Bilo je potrebno još dvadesetak godina da ova metoda postane praktična tehnika, odnosno do opisa metoda, adsorbenasa i opreme za pripremanje hromatografskih ploča (Stahl, godine). Danas je hromatografija na tankom sloju veoma zastupljena metoda za analizu i razdvajanje velikog broja različitih supstanci. Koristi se za kvalitativne, semikvantitativne i kvantitativne analize u hemijskim i farmaceutskim laboratorijama, kao i u laboratorijama za analizu hrane i sirovina za pripremanje prehrambenih proizvoda. Razlozi za široku upotrebu ove tehnike su: kratko vreme analize, dobro razdvajanje komponenti iz relativno male količine uzorka, kvalitativna i kvantitativna analiza, niska cena, mogućnost razdvajanja hidrofobnih sipstanci, mogućnost preparativnog razdvajanja, mogu se koristiti agresivniji reagensi za bojenje zona (H2SO4) itd Stacionarna faza U tankoslojnoj hromatografiji se koristi veliki broj različitih stacionarnih faza. Kod klasične hromatografije na tankom sloju stacionarna faza je silika gel i smatra se da je to adsorpciona hromatografija. Međutim, razdvajanje se ne dešava samo zbog 23

30 Planarna hromatografija adsorpcije na silika gelu, zbog toga što su uvek u silika gelu prisutne male količine vode pa imamo i podeonu hromatografiju. Pored toga i rastvarači iz mobilne faze se adsorbuju na silika gel tokom razvijanja hromatogrma i na taj način imamo još jedan mehanizam razdvajanja. Zahvaljujući različitim materijalima koji se koriste za oblaganje ploča mogući su sledeći mehanizmi razdvajanja: - Adsorpciona hromatografija, gde se kao adsorbensi koriste: silika-gel, glinica (Al2O3), kizelgur (dijatomejska zemlja), - Podeona hromatografija, gde se najčešće koristi celuloza, zatim kizelgur i silikagel, - Jonoizmenjivačka hromatografija, kod koje se koristi derivatizovana celuloza: celuloza-fosfat, polietilenimin-celuloza, DEAE-celuloza, - Gel filtracija, gde se koriste umreženi polisaharidi dekstrani sa različitim dimenzijama pora, koji su komercijalno dostupni pod imenom Sephadex (SEParation PHArmacia DEXtran). - Korišćeni su i različiti poliamidi za razdvajanje tanina, kumarina i flavon glukozida. Tačan mehanizam razdvajanja ovih jedinjenja nije definisan i pretpostavlja se da do razdvajanja dolazi na osnovu istog, odnosno, različitog broja hidrofilnih funkcionalnih grupa. Najčešće korišćeni poliamidi su: polikaprolaktam, acetilovani polikaprolaktam i poliakrilonitril Priprema i nanošenje uzorka Priprema uzorka podrazumeva koncentrovanje supstanci koje su analiziraju i odvajanje supstanci iz uzorka koje mogu da ometaju analizu. Naročito je važna priprema uzoraka bioloških materijala kada se u njima analiziraju tragovi nekih supstanci. Praktično zadatak analitičara je da odstrani najveći broj kompononenti, a da pri tome nema gubitaka supstanci koje analizira. Cilj je dobiti što čistije analizirane supstance u koncentraciji koja se može detektovati. Sledeći postupci se najčešće koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka: - Taloženje neželjenih komponenti - Tečno-čvrste ekstrakcije - Tečno-tečna ekstrakcija - Ultrafiltracija - Ekstrakcija jonskom izmenom - Derivatizacija - Formiranje kompleksa - Zamrzavanje - sušenje - Ekstrakcija na čvrstoj fazi u koloni 24

31 Planarna hromatografija - Ekstrakcija na specijalizovanim kolonama - kertridžima - Prekoncentracija Danas su komercijalno dostupne male kolone (kertridži) ispunjene različitim adsorbensima koje se koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka za hromatografsku analizu. Hromatografija na tankom sloju se može koristiti i za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka za druge osetljivije hromatografske metode analize. Takođe, tankoslojna hromatografija se koristi i za preparativno razdvajanje supstanci. Za preparativne svrhe se koriste ploče sa debljim slojem stacionarne faze (> 250 µm) i uzorak se nanosi u obliku crte. Uzorak za hromatografisanje na tankom sloju se rastvori u rastvaraču koji se može lako upariti i µl rastvora nanese na 1,5-2 cm od kraja ploče, tako da obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm. Količina uzorka koji se nanosi na ploču zavisi od mogućnosti za detekciju. Pre razvijanja hromatograma neophodno je osušiti zonu, odnosno upariti rastvarač u kome je rastvoren uzorak Mobilna faza Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan. U zavisnosti od vrste tankoslojne hromatografije, najčešće se koriste smeše rastvarača navedene u nastavku teksta. Adsorpciona hromatografija na tankom sloju: - heksan/etar - heksan/etar/sirćetna kiselina - hloroform/metanol - toluen/aceton. Podeona hromatografija na tankom sloju: - 1-butanol/sirćetna kiselina/voda - 1-butanol/aceton/dietiamin/voda - 2-propanol/mravlja kiselina/voda Jonoizmenjivačka hromatografija na tankom sloju: - 0,001 1 mol/dm 3 HCl - 0,001 1 mol/dm 3 NaOH - 0,001 1 mol/dm 3 NaCl Reverzno-fazna hromatografija na tankom sloju: - acetonitril/sirćetna kiselina - aceton/voda - hloroform/metanol/voda 25

32 Planarna hromatografija Tankoslojna hromatografija na poliamidima: - etanol/voda - aceton/voda - voda/etanol/sirćetna kiselina/dimetilformamid Tankoslojna hromatografija na gelovima od dekstrana (Sephadex): - 0,01 0,1 mol/dm 3 sirćetna kiselina - 0,01 0,1 mol/dm 3 amonijak - 0,01 0,1 mol/dm 3 natrijum-fosfatni pufer Razvijanje hromatograma Hromatografija na tankom sloju se može izvesti horizontalnom, silaznom i uzlaznom tehnikom, slično kao i hromatografija na papiru (Poglavlje ). Za razliku od hromatografije na papiru gde je najzastupljenija silazna tehnika, kod hromatografije na tankom sloju najčešće se koristi uzlazna tehnika. Obično su Rf vrednosti od 10 do 15 cm. Hromatografska ploča se razvija u staklenoj komori (hromatografskoj kadi) koja je opremljena poklopcem koji dobro zatvara (Slika 2.8, levo). Atmosfera posude mora biti zasićena parama rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa ploče. Da bi se dobila ravnomerna zasićenost parom u svim delovima komore, unutrašnji zidovi se oblažu filter papirom natopljenim rastvaračem, koji služi kao mobilna faza. Širina zone izdvojene komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Rf vrednosti se izračunavaju za svaku komponentu posebno i na osnovu njih može se izvršiti preeliminarna identifikacija jedinjenja poređenjem sa odgovarajućim standardima (Slika 2.8, desno). Ponekad je poželjno da se koristi komora koja nije zasićena rastvaračima zbog boljeg razdvajanja. Bolje razdvajanje se postiže zbog dužeg vremena razvijanja hromatograma i smanjenog efekta adsorbovanog rastvarača na ploči. Međutim, u ovom slučaju reproduktivnost Rf vrednosti može predstavljati problem. Tankoslojna hromatografija se obično izvodi na sobnoj temperaturi, međutim, razdvajanje komponenti se može poboljšati razvijanjem hromatograma na višoj ili nižoj temperaturi od sobne u zavisnosti od rastvarača koji čine mobilnu fazu. Da bi se povećala efikasnost razdvajanja komponenti, hromatografska ploča se može razvijati na više načina: - više puta u istom pravcu sa istim rastvaračem, - uz stalnu promenu rastvarača, za razdvajanje jedinjenja koja se znatno razlikuju po svojim osobinama, odnosno po brzini kretanja kroz stacionarnu fazu, - sa dva rastvarača u istom ili u dva pravca (dvodimenzionalna hromatografska tehnika). 26

33 Planarna hromatografija Tanki sloj Pare eluenta Eluent Uzorak Slika 2.8. Razvijanje hromatograma i izračunavanje Rf vrednosti Dvodimenzionalna tehnika je poseban vid tehnike i koristi se kod supstanci sa bliskim Rf vrednostima. Kad se završi razdvajanje, ploča se okrene za 90 i protok rastvarača, najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog rastvarača (Slika 2.9). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni rastvarač potpuno ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač. Start Front B Slika 2.9. Dvodimenzionalna tankoslojna hromatografija Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči Ako su analizirane supstance obojene onda su one vidljive i zone se lako mogu obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance bezbojne (nevidljive), koriste se fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona. Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne (supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje 27

34 Planarna hromatografija radioktivnosti. Kada se za određivanje položaja zona jedinjenja koja ne fluoresciraju koristi UV lampa u adsorbens kojim se oblaže ploča se dodaje fluorescentni indikator (kao što je smeša cink i kadmijum sulfida). Dodavanjem fluorescentnog indikatora se postiže da cela ploča fluorescira, a zone se detektuju kao tamne mrlje na ploči. Za bojenje zona koriste se različite hemijske supstance koje se pomoću raspršivača nanose na ploču. Najčešće korišćeni hemijski reagens je jod. Pare joda reaguju sa velikim brojem organskih jedinjenja (ne reaguju sa zasićenim ugljovodonicima i halogenalkanima) i grade komplekse od žute do braon boje. Zone moraju biti odmah označene, jer jod posle nekog vremena sublimuje i mrlje blede i mogu se izgubiti. Često se koristi i koncentrovana sumporna kiselina koja većinu organskih supstanci oksiduje i nakon zagrevanja ploče zone se detektuju kao tamne mrlje. Za određivanje aminokiselina i amina koristi se ninhidrin. Za određivanje steroida i karotenoida se koristi rastvor antimon-hlorida. Indikator bromkrezol zeleno se koristi za detekciju zona koje potiču od karboksilnih kiselina. Za fenole se koristi rastvor gvožđe(iii)- hlorida, 2,4-dinitrofenilhidrazin se koristi za detekciju aldehida i ketona itd Kvantitativna analiza Kao i kod hromatografije na papiru, kvantitativna analiza komponenata može se uraditi na dva načina: direktnim određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom supstance iz zone pogodnim rastvaračem. Supstance se određuju direktno u izdvojenim zonama na ploči pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere transparenciju, refleksiju ili fluorescenciju. Treba napomenuti da merenje propustljivosti može da se koristi samo za vidljivu svetlost, za merenje UV moraju da se koriste kvarcne ploče, jer staklene ploče apsorbuju UV zrake. Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom količinom rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski, spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju - Tankoslojna hromatografija predstavlja ravnotežni sistem tri faze: čvrste (stacionarne), tečne (mobilne) i gasne faze. - Stacionarna faza je samo delimično u ravnoteži sa tečnom fazom pre migracije komponenti analizirane smeše. U zavisnosti od načina razvijanja hromatograma, mobilna faza može biti u ravnoteži sa gasnom fazom ili ne. - Fenomen adsorpcije na čvrstoj fazi je znatno smanjen jer je deo mobilne faze adsorbovan na stacionarnoj fazi. Kao rezultat toga Rf vrednost čistog jedinjenja se neznatno razlikuje od Rf vrednosti istog jedinjenja u smeši. 28

35 Planarna hromatografija Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane U zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju koriste se različite mobilne faze, odnosno stacionarne faze. Tako na primer za razdvajanje amino kiselina se koriste «neutralne mobilne faze» kao što su etanol/voda, propanol/voda ili fenol voda, međutim u takvim mobilnim fazama arginin i lizin migriraju znatno sporije od ostalih amino kiselina. Ako su u mobilnu fazu doda slaba baza (amonijum-hidroksid) ili slaba kiselina (sirćetna kiselina) bolje se razdvajaju kisele odnosno bazne amino kiseline. Dalje, neki vodorastvorni vitamini se bolje razdvajaju na aluminijum oksidu, a ne razdvajaju se na silika gelu, na primer vitamini B1 i B2. Praktično za analizu svake smeše treba odabrati odgovarajuću mobilnu, odnosno stacionarnu fazu u zavisnosti od prirode supstanci koje se analiziraju. U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu hromatografije na tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu se analizirati prirodne komponente hrane, degradacioni proizvodi koji postaju tokom prerade, pripreme, skladištenja, pakovanja i transporta hrane. Zatim, mogu se analizirati aditivi, tragovi veterinarskih lekova, pesticida itd. Na primer u medu su određivani antibakterijski sastojci, ugljovodonici, polifenoli itd. U raži su određivane karboksilne kiseline i estri hidroksicimetne kiseline u listovima raži. U bademu je određivana hlorogena kiselina, a njeni derivati u bambusu. U voćnim sokovima su određivani ekstrakti iz kore citrusa. U različitim prehrambenim proizvodima su određivana etarska ulja. U bezalkoholnim pićima određivani su ne nutritivni zaslađivači. Fenoli su određivani u čaju, bosiljku, maslinovom ulju. U prehrambenim aditivima određivani su fitosteroli, polifenoli itd. U sojinom ulju, ulju od sezama određivani su triacil gliceridi. U životinjskim tkivima (jetri i mišićima) određuju se sulfonamidi. Tankoslojna hromatografija je brza i jeftina metoda za utvrđivanje aflatoksina i drugih mikotoksina u mleku, mlečnim proizvodima, kukuruzu, kikirikiju i proizvodima od kikirikija, kokosu, kakau u zrnu, jajima itd. Ovo su samo neki od mnogobrojnih primera korišćenja tankoslojne hromatografije u analizi prehrambenih proizvoda. Takođe, preparativna tankoslojna hromatografija se koristi za prečišćavanje uzoraka koji se dalje analiziraju i određuju drugim metodama, najčešće instrumentalnim. Rezime poglavlja Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije. Papir koji se koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a stacionarna faza je voda adsorbovana na molekulima celuloze. Količina uzorka za analizu koja se nanosi zavisi od mogućnosti njegove detekcije. Obično se nanosi oko 10 μl rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u obliku kružne mrlje koja sadrži od µg uzorka. Mobilna faza je rastvarač ili smeša rastvarača zasićena vodom. Hromatogram se razvija u hromatografskoj kadi. U zavisnosti 29

36 Planarna hromatografija od načina prolaska mobilne faze kroz hartiju, razlikuju se: horizontalna (kružna), silazna i uzlazna hromatografija na papiru. Hromatogram se izaziva prskanjem hartije nekim reagensom koji daje obojeno jedinjenja ili jedinjenje koje fluorescira u reakciji sa analitom. Hromatografija na tankom sloju izvodi se na tankom sloju stacionarne faze kojom je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala. Uzorak za hromatografisanje se rastvori u rastvaraču koji se može lako upariti a zatim se µl rastvora nanese na 1,5-2 cm od kraja ploče, tako da obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm. Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan. Najčešće se mobilna faza sastoji od dva ili više rastvarača. Hromatogram se razvija u hromatografskoj kadi na više načina i mogu se dobiti jedno- i dvodimenzionalni hromatogrami. U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu hromatografije na tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu se analizirati prirodne komponente hrane, aditivi, tragovi veterinarskih lekova, pesticida, itd. Pitanja za proveru znanja ili diskusiju 1. Od čega zavisi brzina protoka mobilne faze u planarnoj hromatografiji i kako se može menjati? 2. Šta je stacionarna faza kod hromatografije na papiru? Navesti koje vrste međumolekulskih interakcija postoje između stacionarne faze, mobilne faze i analiziranih jedinjenja. 3. Kada i zašto se radi derivatizacija uzorka pre hromatografisanja? Šta se postiže derivatizacijom? Navesti bar tri reagensa za derivatizaciju. 4. Definisati Rf vrednost. Literatura 1. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd, C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, S. Ahuja, Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier Science, San Diego, E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library Volume 69A, Elsevier, Amsterdam,

37 3. Adsorpciona hromatografija u koloni Cilj poglavlja Upoznavanje sa tečno-čvrstom adsorpcionom hromatografijom. Definisanje fizičke i hemijske adsorpcije. Karakterizacija adsorbenasa. Opis tehnike rada i mogućnosti razdvajanja. Tečno - čvrsta adsorpciona hromatografija podrazumeva kolonu pakovanu nekim adsorbentom stacionarna faza, a naneti uzorak se eluira sa nepolarnim rastvaračem mobilna faza, koji pod dejstvom sile gravitacije teče kroz kolonu. Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje komponente smeše. Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstance adsorbensi koje su porozne i imaju veliku aktivnu površinu, a samim tim i površinsku energiju koju teže da smanje, tako što privlačnim silama vezuju molekule ili jone iz gasova ili tečnih rastvora. Pri adsorpciji komponenata iz smeše razlikuju se fizička i hemijska adsorpcija. Fizička adsorpcija se zasniva na uspostavljanju elektrostatičkih (dipol-dipol, Van der Waalsovih) i vodoničnih veza izmeďu stacionarne faze i komponenti, a pri hemijskoj adsorpciji dolazi do stvaranja hemijskih veza usled čega se na površini adsorbensa obrazuje monomolekulski sloj adsorbovane supstance. Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini izmeďu dve faze menja koncentracija date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju izmeďu čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju uz čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Adsorpcija na čvrstim površinama je složen proces, jer zavisi od mnogo faktora kao što su heterogena priroda čvrste supstance koja se menja od aktivnih do manje aktivnih površina, orijentacija adsorbovanih molekula na čvrstoj površini, konkurencija izmeďu molekula rastvarača i supstance za vezivanje za aktivne centre na površini čvrstih čestica itd Stacionarna faza Čvrsta supstanca (adsorbens), koja predstavlja stacionarnu fazu, kod ove vrste hromatografije, je supstanca koja ima osobinu da na svojoj površini adsorbuje rastvoreni uzorak. Koncentracija adsorbovane supstance na površini adsorbensa je u ravnoteži sa koncentrcijom supstance koja se nalazi u rastvaraču mobilnoj fazi. 31

38 Adsorpciona hromatografija u koloni Strukturu adsorbensa sačinjava konglomerat mikro čestica uglavnom sferičnog oblika. Osnovne fizičke karakteristike adsorbensa su specifična površina i zapremina pora. Specifična površina adsorbensa je funkcija veličine čestica, odnosno njihovog prečnika. Pore se stvaraju izmeďu dodirnih tačaka čestica ili dodirnih ivica i površina pojedinih sastavnih jedinica adsorbensa. Zbog toga pore mogu biti različitog oblika ali najčešće preovlaďuju pore jednog oblika. Adsorbensi nemaju pore istog prečnika, kod svakog adsorbensa postoji distribucija prečnika pora u obliku Gausove krive. Struktura i zapremina pora utiču na brzinu uspostavljanja adsorpcione ravnoteže izmeďu koncentracije supstance u stacionarnoj i mobilnoj fazi. Adsorbens treba da sadrži što je moguće manje pora malog prečnika, s obzirom da molekuli supstance teže difunduju u njih. Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri na kojima dolazi do adsorpcije i potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih centara. Drugim rečima, adsorpcione sile zavise od hemijskih osobina adsorbensa, kao i od osobina supstanci koje se adsorbuju, i one predstavljaju površinski afinitet koji izražava adsorpcioni potencijal jednog sistema. Površinski afinitet se u velikoj meri gubi kada je adsorbent pokriven monomolekulskim slojem adsorbovane supstance. Kada rastvor teče preko površine adsorbensa postiže se ravnoteža izmeďu adsorpcije i desorpcije prisutnih supstanci. Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu. Jednu komponentu adsorbens više adsorbuje (onu koja ima veći koeficijent raspodele), a drugu manje (onu koja ima manji koeficijent raspodele). Ako je u pitanju adsorpciona hromatografija na koloni, komponenta koju adorbens više adsorbuje nalaziće se pri vrhu kolone, dok će se komponenta za koju adsorbens ima manju moć adsorpcije spustiti dublje u kolonu. Ako se vrednosti koeficijenata raspodele ispitivanih komponenata dovoljno razlikuju, može se postići njihovo potpuno razdvajanje i pri procesu eluiranja iz kolone prvo izlazi komponenta koja se slabije vezuje za adsorbens Adsorbensi Dobar adsorbent treba da ima veliku površinu sa velikim brojem aktivnih centara. Kao što je već rečeno, adsorpciona moć materijala zavisi od raspoložive površine, hemijske prirode površine i od prethodne pripreme adsorbensa. Najčešće upotrebljavani adsorbensi su aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe, i silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih, upotrebljavaju se još i aktivni ugalj, poli(stiren-divinilbenzen) kopolimer, skrob, celuloza, kalcijumkarbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijum-fosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijumsilikat i drugi Silika-gel Silikagel (SiO 2 x nh 2 O) je jedan od najčešće upotrebljavanih adsorbenasa u hromatografiji. Osnovnu strukturu ovog adsorbensa čine tetraedri silicijuma i kiseonika čiji polimeri obrazuju poroznu strukturu karakterističnu za njegovu unutrašnju površinu. Specifična površina iznosi 32

39 Adsorpciona hromatografija u koloni oko 800 m 2 /g. Za adsorpciju su od značaja hidroksilne grupe vezane za silicijum koji gradi adsorpcionu površinu. Adsorpcija se najčešće ostvaruje preko vodonične veze izmeďu atoma vodonika iz silika-gela i atoma kiseonika (ili nekog drugog elektronegativnog elementa) iz uzorka (Slika 3.1). Tok mobilne faze Komponenta A Površina silika-gela Slika 3.1. Adsorpcija na silika-gelu Aluminijum-oksid Specifična površina aluminijum-oksida iznosi oko 200 m 2 /g. Površina adsorbensa se sastoji od kiseonikovih jona u gornjem sloju i katjona Al 3+ u donjem sloju. Pod normalnim uslovima voda ne stvara hidroksilne grupe na površini adsorbensa ali je prisutna u stanju hemisorpcije. Povećanjem temperature dolazi do delimične desorpcije vode a delimično do obrazovanja hidroksilnih grupa na površini adsorbensa. Joni kiseonika i aluminijuma na površini obrazuju jako elektrostatičko polje koje stvara tri tipa aktivnih centara. Aktivni centri kiselog karaktera stvaraju jako pozitivno polje, centri baznog tipa imaju karakter akceptora protona, dok se treća grupa sastoji od centara akceptora elektrona. Elektrostatičko polje na površini aluminijum-oksida prouzrokuje osnovni mehanizam adsorpcije indukciju površinskog sloja. Aktivitet adsorbensa povećava se sa povećanjem temperature aktiviranja Aktivni ugalj Aktivni ugalj spada u grupu nepolarnih adsorbenata, njegova površina sastoji se uglavnom od ugljenika i do adsorpcije dolazi zahvaljujući disperzionim silama. Iako je osnovna komponenta ugljenik, aktivni ugalj je delimično polarni adsorbens jer se na površini mogu naći oksidi, karbonilne i hidroksilne grupe. Unutrašnja površina aktivnog uglja je izrazito diferencirana sa neravnomernim rasporedom prečnika pora i iznosi od m 2 /g. 33

40 Adsorpciona hromatografija u koloni Magnezijum-oksid Magnezijum-oksid je adsorbent koji je visoko selektivan za dvostruke veze ugljenikugljenik. Pokazuje slabo alkalne osobine i sličan je aluminijum-oksidu. Sa povećanjem temperature od C povećava se adsorpcioni aktivitet, zatim sa daljim povećanjem temperature opada i najzad nestaje na temperaturi od 1000 C Mobilna faza Izbor rastvarača za mobilnu fazu je podjednako važan kao i izbor stacionarne faze. Tečna mobilna faza sastoji se od jednog ili više rastvarača i ona je, sa jedne strane, nosač uzorka kroz adsorbens, a sa druge strane, jedna od dve faze izmeďu kojih dolazi do raspodele komponenti uzorka na osnovu koeficijenata raspodele. Dodatno, osim relativne rastvorljivosti komponenti u eluirajućem rastvaraču, treba voditi računa i o konkurenciji izmeďu rastvorene supstance i rastvarača za adsorpciju na aktivnim centrima na površini stacionarne faze. Rastvarači koji brzo eluiraju supstance sa adsorbensa neće dobro razdvojiti komponente, sa druge strane, ako je eluiranje isuviše sporo, dolazi do širenja zona i nepotrebnog razblaživanja uzorka. Rastvarač ili smeša rastvarača za eluiranje se bira na osnovu osobina komponenti smeše uzorka koji se analizira i osobina stacionarne faze. Mobilna faza treba da rastvara analizirane supstance, kao i da interaguje sa stacionarnom fazom. Ne postoje opšta pravila za izbor mobilne i stacionarne faze, već se na osnovu osobina uzoraka koji se analiziraju biraju odgovarajući adsorbens i rastvarač. Najčešće se kao mobilna faza koriste sledeći rastvarači: petrol-etar, ugljen-tetrahlorid, izopropil-etar, toluen, hloroform, dietil-etar, metil-etil keton, aceton, etil-acetat, dioksan, acetonitril, etanol, metanol, voda. Rastvarači su poreďani po jačini interakcije sa polarnim stacionarnim fazama (aluminijum-oksid i silika gel) Tehnika rada Za adsorpcionu hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih dimenzija. U zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom. Najčešće se puni suspenzijom adsorbensa jer se na taj način omogućava efikasno izdvajanje gasova iz adsorbensa. Osnovno je da kolona bude ravnomerno napunjena, bez mehurica vazduha ili kanala kroz koje može da neefikasno prolazi velika količina mobilne faze. Za unošenje uzorka koriste se tri metode: nanošenje uzorka na vrh sloja adsorbensa, ispod mobilne faze i unošenje uzorka u sloj adsorbensa. Kod prve metode, rastvor uzorka se pažljivo sipa na vrh kolone, posle čega se dodaje mala količina mobilne faze koja prodire kroz sloj adsorbensa zajedno sa uzorkom. Drugom metodom uzorak se unosi u mobilnu fazu iznad površine adsorbensa, ova metoda primenjuje se ako se površina adsorbensa može lako 34

41 Adsorpciona hromatografija u koloni poremetiti. Kod punjenja kolona suvim adsorbensom, uzorak se stavlja na vrh kolone napunjene suvim adsorbensom a zatim se prekriva drugim slojem adsorbensa. Uzorak se sa kolone može eluirati na više načina: običnim eluiranjem, postepenim ili frakcionim eluiranjem i gradijentnim eluiranjem. Obično eluiranje je kontinuirano propuštanje mobilne faze kroz kolonu čime se postiže razdvajanje komponenata. Razdvajanje komponenata neke smeše postupkom eluiranja prikazano je na Slici 3.2. Kada se razdvajanje komponenata u adsorpcionoj koloni završi, njihove zone se mogu odvojiti jedna od druge rezanjem delova kolone koja je prethodno pažljivo izvaďena iz cevi. Nakon ovoga komponente se mogu ekstrahovati iz adsorbensa pogodnim rastvaračem, a zatim analizirati pogodnim fizičkohemijskim metodama kvalitativne i kvantitativne analize. Još jednostavniji način njihovog razdvajanja je da se eluiranje nastavi do izlaska svih komponenata iz kolone, a sve pojedinačne frakcije istih zapremina se sakupljaju pomoću tzv, frakcionog kolektora i posle toga analiziraju. Postepeno ili frakciono eluiranje podrazumeva korišćenje više rastvarača različitih polarnosti kao eluenata. Eluiranje počinje sa rastvaračem najmanje polarnosti, a završava sa rastvaračem najveće polarnosti od upotrebljenih rastvarača. Slika 3.2. Razdvajanje komponenata smeše postupkom eluiranja Gradijentno eluiranje se sastoji u kontinuiranoj promeni sastava mobilne faze što dovodi do promene polarnosti, jonske sile ili ph. Na primer, ako se kao polazni rastvarač za odvajanje na koloni upotrebi etanol, a potrebno je eluirati polarnu supstancu koja se bolje rastvara u vodi (voda je jače eluciono sredstvo), onda je potrebno etanolu dodavati vodu pri čemu se eluciona moć mobilne faze povećava. Kao posledica ovog postepenog povećavanja elucione moći rastvarača dolazi do uzastopnog eluiranja jače adsorbovanih supstanci. 35

42 Adsorpciona hromatografija u koloni Rezime poglavlja Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje prisutna jedinjenja u smeši. Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini između dve faze menja koncentracija date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju između čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju uz čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri na kojima dolazi do adsorpcije i potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih centara. Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu. Najčešće upotrebljavani adsorbensi su aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe i silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih, koriste se još i aktivni ugalj, polistirendivinilbenzen kopolimer, skrob, celuloza, kalcijum-karbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijumfosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijum-silikat i drugi. Za adsorpcionu hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih dimenzija. U zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom. Pitanja za proveru znanja ili diskusiju 1. Objasniti razdvajanje supstanci iz smeše adsorpcionom hromatografijom. 2. Od čega zavisi adsorpcija na čvrstim površinama? 3. Koje su osnovne fizičke karakteristike adsorbensa? 4. Od čega zavise adsorpcione sile i šta one predstavljaju? 5. Nabrojati tehnike za punjenje kolone, nanošenje uzorka i eluiranje. Literatura 1. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd, J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier, Amsterdam, A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, 5th Edition, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey,

43 4. Gasna hromatografija Cilj poglavlja Upoznavanje sa osnovnim principima gasne hromatografije, komponentama gasnog hromatografa, kvalitativnom i kvantitativnom gasnohromatografskom analizom. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda Uvod U gasnoj hromatografiji mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta ili tečna. Stacionarne faze koje su hemijski vezane za zid kolone se takođe često koriste. Kada se tečna faza koristi kao stacionarna faza ili kada čvrsta faza kojom je obložena unutrašnjost kolone postane tečna na radnoj temperaturi, tada se tehnika zove gasnotečna hromatografija (engl. Gas-Liquid Chromatography). Ako je stacionarna faza čvrsta, ova tehnika se zove gasno čvrsta hromatografija (engl. Gas-Solid Chromatography). Obe ove tehnike se često jednostavno nazivaju gasna hromatografija, GC (engl. Gas Chromatography). Gasna hromatografija je prvi put primenjena godine, i opisana u radovima James-a i Martin-a. Tehnika je bila zasnovana na studiji koju su objavili 11 godina ranije Martin i Synge i koja se odnosi na particionu hromatografiju, za koju oni su oni dobili Nobelovu nagradu za hemiju godine. Kao što je ranije pomenuto, stacionarna faza može da bude čvrsta supstanca ili tečnost imobilisana na čvrstoj supstanci. Razdvajanje u gasnoj hromatografiji se zasniva na relativnim pritiscima para komponenti uzorka i njihovom afinitetu za stacionarnu fazu. Praktično, osnova gasnohromatografskog razdvajanja je distribucija analita između dve faze. Jedna od ovih faza je stacionarna faza, a druga faza inertni gas koji zajedno sa parama uzorka čini mobilnu fazu koja se. Prvi gasni hromatograf konstruisan je krajem godine u kompaniji Griffin and George (London, UK). Na Slici 4.1 prikazan je jedan od najstarijih gasnih hromatografa, koji je izložen u Muzeju hemije na Univerzitetu Sapienza u Rimu, Italija. Na Slici 4.2 prikazan je moderni gasni hromatograf sa automatskim unošenjem uzorka (engl. autosampler). Osetljivost, brzina, tačnost i jednostavnost primene metode gasne hromatografije za separaciju, identifikaciju i kvantifikaciju isparljivih jedinjenja, doveli su do izuzetno brzog razvoja ove tehnike. Danas je gasna hromatografija verovatno najrasprostranjenija 37

44 Gasna hromatografija instrumentalna tehnika na svetu. Godišnji rast proizvodnje gasnih hromatografa je iznad prosečnog rasta proizvodnje svih ostalih analitičkih instrumenata. Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih derivata, pesticida i ostataka pesticida, farmaceutskih proizvoda, u, kliničkoj hemiji i brojnim drugim oblastima. Slika 4.1. Gasni hromatograf izložen u Muzeju hemije na Univerzitetu Sapienza u Rimu, Italija Slika 4.2. Moderni gasni hromatograf sa autosemplerom Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su: - Visoka rezolucija - na kapilarnoj koloni dužine 50 m može se lako generisati teorijskih podova i time razdvojiti složene smeše bolje nego bilo kojim drugim, danas dostupnim, tehnikama razdvajanja. - Brzina - najveći broj gasno-hromatografskih analiza može se završiti u vremenu od 1 do 30 minuta. Neke jednostavnije analize mogu se završiti i za nekoliko desetina sekundi. - Osetljivost - korišćenjem plameno jonizujućeg detektora, moguće je merenje milionitih delova (ppm) skoro svih isparljivih organskih jedinjenja. Kada se koristite selektivni detektori kao što su detektori sa zahvatom elektrona i azot-fosforni detektori mogu se rutinski meriti i milijarditi delovi (ppb). - Preciznost i tačnost - g kvantitativnu analizu precizno pod različitim uslovima. Automatizacija i računarska kontrola svih kritičnih hromatografskih parametara je proizvela nivo preciznosti i tačnosti koji je bio nezamisliv pre samo desetak godina. 38

45 Gasna hromatografija 4.2. Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji U literaturi koja se bavi gasnom hromatografijom koristi se veliki broj definicija, termina i simbola koji su, najčešće, kombinacija onih koji se koriste široko i rutinski i onih koje preporučuje Međunarodna unija za čistu i primenjenu hemiju - IUPAC. Koeficijent raspodele ili podeoni koeficijent (K) predstavlja odnos koncentracija uzorka u stacionarnoj (CS) i mobilnoj fazi (CM): K = CS / CM Retenciona zapremina (VR) se definiše na sledeći način: VR = tr x Fc = VM + K x VS gde je: t R retenciono vreme F c protok nosećeg gasa na izlasku iz kolone V M zapremina mobilne faze V S zapremina stacionarne faze K koeficijent raspodele. Zapremina mobilne faze ili mrtva zapremina (VM) izražava se kao: Korigovana retenciona zapremina (V R): VM = tm x Fc V R = VR - VM = tr x Fc tm x Fc = (tr tm) x Fc =t R x Fc =K x VS gde je t R korigovano retenciono vreme Faktor kapaciteta kolone (k ) je mera sposobnosti kolone da zadrži uzorak: k = (tr tm) / tm = t R / tm Retencioni odnos (R): R = tm / t R Normalna distribucija pretpostavlja da će pikovi u hromatogramima biti simetrični i u obliku krive jednačine Gausove raspodele: y = ym exp [- (t tr) 2 / (2F 2 )] 39

46 Gasna hromatografija Signal y zavisi od retencionog vremena i ima maksimalnu vrednost (ym) kada je t = tr. Standardna devijacija Gausove krive je opisana kvadratom F. Ova dva parametra se koriste da se opiše hromatografska širina pika. Za normalnu raspodelu, širina bazne linije, W, ima vrednost 4F, širina na 60,7 % od visine pika je 2F, a širina na polovini visine pika, koja se često izražava kao W1/2, je 2,354 F. Asimetrija pika. Postoje mnogi faktori koji mogu da dovedu do asimetrije pika. U velikom broju slučajeva, pikovi snimljeni sa gasnim hromatografom nemaju oblik Gausova krive. Korišćeno je nekoliko načina za opisivanje (As) koji se d : As = BC / AB gde su AB i BC dva segmenta mereni na 10 % od maksimalne visine, kao što je prikazano na slici X. Za simetrični pik, vrednosti As je 1. 1, respektivno (Slika 4.3). Slika 4.3. Asimetričan hromatografski pik Relativno zadržavanje ili selektivnost kolone, α, se definiše kao odnos korigovanih retencionih vremena ili zapremina dve komponente pod identičnim uslovima. α = t R1 / t R2 = V R2 / V R1 = k 2 /k 1 Kao što je definisano prethodnom 1, što znači da se jedinjenje 2 zadržava duže na koloni od jedinjenja 1. Na vrednost α utiče priroda stacionarne faze i temperatura. Za datu kolonu, α je funkcija temperature. 40

47 Gasna hromatografija Rezolucija : R1,2 = 2 (t R2 t R1) / (W1 + W2) = 2d / (W1 + W2) gde je d rastojanje između maksimuma dva pika a W je širina svakog pika na osnovi. Velika vrednost R1,2, ukazuje na bolje razdvajanje pikova. Za potpuno odvajanje potrebno je da vrednost rezolucije iznosi više od 1,5. Kada se rezolucija smanjuje ispod 1, interferencija između dva pika postaje jača, a dolina između dva pika čak nestaje na R = 0,5. Retencioni indeks. Postoje dve vrste retencionih indeksa, odnosno izotermni retencioni indeks i indeks linearno programirane temperature. Oba indeksa izražavaju karakteristike zadržavanja hemijskog jedinjenja analiziranog na gasnom hromatografu u odnosu na zadržavanje homologne serije normalnih alifatičnih ugljovodonika analiziranih pod istim uslovima. Kod oba sistema retencionih indeksa, analizirano hemijsko jedinjenje je između dva uzastopna alifatična ugljovodonika čije vrednosti retencionih indeksa odgovaraju broju atoma ugljenika u molekulu ugljovodonika pomnoženim sa 100. Izotermni retencioni indeks (RII) je definisan kao logaritamska interpolacija između dva uzastopna alifatična ugljovodonika eluirana neposredno pre i neposredno posle jedinjenja A pod izotermskim gasno-hromatografskim uslovima, i izračunava se za jedinjenje A na sledeći način: RII = 100 x (logv A logv Z) / (logv Z+1 logv Z) x Z gde je: V A korigovana retenciona zapremina jedinjenja A V Z korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z eluiranog neposredno pre jedinjenja A V Z+1 korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z + 1 eluiranog neposredno posle jedinjenja A Z broj ugljenikovih atoma u ugljovodoniku Z Eksperimentalno se izotermni retencioni indeks (RII) određuje na osnovu sledeće jednačine: RII = 100 x [log(ta tch4) - log(tz tch4)] / [log(tz+1 tch4) - log(tz tch4)] x Z gde su ta, tz i tz+1 retenciona vremena jedinjenja A, ugljovodonika Z i Z+1, respektivno. Retencioni indeks linearno programirane temperature se određuje jednačinom: RIP = 100 x (ta tz) / (tz+1 tz) x Z Retencioni indeksi se koriste za identifikaciju analiziranih jedinjenja. 41

48 Gasna hromatografija 4.3. Teorija o gasnoj hromatografiji Koncept teorijskih podova (ili platoa) je odigrao veliku ulogu u razvoju hromatografije. On je prvobitno predložen za merenje performansi procesa destilacije. Koncept se zasniva na pretpostavci da je kolona podeljena u više zona koje se nazivaju teorijski podovi, koji su tretirani kao da postoji savršena ravnoteža između gasa i tečne faze u okviru svakog poda. Ova pretpostavka podrazumeva da koeficijent distribucije ostaje isti od jednog poda na drugi pod i ne zavisi od drugih komponenti uzorka, i da je izoterma distribucije linearna. Međutim, eksperimentalni dokazi pokazuju da to nije tačno. Koncept teorijskih podova zanemaruje da je hromatografija dinamičan proces transfera mase. U principu, nakon injektovanja uzorka, on ulazi u kolonu kao uska zona molekula. Na koloni se zona širi usled interakcija komponenti sa stacionarnom fazom koja neke komponente zadržava više od drugih. Konstantno kretanje mobilne faze obezbeđuje brže razmene molekula analita između mobilne i stacionarne faze i tako smanjuje mogućnost uspostavljanja ravnotežnih koncentracija analita između dve faze. Kao posledica toga, u prednjem delu zone u kojoj je para, preovlađuje prelazak molekula u tečnu fazu, a u zadnjem delu dolazi do suprotnog procesa desorpcije. Na taj način, jedinjenje se pomera kroz kolonu brzinom koja najviše zavisi od njegove rastvorljivosti u tečnoj fazi. Slabije rastvorna jedinjenja provode kraće vreme u koloni od bolje rastvornih jedinjenja. Postoje tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u koloni: uspostavljanje ravnoteže, longitudialna difuzija i vrtložna difuzija. Širenje hromatografske zone usled sporog uspostavljanja ravnoteže prilikom prelaska molekula iz jedne u drugu fazu, pre svega, zavisi od brzine mobilne faze. Brzina kretanja mobilne faze utiče na brzinu kojom molekuli analita mogu da pređu dodirnu površinu faza, a ta brzina zavisi i od kinetike sorpcije, odnosno desorpcije. Zadržavanje supstance u stacionarnoj fazi ne zavisi samo od brzine mobilne faze već i od vremena koje je potrebno da jedan srednji molekul difunduje na površinu mobilne faze iz bilo koje tačke stacionarne faze. Longitudialna difuzija predstavlja difuziju rastvorene supstance u stacionarnu fazu, što takođe dovodi do širenja zone. Longitudialna difuzija je obrnuto proporcionalna brzini protoka mobilne faze. Do vrtložne difuzije dolazi u mobilnoj fazi i ona je posledica različitih dužina puteva kojima molekul može da prođe kroz kolonu. U jednoj hromatografskoj koloni postoji bezbroj puteva kojima molekul može da prođe i oni nisu svi jednake dužine. Zbog toga je nekim molekulima potrebno duže, a nekim kraće vreme da dođu do kraja kolone pa se hromatografska zona širi. Van Demter (van Deemter) je polazeći od ovih faktora izveo kinetičku jednačinu za gasnu hromatografiju: h = A + B/μ +C x μ 42

49 Gasna hromatografija gde je: h dužina kolone podeljena brojem teorijskih podova. A konstanta koja zavisi od vrtložne difuzije (vrtložna difuzija zavisi od: veličine i oblika čestica čvrste faze, načina pakovanja kolone i prečnika kolone). B konstanta koja zavisi od difuzije u nosećem gasu. C konstanta koja je merilo otpora prenosu mase u tečnoj fazi i najviše zavisi od debljine tečnog filma i njegovog viskoziteta. μ linearna brzina kretanja gasa (protok). Grafički prikaz van Demterove kinetičke jednačine dat je na Slici 4.4. Molekulska difuzija Otpor prenosu mase Vrtložna difuzija Slika 4.4. Grafički prikaz van Demterove (van Deemter) kinetičke jednačine 4.4. Gasni hromatograf Osnovne komponente većine gasnih hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom, regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona, termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač. Na Slici 4.5 su prikazane osnovne komponente gasnog hromatografa. PEĆ KONTROLA PROTOKA INJEKTOR KOLONA DETEKTOR ELUENTI OBRADA PODATAKA Slika 4.5. Šema gasnog hromatografa 43

50 Gasna hromatografija Noseći gas Cilindar p i gas se koristi kao izvor nosećeg gasa. Teorijski i gas. Međutim, neka ograničenja moraju biti postavljena kod izbor. Prvo, i gas mora biti inertan, ne treba da reaguje sa analitima i sa bilo kojim komponentama gasnohromatografskog sistema. Drugo, od vrste veoma zavisi osetljivost detekcije. Konačno, i gas da nije otrovan. Najčešće se koriste: helijum, argon, vodonik i azot. Obično, da bi se obezbedio visok kvalitet gasnohromatografske analize, pre injektora se postavlja cev sa adsorbensom (trap), da bi se uklonili trag. Pritisak na početku kolone (nekoliko desetina do nekoliko stotina kpa) se stabilizuje ili mehanički ili putem elektronske kontrole pritiska (EPC) u cilju da protok ostaje konstantan na optimalnoj vrednosti. Ovaj uređaj je izuzetno važan jer ako se analiza vrši sa temperaturnim programiranjem, viskoznost stacionarne faze s bi se eliminisao ovaj efekat. Rezultat je brža analiza i duži životni vek kolone. podešeno da Unošenje uzorka isparivači (injektori) Uloga isparivača (injektora) je da uzorak trenutno prevede u parno stanje. Isparivači su izrađeni od metala. Za jedinjenja koja se razlažu u dodiru sa vrelim metalom u isparivač se ubacuje stakleni umetak, ili se u njega uvlači početak kolone. Tečni uzorci i rastvori čvrstih uzoraka se unose pomoću mikrošpriceva zapremine od µl (Slika 4.6) a gasovi pomoću šprica ili specijalnog sistema slavina. Slika.4.6. Gasnohromatografski špricevi za injektovanje uzoraka 44

51 Gasna hromatografija Za analize većeg broja sličnih uzoraka koriste se uređaji za automatsko injektovanje autosempleri (Slika 4.7). Slika 4.7. Uređaji za automatsko injektovanje - autosampleri Isparivač praktično predstavlja ulaz u hromatograf. Kao što je već rečeno uloga isparivača je da se u njemu uzorak ispari, pomeša sa nosećim gasom i dovede do početka kolone. Karakteristike isparivača i način injektovanja se razlikuju u zavisnosti od tipa kolone. Isparivač, tj. injektor prikazan je na Slici 4.8. Za pakovane i 530 kolone (vidi Odeljak ), kod kojih se obično koristi protok od 10 ml/min, direktno isparavanje je najjednostavniji način da se unese uzorak. Kao isparivač koristi se metalna cev sa staklenim umetkom (engl. liner) koja se zagreva na nešto višu temperaturu od prosečne tačke ključanja komponenti koje se analiziraju. Često se temperatura injektora podešava tako da bude za oko 50 C viša od temperature kolone. Na jednom kraju isparivača nalazi se zaptivač (septum) od termootporne gume, danas se najčeće koriste silikonske gume, kroz koju se pomoću mikro-šprica unosi uzorak. Drugi kraj isparivača direktno je povezan sa kolonom. Kada se injektuje tečnost, ona isparava, meša se sa nosećim gasom i odlazi na kolonu u roku od nekoliko sekundi. Kapilarne kolone imaju mnogo manji kapacitet od pakovanih i za unošenje uzorka u takve kolone je neophodan i poseban razdeljivač protoka (engl. splitter) koji se postavlja između isparivača i kolone. Razdeljivač protoka može da radi u dva režima, sa razdvajanjem ili bez razdvajanja protoka (engl. split ili splitless). Kod režima sa razdvajanjem protoka, noseći gas ulazi u komoru u isparivač gde se meša sa parama isparenog uzorka. Protok nosećeg gasa je regulisan na ml/min. Nakon ulaska u isparivač i mešanja sa uzorkom, jedan deo nosećeg gasa izlazi kroz razdelni (split) ventil, a drugi ulazi u kolonu. Od veličine zazora na razdelnom ventilu zavisi koja će količina nosećeg gasa (i uzorka) otići na kolonu, a koja kroz razdelni ventil van aparata. Ovaj odnos: količina gasa koja ulazi u kolonu/količina gasa koja izlazi kroz split ventil, obično varira od 1:20 do 1:

52 Gasna hromatografija Razdelni (split) odnos se može izračunati na osnovu jednačine: Split odnos = (protok kroz kolonu + protok kroz split ventil) / protok kroz kolonu Gumeni septum Noseći gas Uložak Kolona Slika 4.8. Uređaj za isparavanje uzorka isparivač (injektor) Povećavanjem split odnosa postiže se: bolji izgled pika, smanjuje se opterećenje kolone, snižava se analitička osetljivost, smanjuje se ulazno vreme analita u kolonu i time smanjuje mogućnost termičke degradacije. Osnovne prednosti split režima su: jednostavno korišćenje, uske analitičke zone na koloni, kratko trajanje analize, pogodan za termolabilne uzorke zbog krakog zadržavanja uzorka u zagrejanom injektoru, štiti kolonu od neisparljivih komponenti uzorka i lak je za automatizaciju. Najveći nedostatak ovakvog načina injektovanja je nemogućnost analize tragova supstanci. Danas se većina parametara, kao što su protok nosećeg gasa, split odnos, vreme trajanja split režima itd., automatski određuje uz pomoć odgovarajućih softvera. Split režim (Slika 4.9) se koristi za uzorke koji su prilično koncentrovani - generalno, jedinjenja od interesa su u koncentracijama im od 100 mg/ml. Split ventil je otvoren tokom cele analize. Temperatura injektora bi trebalo da bude dovoljno visoka da ispari sve analite. Početna temperatura kolone treba da bude ispod temperature na kojoj se prvo jedinjenje eluira. Splitless režim (Slika 4.10) je još jedan način da se koristi split/splitless injektor. U ovom režimu, uzorak se ubrizgava dok je split ventil zatvoren. Nakon određenog 46

53 Gasna hromatografija vremena split ventil se otvara kako bi se odstranio višak rastvarača iz injektora. Komponente uzorka se deponuju na početku kolone i najveći deo lako isparljivog rastvarača se odstranjuje. Zbog toga mogu da se injektuju velike količine uzorka i splitless ubrizgavanje se koristi za analizu tragova. Da bi se sprečili gubici lako isparljivih jedinjenja od interesa, tačka ključanja rastvarača treba da bude najmanje 20 C ispod tačke ključanja komponente uzorka sa najnižom tačkom ključanja. Slika.4.9. Split/splitlles injektor u split režimu rada Slika Split/splitlles injektor u splitlles režimu rada Kod injektovanja u splitless režimu, temperatura injektora bi trebalo da bude dovoljno visoka da ispari sve analite, a početna temperatura kolone treba da bude -. Koncentrovanje rastvarača, zatim isparavanje sa porastom temperature kolone, je poznato kao fokusiranje rastvarača (solvent focusing). Otvaranje split ventila je obično oko 0,5-1,0 minuta posle injektovanja, međutim, ovo vreme treba eksperimentalno optimizovati. Ako se split ventil otvori prerano, dolazi do gubitka komponenti od interesa, ako se split ventil otvori prekasno, repovi pika rastvarača prekrivaju komponente koje se najbrže eluiraju. Jedan od glavnih problema splitless režima injektovanja sa zagrejanim injektorom je diskriminacija jedinjenja po molekulskim masama. To znači da ako uzorak sadrži jedinjenja sa širokim spektrom tačaka ključanja, manje količine jedinjenja sa višim tačkama otići u kolonu, u odnosu na isparljivija jedinjenja koja su u 47

54 Gasna hromatografija uzorku. Još jedna mana splitless injekcije je da je vreme boravka u toplom injektoru relativno dugo i termolabilna jedinjenja imaju tendenciju da se raspadaju. Zbog ovih nedostataka, splitless ubrizgavanje se preporučuje za analizu uzoraka u tragovima kod kojih su tačke ključanja komponenti u prilično uskom opsegu i koji ne sadrže komponente koje su termički labilne. Osim pomenutih injektora, danas su upotrebi i injektori koji se mogu zagrevati i hladiti, takozvani PTV injektori (Programmable-temperature vaporizing injectors). Za hlađenje se obično koriste tečni azot ili tečni CO2. Praktično se programiranjem temperature zagrevanja, odnosno, hlađenja injektora eliminišu nedostaci klasičnog split/splitless injektovanja, kao što su diskriminacija jedinjenja po molekulskim masama i slično. Dalje, programiranjem temperature injektovanja omogućava se da se već na početku kolone formira više uskih zona komponenti sličnih tačaka ključanja i na taj način obezbedi njihovo bolje razdvajanje, odnosno da se dobiju uži i oštriji pikovi Unošenje uzoraka gasa Uzorci gasa za gasno-hromatografsku analizu mogu se uneti iz nekoliko različitih izvora: rezervoari gasa, kontejneri za sakupljanje uzoraka gasa, headspace, trapovi i zamke za hvatanje gasova. Vakumski špricevi mogu da se koriste split/splitless u oba režima. Količina uzorka obično varira od 100 μl do 2 ml ili više. Injektovanje vakumskim špricem može da se automatizuje. Špric od 100 μl se može instalirati u nekim autosamplerima koji su dizajnirani za injektovanje tečnih uzoraka. Takođe, postoje neki automatizovani sistemi koji koriste vakumske špriceve koji se mogu zagrevati da bi se sprečila kondenzacija analita u uzorku gasa. Za uzorkovanje gasova često se koriste specijalni ventili sa petljom koja služi da uvede uzorak u kolonu (Slika 4.11). Ventil za uzorkovanje gasova je instaliran na vrhu gasnog hromatografa, obično u svojoj odvojenoj peći sa kontrolom zagrevanja. Čak i kada se sistem stalno koristi za analizu gasova, zagrevanje ventila je poželjno da se spreči kondenzacija vode. Petlja za uzorkovanje gasa je dostupna u različitim veličinama, ali za uvođenje uzorka u gasni hromatograf su tipične zapremine: 0,5 ml, 1 ml i 2 ml. Slika Ventil za uvođenje gasova sa četiri otvora i petljom 48

55 Gasna hromatografija koriste se ventili sa 4-10 otvora. Ventili za uzorkovanje gasova su obično zagrevaju i oni su dizajnirani da rade u određenom temperaturnom opsegu. Dostupni su u širokom spektru veličina za različite veličine kolona, izrađeni su od materijala različite inertnosti. Oni rade ili ručno okretanjem ručice ventila koji rotira jezgro ili automatski sa pogonom koji pravovremeno rotira jezgro tokom analize. Oni mogu biti instalirani u gasni hromatograf i koristiti se umesto injektora za uzorke gasa ili mogu biti eksterni deo uređaja Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim supstancama bez rastvarača Statički Headspace Headspace je metod pripreme uzorka za određivanje isparljivih jedinjenja u čvrstim i tečnim uzorcima. Tehnika se koristi od kasnih 1950-ih do danas. Veoma je popularna tehnika u gasnohromatografskoj analizi zbog svoje jednostavnosti i činjenice da je veoma čist metod uvođenja nepostojanih analita u gasni hromatograf. Sistem za injektovanje i kolona ne zahtevaju praktično nikakvo održavanje. Headspace tehnikom iz uzorka u otvor ventila ili kolonu. Tečni uzorak koji treba da se analizira headspace tehnikom se čuva u termostatiranom kontejneru ili frižideru u dobro zatvorenoj posudi kako se ne bi izgubile lako isparljive supstance. Pre analize, tečni ili čvrsti uzorak se stavlja u ampulu na sobnoj temperaturi, o fazi iznad uzorka dok se ne postigne stanje ravnoteže. U ravnoteži, odnos koncentracije analita u gasovitoj fazi i u tečnoj ili čvrstoj fazi je konstanta. Konstanta se definiše kao koeficijent podele, K: K = CS / CG gde je CS koncentracija analita u uzorku nakon ravnoteže i CG koncentracija analita u gasovitoj fazi posle uspostavljanja ravnoteže. Koeficijent podele se smanjuje sa porastom temperature i takođe varira sa promenama u matriksu. Na primer, kada su organske supstance rastvorene u vodi, dodavanje soli smanjuje K. Kada se dostigne ravnoteža, alikvot gasne faze uzorka se uklanja iz headspace ampule sa vakumskim špricem ili ventilima za uzorkovanje gasova i uzorak se uvodi u gasni hromatograf. Iz gornje jednačine, može se videti da supstance sa veoma visokim podeonim koeficijentom imaju tendenciju da ostanu u fazi uzorka, dok one sa niskim koeficijentom podele imaju tendenciju da se akumuliraju u gasnoj fazi. Dakle, granica detekcije 49

56 Gasna hromatografija Headspace za supstancu kompatibilnu uzorku (manja osetljivost) nego za supstancu nekompatibilnu uzorku (toluen u vodi). Korišćenjem konvencionalne headspace tehnike, koncentracije analita se kreću u opsegu od ppb do %. Headspace tehnika se koristi za određivanje alkohola u krvi, zaostalih rastvarača u farmaceutskim proizvodima i aditiva za poboljšavanje ukusa u hrani Dinamički Headspace Ova tehnika se drugačija naziva očisti i uhvati (engl. purge-and-trap) tehnika. I ak i isparljive supstance se prenose na adsorbent (trap, zamku). Adsorptivni materijal je obično Tenax, sintetički polimer koji ne reaguje sa analiziranim supstancama ali ih efikasno vezuje pod ambijentalnim uslovima i oslobađa ih na povišenoj temperaturi, bez hemijske modifikacije. Kao adsorptivni materijali koriste se još i silika gel, aktivni ugalj i ugljenična molekulska sita. Adsorbens se zagreva i isparljive supstance se oslobađaju ili desorbuju i prebacuju u gasni hromatograf. Posle desorpcije, adsorbens a tokom desorpcije kako bi se uklonili zaostali analiti i vlaga i sistem je spreman za drugo uzorkovanje. Trapovi pakovani sa adsorbensima za specifične primene su komercijalno dostupni. Dinamički headspace generalno omog statičkog headspace, jer ovom tehnikom teoretski treba da se uklone svi analiti iz matriksa, a kod statičkog je ograničeno na uklanjanje jednog alikvota gasovite faze iznad uzorka. Sistemi za dinamički headspace zahtevaju više održavanja od statičkog headspace i podložni su problemima poput penušanja uzorka. U Sjedinjenim Američkim Državama, dinamički headspace je standardni metod za određivanje isparljivih organskih jedinjenja u vodi, dok se u mnogim evropskim zemljama za ovu primenu koristi statički headspace. Druge primene ove tehnike uključuju analizu aroma u hrani i toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction SPME) Metodu mikroekstrakcije na čvrstoj fazi (SPME) je razvio Pavlicin (Pawliszyn) sa saradnicima na Univerzitetu Waterloo u Ontariju, u Kanadi. To je termalna tehnika adsorbcije-desorpcije za određivanje isparljivih supstanci u Headspace iznad vodenih i čvrstih uzoraka ili određivanje semiisparljivih supstanci direktno u vodenim uzorcima. Supelco Analytical (a division of Sigma-Aldrich Co.) je vlasnik Pavlicinovog patenta i kontroliše distribuciju materijala koji se koriste za SPME. Kod ove tehnike koristi se kratka, tanka šipka od topljenog silicijum-dioksida (obično dužine 1 cm i prečnika 0,11 μm) obložena polimerom koji ima ulogu 50

57 Gasna hromatografija adsorbensa. Polimerom obložena šipka silicijum-dioksida (SPME vlakno) je vezana za metalnu iglu i one zajedno čine sklop SPME vlakana, kao što je prikazano na Slici Obojeni šraf Opruga pod naponom Septum Prsten Igla za probijanje septuma Metalna igla SPME vlakno Slika Uređaj za mikroekstrakciju na čvrstoj fazi SPME vlakna su dostupna sa različitim polimerima i različitih debljina premaza. Neka vlakna su obložena smešom adsorbujućih polimera i adsorbujućih jedinjenja vezanih za aktivni ugalj. adsorbujućih polimera su polisiloksani koji se koriste kao stacionarne faze u kapilarnim gasno-hromatografskim kolonama. Sklop SPME vlakana se može koristiti za oko 100 injektovanja. SPME vlakna su instalirana u modifikovanom špricu. U pasivnom položaju, vlakna se nalaze u unutrašnjosti igle. Kod uzorkovanja, vodeni uzorak koji sadrži organska jedinjenja ili čvrsta supstanca koja sadrži isparljiva organska jedinjenja se stavlja u headspace bočicu koja je zatvorena poklopcem sa septumom. Septum se probija iglom i nakon toga se vlakna, uz pomoć klipa, uranjaju direktno u uzorak ili prostor između poklopca i površine uzorka. Organska jedinjenja iz uzorka se apsorbuju na vlaknima. Posle određenog vremenskog intervala, koji se određuje tokom faze razvoja metode za određenu analizu, vlakna se klipom vraćaju u iglu i igla izvlači iz bočice. Odmah nakon toga, iglom se probija septum GC injektora, klip se gura nadole, a vlakna se ubacuju u injektor gde se analiti termalno desorbuju i prebacuju na GC kolonu. Desorpcija obično traje od 1-2 minuta, posle toga se vlakna uvlače u iglu i igla izvlači iz GC injektora. Na slici 4.13 je šematski prikazan ovaj proces. 51

58 Gasna hromatografija Probijanje septuma uzorka Izlaganje SPME vlakna uzorku ekstrakcija analita Uvlačenje vlakna (uklanjanje) Probijanje septuma GC injektora Desorpcija analita Uvlačenje vlakna - uklanjanje Slika Mikroekstrakcija i injektovanje uzorka pomoću uređaja za SPME ih injektora su pogodni za uvođenje SPME uzorka. Injektor treba da bude opremljen staklenom oblogom (liner-om). SPME uzorci daju uske hromatografske pikove, nema naglog povećanja zapremine uzorka izazvanog isparavanjem jer nema rastvarača, odnosno nema potrebe da se uvodi velika zapremina gasa u injektor. Kao statički headspace i SPME tehnika je zasnovana na ravnoteži i ekstrakcija nije potpuna, međutim, rezultati su precizni i u skladu sa drugim analitičkim metodama, i objavljene su niske granice detekcije, reda veličine ppt (part-per-trillion). U literaturi su opisane brojne primene ove tehnike. Neke od tih primena su utvrđivanje aroma, pesticida i isparljivih jedinjenja u ekološkim uzorcima i analiza droge i toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima Gasnohromatografske kolone interaguj (pokretna faza) i dovode do stacionarne faze gde na različit način 4-20 C/min. Postoje dve vrste kolona: pakovane kolone (Slika 4.14) i kapilarne kolone (Slika 4.15). Kod pakovanih kolona stacionarna faza je deponovana ili hemijski vezana na poroznom nosaču. Kod kapilarnih kolona unutrašnji zid kolone je obložen tankim slojem stacionarne faze. Stacionarna faza može biti i hemijski vezana za unutrašnji zid kolone. 52

59 Gasna hromatografija Slika Metalne pakovane gasnohromatografske kolone Slika Kapilarne hromatografske kolone Pakovane kolone Ove kolone, danas se ređe koriste, imaju prečnik 1/8 ili 1/4 inča (3,18 i 6,35 mm) i dugačke su između 1 3 m. Proizvode se od čelika ili stakla, unutrašnji zid cevi se tretira da se izbegnu katalitički efekti sa uzorkom. One mogu da izdrže protok gasa u opsegu ml/min. One su punjene inertnim i stabilnim poroznim nosačem na kome stacionarna faza može biti impregnirana ili hemijski vezana (između 3 i 20 %). Potrebno je da čvrsti nosač zadovolji neke zahteve od kojih su najvažniji sledeći: - velika specifična površina od 2 8 m 2 /g, - da se sastoji od sfernih čestica ujednačene veličine i prečnika, najčešće 0,2 mm, - ujednačena veličina pora po površini čestica (prečnik pore 10 μm) - inertnost, minimalna hemijska i adsorptivna interakcija sa uzorkom, - mehanička jačina, ne sme da se mrvi prilkom punjenja kolone. Najveći broj čvrstih nosača se dobija od takozvane dijatomejske zemlje ili kizelgura. To je skelet dijatoma, monoćelijske alge, koji se sastoji najvećim delom iz mikroamorfnog hidratisanog silikata (sadrži oko 90 % SiO2). Ostatak čine metalni oksidi: 53

60 Gasna hromatografija Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO i MgO. Ovaj materijal je veoma porozan i ima veliku aktivnu površinu. Čvrsti nosači koji se dobijaju od dijatomejske zemlje, ima ih više tipova, komercijalno su poznati pod imenom Chromosorb. Razvijeni su i drugi sintetički materijali na bazi SiO2, kao što je Spherosil, koji se sastoji od sitnih perli silicijum-dioksida. Postoje i čvrste faze napravljene od umreženih kopolimera stirena i divinilbenzena, kod kojih veličina pora zavisi od odnosa stiren/divinilbenzen i oni su komercijalno dostupni pod nazivima Chromosorb i Porapak Q, R S, N i T. Kod njih veličina šupljina između polimernih lanaca zavisi od odnosa stiren/divinil benzen, što je udeo divinil benzena veći, prečnik pora je manji. Veličina pora kod ovih nosača se kreće od 0,01 do 0,35 μm, a aktivna površina iznosi od m 2 /g. Ovakvi čvrsti nosači mogu da se koriste i kao stacionarne faze. Da bi im se povećala polarnost u njih se ugrađuju polarni vinil-monomeri, koji se dodaju pre polimerizacije. Za ovu svrhu se koriste: akrilonitril, akrilatni estri, vinil-pirolidon i etilen-glikol-dimetil-akrilat. Pakovane kolone se najčešće koriste za analizu gasova. Kolone pakovane sa poroznim polimerima, sa i bez stacionarne faze, se preporučuju za analizu vodenih rastvora polarnih organskih jedinjenja koja mogu da grade vodonične veze, kao što su amini, alkoholi, glikoli i slobodne kiseline Kapilarne kolone Kapilarna GC kolona se sastoji od dva glavna dela: cevi i stacionarne faze. Unutrašnji zid cevi malog prečnika (0,05 do 0,53 mm) je obložen tankim filmom (0,1 do 10,0 μm) termički stabilnog polimera velike molekulske mase. Ovaj polimerni premaz predstavlja stacionarnu fazu. Dužine kapilarnih kolona kreću se od 10 do 120 m. Poprečni presek kapilarne hromatografske kolone prikazan je na Slici Kolone su obično napravljene od stopljenog silicijum-dioksida najviše č e, dobijenog sagorevanjem tetrahlorosilana (SiCl4) u atmosferi bogatoj kiseonikom. Stopljeni silicijum-dioksid je lako lomljiv i teško se savija. Fleksibilnost kolona se postiže tako što se spoljašnji zid kolone oblaže poliamidom, termički stabilnim polimerom koji podnosi temperature do 370 C ili tankim aluminijumskim filmom. a) b) Slika Poprečni presek kapilarne hromatografske kolone a) bez stacionarne faze i b) sa stacionarnom fazom 54

61 Gasna hromatografija Kolone se namotavaju oko metalnog nosača koji sprečava da dodje do njihovog mehaničkog oštenja tokom namotavanja (vidi sliku 4.15.). Neki proizvođači nude kolone napravljene od metala (aluminijum, nikl ili čelik) koje mogu da se koriste na visokim radnim temperaturama reda veličine 450 C, pod uslovom da je stacionarna faza dovoljno stabilna. Unutrašnja površina kolone se obično tretira da se omogući vezivanje sa stacionarnom fazom. Tretman može biti hemijski (HCl na 350 C), ili podloga od tankog sloja glinice ili silika gela u zavisnosti od tehnike koja se koristi za nanošenje stacionarne faze. Debljina sloja glinice ili silika gela može da varira između 0,05 i 5 μ. Na osnovu načina oblaganja untrašnjeg zida kolone one se mogu podeliti na: - otvorene kolone sa zidom obloženim tečnom stacionarnom fazom (Wall-coated open tubular WCOT) - otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem koji obložen tečnom stacionarnom fazom (Support-coated open tubular - SCOT) - otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem (Porous-layer open tubular - PLOT). Slika Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona dat je na Slici Kovalentno vezivanje građenjem Si - O - S - da se vežu na površinu silika gela. zid kolone tečna stacionarna faza porozni nosač porozni nosač obložen stacionarnom fazom Slika Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona Poseban tip kapilarnih kolona su kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,53 mm (530 μm kolone) i dužinom od 5 do 50 m. Poprečni presek kapilarne kolone prikazan je na Slici Te kolone su, u zavisnosti od proizvođača i njihovih glavnih karakteristika poznate po k 5 ml/min do 15 ml/min, približno protoku koji se koristi u pakovanim kolonama. Međutim, rezolucija i performanse ovih kolona su 55

62 Gasna hromatografija slabije od kapilarnih starijim hromatografima zamene sa 530 μm kolonama, uz korišćenje istih injektora, detektora i protoka. Njihova glavna prednost nad pakovanim kolonoma je što kod njih ne dolazi do progresivnog gubitka stacionarne faze sa vremenom. Ove kolone mogu i da se pakuju ali se to radi vrlo retko. Poliimidna prevlaka Staklo d C, Unutrašnji prečnik kolone d f, Debljina filma Stacionarna faza Stacionarne faze Slika Poprečni presek kapilarne kolone U literaturi je za pakovane kolone, za koje su tehnike impregnacije vrlo jednostavne, predloženo preko 100 stacionarnih faza različitih tipova. S druge strane, za vezanu fazu na kapilarnim kolonama izbor stacionarne faze je ograničen zbog toga što nanošenje filma na unutrašnju površinu kolone zahteva različit princip od impregnacije. Najveći broj stacionarnih faza koje se danas koriste su polisiloksani i polietilenglikoli, koji su manje ili više hemijski i strukturno modifikovani. Za proučavanje optički aktivnih jedinjenja (razdvajanje enantiomera), se koriste posebne faze koje sadrže sadrže ciklodekstrine. Svaka od ovih faza može da se koristi između minimalne temperature ispod koje se ravnotežna koncentracija suviše sporo uspostavlja i maksimalne temperature iznad koje dolazi do degradacije polimera. Maksimalna temperatura na kojoj kolona može da se koristi zavisi od prirode polimera i debljine filma. Svaka stacionarna faza ima preporučeni opseg radnih temperatura. Ispod minimalne temperature, viskoznost faze je velika i difuzija analita između stacionarne i mobilne faze je otežana. Kad se kolone zagrevaju, one počinju da cure, to jest, deo faze se gubi iz kolone (Slika 4.19). To može biti gubitak hemijski nepromenjene faze ili dolazi do razgradnje lanca polimera koja čini stacionarnu fazu (Slika 4.20). Razgradnjom polimera nastaju isparljiva jedinjenja sastavljena od tri, četiri, pet ili više monomernih jedinica. Ova jedinjenja daju neželjene pikove na hromatogramu. Prisustvo kiseonika i vode u koloni može pospešiti razgradnju polimera. Iznad maksimalne temperature, curenje kolone postaje intenzivno 56

63 Gasna hromatografija i to uje radni vek kolone i daje veliki broj neželjenih pikova. Kolone sa polarnim stacionarnim fazama imaju tendenciju da cure više nego kolone sa nepolarnim stacionarnim fazama. Poliimid Poliimid Poliimid Film Oštećenje filma Oštećenje filma Staklo Staklo Staklo Aktivna površina Slika Šematski prikaz preseka kapilarne kolone bez i sa oštećenjima T Slika Degradacija polsiloksanske stacionarne faze Debljina stacionarne faze je takođe važna za izbor radne temperature kolone. U principu, tanka stacionarna faza (~0,2 μm ) je poželjna za rad jer kolona manje curi. Tanak film stacionarne faze je dobar za razdvajanje jedinjenja sa visokim tačkama ključanja ali za za razdvajanje jedinjenja sa niskim tačkama ključanja, potreban je deblji film stacionarne faze (1,0 μm) da se obezbedi dovoljno zadržavanje jedinjenja koja se razdvajaju Čvrste stacionarne faze Čvrste stacionarne faze se prave od razl : silicijumdioksida ili aluminijum-oksida, deaktiviranih mineralnim solima, molekulskih sita, poroznog stakla, grafita (Chromosorb 100, Porapak ), kao i čvrste faze napravljene od umreženih kopolimera stirena i divinilbenzena (Chromosorb i Porapak Q, R S, N i T). Kapilarne kolone napravljene taloženjem ovih materijala u obliku finog poroznog sloja nazivaju se PLOT (Slika 4.17). One se koriste za razdvajanje gasovitih ili nestabilnih uzoraka. Kolone koje sadrže grafit su razvijene za analizu N2, CO, CO2 i gasovitih ugljovodonika. Efikasnost ovih kolona je veoma visoka. 57

64 Gasna hromatografija Tečne stacionarne faze Čvrsti nosač obložen tečnom fazom je jednostavan primer tečne stacionarne faze. Priprema se tako što se napravi rastvor tečne faze u isparljivom rastvaraču, zatim doda čvrsti nosač u rastvor, dobro izmeša, a zatim se rastvarač ukloni isparavanjem. Ovi materijali izgledaju suvo čak i sa relativno visokim udelom tečne faze, i mogu lako da se pakuju u kolonu. Punjenja sa niskim udelom tečne faze daju visoku efikasnost i koriste se za jedinjenja sa visokim tačkama ključanja, dok se punjenja sa visokim udelom tečne faze koriste za lako isparljiva jedinjenja i gasove. Dobra stacionarna faza u gasno-tečnoj hromatografiji karakteristike: - zanemarljiv napon pare na radnoj temperaturi, - dobru stabilnost na radnoj temperaturi, - uzorci treba da imaju umerenu rastvorljivost u stacionarnoj fazi, - komponente uzorka treba da pokazuju različite koeficijente distribucije. Jedna od velikih prednosti gasne hromatografije je da se supstance sa istim ili sličnim naponom pare mogu dobro razdvojiti stacionare faze. Raznovrsnost i selektivnost gasne hromatografije leži u širokom izboru stacionarnih faza. Stacionarne faze pokrivaju širok spektar, od nepolarnih dimetil-polisiloksanado visoko polarnih polisiloksana i polihidroksilnih jedinjenja kao što je polietilen-glikol (Carbowax 20M). Polisiloksani (takođe poznati kao silikoni, silikonska ulja ili silikonske gume) su polimeri kod kojih lanci izgrađeni od alternirajućih veza silicijuma i kiseonika, -Si-O-, i gde se na svakom atomu silicijuma nalaze po dve alkil, aril ili neke druge funkcionalne grupe. Najčešće su to kopolimeri polidimetilsiloksana i nekog drugog dialkil- diaril- ili alkil/aril-polisiloksana. Postoji oko 20 različitih kombinacija alkil i aril supstituenata (najčešće su to metil i fenil) na koje se mogu dalje ugraditi funkcionalne grupe (npr. cijanopropil, trifluropropil itd.). Monomeri kombinovani u promenljivim molskim odnosima dovode do promena u osobinama stacionarnih faza (polaritet, interval stabilnosti, odnosno radne temperature, koji se npr. menja od -50 do 300/325 C). Strukture najčešće korišćenih polisiloksanskih polimera i kopolimera prikazane su u Tabeli 4.1. Zbog njihovog veoma širokog opsega radnih temperatura ove faze su najrasprostranjenije u gasnoj hromatografiji. Slika Struktura polisiloksanskog kopolimera 58

65 Gasna hromatografija Polietileneglikoli (PEG) se koriste za dobijanje polarnih stacionarnih faza. Najpoznatiji predstavnik ove grupe polimera je Carbowax. Ovi polarni polimeri (npr. Mr = 1500 do za Carbowax 20M) mogu se koristiti za nanošenje, impregnaciju ili kao vezana faza. Njihove radne temperature su niže od polsiloksana i iznose od 40 C do 260 C, u zavisnosti od prečnika kolone i debljine filma. Struktura i osobine najčešće korišćenih polietilenglikola prikazani su u Tabeli 4.1. Tabela 4.1. Struktura i svojstva tečnih faza u gasnoj hromatografiji Struktura tečne faze Sastav kopolimera m = 5% n = 95% Polarnost Maksimalna Komercijalna imena temperatura *1 kolona nepolarna 340/360 C OPTIMA(1/1MS), PERMABOND SE30, OV1, DB 1, SE 30,HP 1,SPB 1, CP-Sil 5 CB, Rtx -1, 007 1, BP1, MDN-1, AT - 1, ZB-1, OV-101 slabo polarna 340/360 C OPTIMA 5, PERMABOND SE-52, SE-54, SE 52, DB 5, HP-5, SPB-5, CP Sil 8, Rtx 5, 007-5, BP5, MDN 5, AT 5, ZB-5 m = 5% n = 95% m +n = 5% o = 95% slabo polarna slabo polarna 340/360 C OPTIMA(5MS), DB-5MS, HP-5MS, Ultra-2, Equity - 5, CP-Sil8CB low bleed/ms, Rtx -5SIL-MS, Rtx -5MS, 007-5MS, BPX5, MDN-5S, AT -5MS, VF-5MS, DB-XLB, Rtx - 340/360 C XLB, MDN-12, VF-XMS. m = 6% n = 94% m = 14% n = 86% m+n= 35% o = 65% polarna 300/320 C OPTIMA(1301/624) HP- 1301, DB-1301, SPB 1301, Rtx 1301, CP-1301, HP-624, HPVOC, DB- 624, DB-VRX, SPB-624, CP- 624, Rtx -624, Rtx - Volatiles, , BP624, VOCOL polarna 300/320 C OPTIMA 1701, OV- 1701, DB-1701, CP Sil 19 CB, HP-1701, Rtx , SPB-1701, , BP10, ZB-1701 polarna 360/370 C OPTIMA 35MS, DB-35 MS, HP-35, SPB-35, Rtx-35, , BPX-35, MDN-35, AT-35 MS, ZB-35, OV-11, VF-35 MS 59

66 Gasna hromatografija Struktura tečne faze Tabela 4.1. nastavak Sastav Polarnost Maksimalna Komercijalna imena kopolimera temperatura *1 kolona polarna 320/340 C OPTIMA 17, OV-17, DB-17, HP 50+, HP-17, jako polarna SPB 50, SP-2250, Rtx -50, CP-Sil 24 CB, , ZB /280 C OPTIMA 210, OV-210, DB-210, Rtx -200, m = 33% n = 67% jako polarna jako polarna 260/280 C OPTIMA 225, DB-225, HP-225, OV-225, Rtx - 225, CP-Sil 43, , BP /280 C OPTIMA 240 *1 prva temperatura je za izotermalne programe jako polarna jako polarna 250/260 C OPTIMA WAX, DB- Wax, HP Wax, Supelcowax,, Rtx Wax,CP-Wax 52 CB, Stabilwax, 007-CW, BP20, AT -Wax, ZB-Wax 250/260 C OPTIMA FFAP, PERMABOND FFAP, DB- FFAP, HP FFAP, CP-SIL 58 CB, 007-FFAP, CP- FFAP CB, Nukol Selektivnost stacionarne faze Za pravilan izbor stacionarne faze potrebno je dobro poznavanje hemijskih i fizičkih osobina komponenti uzorka koji se analizira. Takođe su potrebni literaturni podaci o sličnim uzorcima i podaci dobijeni u eksperimentalnom radu. S : - Treba dobro da rastvara komponente uzorka, jer će se komponente sa slabom rastvorljivošću brzo eluirati. - Neophodno je da dobro razdvaja komponente uzorka, a razdvajanje zavisi od njihovih podeonih koeficijenata. - Treba da ima dobru termičku stabilnost termičku nestabilnost može izazvati katalitički uticaj čvrstog nosača pri visokim temperaturama. 60

67 Gasna hromatografija - Treba da pokazuje slabu isparljivost, odnosno stacionarna faza treba da bude neisparljiva i njen napon pare na radnoj temperaturi treba da bude od 0,01 do 0,1 mm. - Treba da bude hemijski inertna u odnosu na komponente uzorka na radnoj temperaturi. Kao što je već rečeno, važno je poznavanje hemijske prirode komponenti uzorka. Ako ova informacija nije dostupna, neophodno je da se uzorak analizira na kolonama različite polarnosti, jednoj nepolarnoj i najmanje dve polarne od kojih jedna sadrži stacionarnu fazu sa elektron donorskim, a druga stacionarnu fazu sa elektron akceptorskim svojstvima, kako bi se osiguralo da sve komponente budu eluirane i detektovane. Tako dobijeni hromatogrami mogu da pruže dosta informacija o prirodi komponenti i da posluže kao polazna osnova za izbor kolone sa odgovarajućom tečnom fazom. Osnovni princip je da se pokuša da se klasifikuje uzorak u jednu od pet grupa, na osnovu polarnosti njegovih komponenti. 1. Jako polarna jedinjenja. U ovu grupu spadaju voda i polifunkcionalna jedinjenja koja u svom molekulu sadrže više aktivnih vodonikovih atoma i koja su sposobna da grade više vodoničnih veza. Takva jedinjenja su: voda, glicerol, amino alkoholi, hidroksi kiseline, dikarboksilne kiseline i polifenoli. 2. Polarna jedinjenja. Ovu grupu čine jedinjenja koja sadrže aktivni vodonikov atom i jako elektronegativni atom sa slobodnim elektronskim parom (O, N ili F). Najveći broj ovih jedinjenja, takođe može da gradi vodonične veze. Takva jedinjenja su: alkoholi, fenoli, masne kiseline, primarni i sekundarni amini, nitro jedinjenja sa α vodonikovim atomom i nitrili sa α vodonikovim atomom. 3. Umereno polarna jedinjenja. Ova jedinjenja sadrže jako elektronegativni atom sa slobodnim elektronskim parom ali ne sadrže aktivne vodonikove atome. Takva jedinjenja su: aldehidi, ketoni, etri, estri, tercijarni amini, nitro jedinjenja bez α vodonikovog atoma i nitrili bez α vodonikovog atoma. 4. Slabo polarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja sa slabo aktivnim vodonikovim atomima ali bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovu grupu spadaju: halogenovani ugljovodonici, aromatični ugljovodonici i alkeni. 5. Nepolarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja bez aktivnog vodonikovog atoma i bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovi grupu spadaju: zasićeni ugljovodonici, merkaptani, sulfidi i potpuno halogenovani ugljovodonici, kao CCl4. Nije lako kvantifikovati polarnost stacionarne faze u gasnoj hromatografiji. Pojam polarnosti tečne faze se, na neki način, razlikuje od klasične definicije polarnosti izražene preko dipolnih momenata i on obuhvata sumu više efekata od kojih zavise retenciona vremena. Polarnost je određena i međumolekulskim interakcijama, koje su veoma složene prirode i često ih je teško predvideti u hromatografskom sistemu. Intermolekulske interakcije mogu da igraju značajnu ulogu u gasnoj hromatografiji 61

68 Gasna hromatografija (detaljno su opisane u Poglavlju ). Na primer, kod tečnih faza koje sadrže slobodne hidroksilne grupe, polarnost zavisi, kako od dipolnih momenata, tako i od mogućnosti građenja vodoničnih veza sa komponentama uzorka. Prema polarnosti, tečne stacionarne faze u gasnoj hromatografiji se dele na više načina. Jedna od podela prikazana je u Tabeli 4.1., a po drugoj dele se na: - Polarne sadrže veliki broj polarnih grupa (npr. polietilen-glikol). - Nepolarne ne sadrže polarne grupe (polidimetilsiloksan). - Srednje polarne po broju polarnih i polarizabilnih grupa se nalaze između polarnih i nepolarnih. Razdvajanje na gasnohromatografskoj koloni zavisi od vrste i jačine međumolekulskih interakcija između komponenti uzorka i tečne stacionarne faze, kao i od tačaka ključanja komponenti uzorka. Zbog toga, što su međumolekulske interakcije najače između molekula sličnih po strukturi, sledi pravilo da se najbolja gasnohromatografska odvajanja postižu na tečnim fazama koje su po polarnosti slične komponentama uzorka. Pri izboru tečne faze neophodno je da se vodi računa da ona ne interaguje suviše jako sa komponentama smeše, što bi kao posledicu imalo suviše duga retenciona vremena ili trajno zadržavanje komponente na koloni. Svako građenje adicionog jedinjenja sa tečnom fazom je nepoželjno zbog nepovratne adsorpcije datog jedinjenja i, samim tim, nepovratnog oštećenja kolone. Zbog toga, ako je neka od komponenti bazna, tečna faza mora imati takođe bazna (elektron-donorska) svojstva. Kada se razdvajaju kisela jedinjenja preporučuju se tečne faze sličnog (elektron-akceptorskog) karaktera ili one koje nisu isuviše bazne. Na Slici 4.22 su prikazani hromatogrami smeše jedinjenja koja se sastoji, po prethodno navedenoj podeli, od nepolarnih alkana (1, 2, 8, 9, 10), umereno polarnih estara (6,7), umereno polarnog ali jako baznog dimetilanilina (4) i polarnih (po funkcionalnoj grupi) alkohola i primarnog amina (3, 5). Decilamin i 1-oktanol sadrže izrazito polarne funkcionalne grupe sa aktivnim vodonikovim atomom i elektron donorskim atomom azota, odnosno kiseonika, ali je zbog veličine molekula doprinos ovih grupa ukupnoj polarnosti molekula mala i ti molekuli se ponašaju kao slabo polarni. Sa Slike 4.22 se vidi da je raspored pikova alkana, bez obzira na stacionarnu fazu, uvek identičan i da se oni eluiraju po rastućim molekulskim masama, odnosno tačkama ključanja. Najbrže se eluiraju na polarnim kolonama, a najveća retenciona vremena imaju na nepolarnoj koloni, što je u potpunosti očekivano na osnovu njihovih i osobina stacionarne faze. Alkohol i primarni amin su polarniji od alkana i iz tog razloga, na polarnim kolonama, imaju veća retenciona vremena od komponenti 1 i 2, ali manja od alkana 8, 9 i 10, zbog mnogo manjih molekulskih masa. Takođe na svim kolonama jedinjenja 3 i 5 imaju manja retenciona vremena od estara 6 i 7, bez obzira na veću polaranost u odnosu 62

69 Gasna hromatografija na njih. Ovo je očigledan primer kompleksnosti razdvajanja na gasnohromatografskoj koloni i uticaja različitih faktora. U zavisnosti od veličine molekula i polarnosti jedinjenja imamo različita retenciona vremena na različitim stacionarnim fazama. Hromatogram *1, *2 Stacionarna faza Opis S.F. Polarnost m = 33% n = 67% m = 14% n = 86% m = 5% n = 95% *1 - Uzorak: 1. Undekan - C 11H 24; 2. Dodekan - C 12H 26; 3. Oktanol - C 8H 17OH; 4. Dimetilamin - C 6H 5N(CH 3) 2; 5. Decilamin - C 10H 21NH 2; 6. Metildekanoat - C 9H 19CO 2CH 3; 7. Metilundekanoat - C 10H 21CO 2CH 3; 8. Heneikozan - C 21H 44; 9. Dokozan - C 22H 46; 10. Trikozan - C 23H 48 *2 - Svi hromatogrami su snimljeni pod istim uslovima: sve kolone su imale istu debljinu filma stacionarne faze, istu dužinu i isti prečnik, injektovana je uvek ista količina uzorka u istom režimu (split 1:50), pritisak nosećeg gasa je bio isti za sve kolone, korišćen je uvek plameno jonizacioni detektor i rađeno je u izotermalnom režimu. Slika Poređenje selektivnosti različitih stacionarnih faza pod istim hromatografskim uslovima 63

70 Gasna hromatografija Posebno je zanimljivo ponašanje dimetilanilina, odnosno njegova retenciona vremena na različitim stacionarnim fazama. Na dve najpolarnije kolone dimetilanilin ima najveća retenciona vremena u odnosu na ostale komponente (8, 9 i 10 imaju mnogo veće molekulske mase). Na sledeće tri po polarnosti ima manja retenciona vremena od estara jer ovde dominiraju molekulske mase u odnosu na polarnost ali još uvek se međumolekulske interakcije dovoljno jake da ima veće retenciono vreme u odnosu na primarni amin veće molekulske mase. Na slabo polarnoj i nepolarnoj koloni imamo, očekivani, redosled po molekulskim masama jer su tu interakcije između jedinjenja iz smeše i stacionarne faze zanemarljive i utiču samo na apsolutni iznos retencionih vremena. Interesantno je poređenje retencionog vremena dimetilanilina na stacionarnoj fazi od poli(trifluoropropilmetilsiloksana) i stacionarnoj fazi od poli(metilfenilsiloksana). Na manje polarnoj ali hemijski sličnoj poli(metilfenil-siloksanskoj) fazi (prisustvo aromatičnog jezgra), dimetilanilin ima veće retenciono vreme. Kao što je već rečeno, za dobro razdvajanje i uspešnu analizu smeše neophodno je poznavanje fizičko-hemijskih osobina jedinjenja u smeši, kao i osobina tečnih stacionarnih faza u kolonoma. Važno je napomenuti da se danas proizvode kolone sa stacionarnim fazama koje su hemijski modifikovane, aktivirane ili dezaktivirane, i da je danas dostupno preko 200 različitih tipova kolona. Proizvođači u katalozima daju mnoštvo informacija o osobinama tih kolona, na osnovu kojih se možemo odlučiti za izbor odgovarajuće kolone Detektori u gasnoj hromatografiji Detektor je direktno povezan sa izlazom kolone, tako da sve što je sa nje eluirano prolazi kroz njega. U gasnoj hromatografiji se koristi veći broj različitih detektora, mnogi od ovih detektora, osim termoprovodljivog detektora, su posebno razvijeni za gasnu hromatografiju. Uglavnom se primenjuju takozvani diferencijalni detektori čiji se princip rada zasniva na neprekidnom merenju nekog fizičkog svojstva nosećeg gasa koje je u direktnoj vezi sa koncentracijom ili masom pare u njemu. Neki od ovih detektora su navedeni u Tabeli 4.2. U principu, oni se mogu klasifikovati na osnovu toga da li se mogu koristiti za sve klase jedinjenja ili da li su selektivni za datu klasu jedinjenja. Tabela 4.2. Primena komercijalno dostupnih detektora za gasnu hromatografiju Detektor Primena Termoprovodljivi detektor (TCD) Univerzalni Plameno jonizacioni detektor (FID) Sagorljiva organska jedinjenja Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) Halogenovana jedinjenja Fotojonizacioni detektor (PID) Aromatična jedinjenja Detektor sa alkalnim plamenom (NPD) N-, P-, i halogena organska jedinjenja Plameno fotometrijski detektor (FPD) S- i P-, organska jedinjenja Maseni spektrometar (MSD) Univerzalni 64

71 Gasna hromatografija Osnovne karakteristike tri detektora su sledeće: - Termoprovodljivi detektor (Thermal conductivity detector - TCD) - može se smatrati univerzalnim detektorom koji reaguje na koncentraciju i opšte osobine, nije destruktivan. - Plameno-jonizacioni detektor (Flame ionization detector - FID) - je selektivan za ugljenična jedinjenja, reaguje na protok mase i specifične osobine, destruktivan je. - Detektor sa zahvatom elektrona (Electron capture detector - ECD) - je selektivan za halogena jedinjenja, reaguje na opšte osobine, nije destruktivan. Granica detekcije je ona količina supstance na koju detektor reaguje dajući pik čija je visina najmanje dva puta veća od visine bazne linije. Za granicu detekcije se u literaturi koriste sledeći termini: minimalna detektovana količina (engl. minimal amount detected - MAD), minimalna granica detekcije (Minimum limit of detection - MLD) ili limit detekcije (Limit of detection - LOD). U principu, poželjno je da se vrednost granice detekcije utvrdi eksperimentalno. U daljem tekstu će termin povećanje granice detekcije podrazumevati veću osetljivost detektora, odnosno, sposobnost detektora da registruje manju količinu supstance. Termoprovodljivi detektori mogu da detektuju količinu analizirane supstance do reda veličine 100 ppm. To je praktično univerzalni detektor koji radi na merenju razlike u električnoj provodljivosti nosećeg gasa sa uzorkom i čistog nosećeg gasa. Plameno-jonizacioni detektor može detektovati male količine, reda veličine ppm,. Uzorak na izlasku iz kolone se uvodi u plamen koji izaziva jonizaciju uvedenog jedinjenja i zatim se meri električna provodljivost nosećeg gasa, koja je direktno proprcionalna broju jona. Ovaj tip detektora daje slab odgovor na neka jedinjenja, kao što su na primer heterociklična jedinjenja azota. Posebni detektori, kao što su detektori sa zahvatom elektrona, mogu detekovati izuzetno male količine, reda veličine ppb, odgovarajućih halogenih jedinjenja. Granice detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji su date na Slici Slika Granice detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji 65

72 Gasna hromatografija Termoprovodljivi detektor Kao što je već pomenuto, termoprovodljivi dnosu na toplotnu provodljivost. Detekcija se zasniva na činjenici da brzina prelaska toplote sa zagrejanog tela na okolni gas zavisi od sastava gasa. Najveći deo toplote odvodi se procesom termičke provodljivosti koji zavisi od broja sudara molekula gasa, u jedinici vremena, sa zagrejanim telom, to jest od pokretljivosti molekula gasa. Zbog toga najveću toplotnu provodljivost pokazuju gasovi sa najmanjim, samim tim najpokretljivijim molekulima, kao što su vodonik i helijum. Detektor se sastoji od metalnog bloka u kome se nalaze četiri ćelije. Presek ćelije prikazan je na Slici Blok detektora Slika Blok termoprovodljivog detektora sa četiri ćelije Dve ćelije su merne i kroz njih protiče gas sa gasnohromatografske kolone (noseći gas i pare uzorka), a dve referentne i kroz njih protiče čist noseći gas. U svakoj od njih se nalazi po jedan vlaknast otpornik od materijala koji ima veliki temperaturni koeficijent otpora. Za ovu svrhu koriste se platina, volfram, volframove legure i nikal. Takođe se koriste i sinterovane smeše oksida nikla, mangana, i kobalta. Ove smeše su poznate pod imenom termistori i njihova upotreba je ograničena na niske temperature, pošto im osetljivost opada sa porastom temperature. Šema termoprovodljivog detektora prikazana je na Slici Sva četiri otpornika povezana su u Vitstonov (Wheatstone) most. Kako kroz otpornike neprekidno protiče struja, jačine I, oni se nalaze na višoj temperaturi od temperature bloka koji se zagreva posebnim grejačem. Temperatura vlakna otpornika određena je ravnotežom između prispele električne energije (I 2 R) i toplote odvedene, toplotnim provođenjem, preko nosećeg gasa. Kada kroz obe ćelije protiče čist noseći gas konstantnom brzinom, temperature svih otpornika su konstantne. Pod tim uslovima 66

73 Gasna hromatografija Vitstonov most je uravnotežen i ΔE = 0. Kada sa kolone naiđu molekuli analiziranog jedinjenja, menja se sastav gasa u mernim ćelijama, što izaziva promenu temperature otpornika u mernim ćelijama. Posledica toga je pojava napona između mernih tačaka Wheatstone-ovog mosta i ΔE 0. Ovaj električni signal se pojačava i registruje kao gasnohromatografski pik. Površina ispod pika (P) proporcionalna je ukupnoj masi eluirane komponente (M), a obrnuto proporcionalna brzini protoka nosećeg gasa (F): P = ki x M / F Konstanta proporcionalnosti ki zavisi od razlike između toplotnih provodljivosti nosećeg gasa i pare eluiranog jedinjenja. Što je ova razlika veća, to je i konstanta proporcionalnosti veća, a samim tim veća je i površina ispod pika, odnosno granica detekcije. Činjenica da Ki zavisi i od toplotne provodljivosti pare analiziranog jedinjenja, dovodi do toga da ovaj detektor nema istu osetljivost za različita jedinjenja. Osetljivost termoprovodljivog detektora proporcionalna je i kvadratu jačine struje koja protiče kroz vlakna otpornika, otporu vlakna, kao i razlici između temperatura otpornika i bloka. Povećanje osetljivosti povećanjem jačine struje kroz vlakna, čime se menjaju i sve pomenute veličine, ograničeno je termičkom izdržljivošću vlakna. Kada se pređe određena temperatura vlakno može da pregori. Smanjivanjem temperature bloka takođe može da se poveća osetljivost detektora ali, istovremeno, može doći do kondezacije i deponovanja teže isparljivih jedinjenja u bloku detektora. Slika Šema termoprovodljivog detektora Ranije je već rečeno da je osetljivost termoprovodljivog detektora manja od osetljivosti drugih detektora. Njegove glavne prednosti su što nije destruktivan i što 67

74 Gasna hromatografija omogućava detekciju jedinjenja koja ne mogu da se detektuju jonizacionim detektorima kao što su: neorganski gasovi, voda, ugljen-disulfid i mnoga druga Plameno-jonizacioni detektor Plameno-jonizacioni detektor (FID gasnoj hromatografiji. Na izlazu iz kolone eluirane pare ispitivanih jedinjenja spaljuju u malom plamenu, dobijenim sagorevanjem vodonika u kiseoniku, da bi se proizveli joni. Kada se prikupe, joni proizvode malu struju koja se meri kao signal. Kada uzorak nije zapaljiv, treba da postoji minimalna jonizacija i na taj način se dobija bazna linija. Tipičan plameno-jonizacioni detektor (FID) je prikazan na Slici Eluent sa kolone se meša sa vodonikom i dovodi do malog gorionika gde sagoreva u atmosferi vazduha koji se neprekidno dovodi sa visokim protokom. Pošto se u toku sagorevanja uvek dobija voda, potrebno je da detektor bude zagrejan kako bi se sprečila kondenzacija vode. U plamenu se proizvode joni i oni provode struju od gorionika, koji služi kao jedna elektroda, do kolektorske elektrode postavljene iznad ili oko plamena koje su pod naponom od oko 300 V (Slika 4.26.). Kada sa kolone izlazi čist noseći gas, između elektroda protiče konstantna jednosmerna struja koja ide dalje kroz merni otpornik, a rezultujući pad apona se pojačava elektrometrom i detektuje kao bazna linija. Visina bazne linije podešava se kompenzovanjem ove struje strujom suprotnog smera. Kada u prostor između gorionika i kolektorske elektrode dospeju joni nastali u plamenu od jedinjenja eluiranog sa kolone, nihovo prisustvo smanjuje otpor između elektroda. Na taj način se pojačava struja, odnosno pad napona na mernom otporniku. Nastali signal se pojačava i registruje kao hromatografski pik. Površina pika direktno je proporcionalna ukupnoj masi eluirane supstance i ne zavisi od protoka nosećeg gasa. Zamenljivi kolektor Držač kolektora Izolator Plamen Oklop kolektora Vazduh Usmerivač mlaza Zid gorionika Vodonik Kolona - izlaz Slika Presek plameno-jonizacionog detektora 68

75 Gasna hromatografija Granica detekcije ovog detektora znatno je veća od od granice detekcije termoprovodljivog detektora (Slika 4.23.). Pomoću plameno-jonizacionog detektora ne mogu da se detektuju: voda, neorganski gasovi, metanska kiselina, freoni, odnosna sva jedinjenja koja ne mogu da gore. Granica detekcije organskih jedinjenja raste sa porastom procenta ugljenika u njima, tako da se za iste količine različitih jedinjenja dobijaju pikovi različitih površina. Granica detekcije ovog detektora zavisi i od brzina protoka vodonika i vazduha. Povećanje protoka vodonika iznad optimalne vrednosti smanjuje granicu detekcije Detektor sa zahvatom elektrona Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) je selektivan za jedinjenja sa elektronegativnim elementima, posebno sa hlorom, bromom ili fluorom. To je veoma osetljiv detektor za neke od ovih jedinjenja i u ppt opsegu. Za rad sa ECD detektorom kao noseći gas neophodan je azot ili argon. ECD detektor se sastoji od kontejnera od u kome se nalazi ona količina radioaktivnog 63 Ni čija je radioaktivnost 5 mcu (1,85 x Bq). Kontejner sa radioktivnim niklom se nalazi u peći koja se može termostatski kontrolisati od sobne temperature do 380 o C. U nekim detektorima se unesto nikla koristi 3 H kao β emiter ali je njegova upotreba ograničena na niske temperature. Radioaktivni 63 Ni se nalazi dobro zatvoren unutar ECD detektora i emituje elektrone (β čestice) koji se sudaraju sa molekulima nosećeg gasa i jonizuju ih. Ovom jonizacijom formira se stabilni oblak sporih elektrona u. Primenom periodičnih impulsa na anodu i katodu održava se konstantna struja elektronskog oblaka (Slika 4.27). Vrednost stalne struje bira operater, a trenutna vrednost stalne struje predstavlja broj impulsa kroz. Ako je trenutna vrednost stalne struje elektronika detektora održavati konstantnu struju od 0,3 nanoampera. Ako vrednost padne ispod zadate vrednosti stalne struje, broj impulsa u sekundi za održavanje stalne struje (Slika 4.28). Slika Impulsi koji zadaje detektor da se održi stalna struja Slika Povećani broj impulsa u prisustvu halogenog jedinjenja da se održi stalna struja 69

76 Gasna hromatografija Kada jedinjenje sa elektronegativnim atomom, tačnije sa atomom koji ima veliki afinitet prema elektronu, iz kolone detektora sa zahvatom elektrona, odmah vezuje neki od slobodnih elektrona i na taj način smanjuje broj slobodnih elektrona u oblaku. Kada je smanjen broj elektrona se broj impulsa u jedinici vremena za održavanje konstantne struje jednake zadatoj stalnoj struji. Taj povećani broj impulsa se konvertuje na analogni izlaz kao signal. Za razliku od drugih detektora koji mere signala u odgovoru detektora, elektronika detektora sa zahvatom elektrona meri puls potreban da se održi zadata konstantna struja. Detektor sa zahvatom elektrona šematski je prikazan na Slici Izolator Radioaktivni emiter Anoda U otpad Sa GC kolone Noseći gas- ulaz Noseći gas- izlaz + Elektroda - Elektroda Katoda -Emiter Izolator Slika Šematski prikazi detektora sa zahvatom elektrona Površina pika kod detektora sa zahvatom elektrona zavisi od količine eluiranog jedinjenja. Površina pika takođe zavisi i od afiniteta jedinjenja prema elektronima. Zbog toga je ovaj detektor izuzetno osetljiv na halogenalkane koji, zahvaljujući halogenu, imaju veliki afinitet prema elektronima. Takođe, pokazuje i veliku osetljivost, mada znatno manju nego u odnosu na halogenide, prema konjugovanim karbonilnim jedinjenjima, nitrilima, nitratima i organometalnim jedinjenjima. Praktično je potpuno neosetljiv na ugljovodonike, alkohole, ketone i ostala jedinjenja čiji je afinitet prema elektronima slab. Zbog navedenih osobina vrlo je pogodan za analizu tragova halogenovanih jedinjenja. Od velike je važnosti za analizu tragova pesticida u poljoprivrednim proizvodima (ratarskim i povrtarskim) i prehrambenim proizvodima. 70

77 Gasna hromatografija Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor Azot - fosforni detektor (engl. Nitrogen Phosphorus Detector - NPD), koji se ponekad naziva i termoelektronski detektor, je veoma osetljiv, specifičan detektor za jedinjenja koja sadrže azot i/ili fosfor. Iako je njegova konstrukcija veoma slična plameno jonizacionom detektoru, on radi na potpuno drugačijem principu. Šematski je azot - fosforni detektor prikazan na Slici Anoda Kuglica od rubidijuma ili cezijuma Konektori kalema Grejni kalem Plamen Vazduh Vodonik Noseći gas - helijum Slika Šematski prikaz azot-fosfornog detektora Senzor azot-fosfornog detektora se razlikuje od onog u plameno jonizacionom detektoru po tome što sadrži kuglicu (perlu), od rubidijum ili cezijum hlorida, koja se nalazi unutar grejnog kalema neposredno iznad otvora mlaznice kroz koju prolazi smeša nosećeg gasa i vodonika. Struja vodonika i vazduha stvara plazmu vodonika oko zagrejane perle. Zagrejana alkalna kuglica emituje elektrone koji se prikupljaju na anodi i daju osnovnu struju kroz sistem elektroda. Kada molekuli koji sadrže azot ili fosfor dospeju u plazmu iz kolone kroz otvor mlaznice dolazi do katalitičke reakcije na površini perle i dodatne emisije elektrona, samim tim se povećava broj elektrona koji dolazi do anode, odnosno struja. NPD ima veoma visoku granicu detekcije, 1x10-12 g/ml za fosfor i 1x10-11 g/ml za azot. On je osetljiv i na ugljovodonike ali je granica detekcije za njih oko puta manja od granice detekcije za fosforna i azotna jedinjenja. Osnovni nedostatak ovog detektora je da se njegove performanse pogoršavaju sa vremenom. Sagorevanjem vodonika stvara se vodena para. Na normalnoj radnoj 71

78 Gasna hromatografija temperaturi kuglica od alkalnih soli trpi značajan pritisak vodene pare i samim tim, dolazi do kontinuiranog gubitka rubidijuma ili cezijuma tokom rada detektora. Ovo je problem sa svih NPD detektora i kod rada sa njima treba redovno menjati perle sa alkalnim solima. Azot-fosforni detektor je, kao i plameno jonizacioni, relativno neosetljiv na pritisak, brzinu protoka i promene temperature, ali se obično termostatira na 260 o C ili više. Specifičan odgovor NPD na azot i fosfor, zajedno sa, čini ovaj detektor posebno korisnim za analizu mnogih farmaceutskih uzoraka, a naročito uzoraka iz životne sredine koji sadrže herbicide i pesticide sisteme kolona lako se mogu odrediti tragovi herbicida na nivou 500 pg. Iz pomenutih razloga, ovaj detektor se često koristi za analizu tragova pesticida i herbicida, koji sadrže fosfor, u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima Plameno fotometrijski detektor Plameno fotometrijski detektor (engl. Flame Photometric Detector - FPD) je jedan od na detektora u gasnoj hromatografiji. Plameno fotometrijski detektor analizira svetlost redukcionog plamena koji nastaje sagorevanjem (zagrevanjem) neke hemiluminiscentne molekulske vrste u struji vodonika i vazduha. Hemiluminiscencija je optička emisija koja se javlja kada se ekscitovani molekuli vraćaju u osnovno stanje. Zbog toga što svetlost potiče od molekularne emisije, trake dobijene na ovaj način su šire i složenije nego trake dobijene emisijom atoma. Molekuli emituju svetlost karakteristične talasne dužine koja se propušta kroz odgovarajući filter. Izabrana talasna dužina određuje koji će jedinjenje biti detektovano. Filtrirana svetlost se meri i pomoću fotomultiplikatora prevodi u signal. Plameno fotometrijski detektor je sličan plameno jonizacionom detektoru po tome što uzorak izlazi iz kolone i ulazi u difuzioni vodonični plamen. Za razliku od plameno jonizacionog detektora koji meri struju jona proizvodenih od organskih jedinjenja tokom sagorevanja, plameno fotometrijski detektor analizira spektar svetlosti koju emituju hemiluminiscentna jedinjenja u plamenu. Komora u kojoj se nalazi detektor ne sme da propušta svetlost, tako da samo svetlost iz plamena može, kroz filter, doći do fotomultiplikatora. Kod FPD se koristi drugi protok vodonika koji služi da očisti optički put između fotomultiplikatora i difuzionog plamena vodonika. Kod PFD se takođe koristi i drugi protok vazduha usmeren preko staklene površine fotomultiplikatora koja je okrenuta prema plamenu ( lice fotomultiplikatora) da spreči helijum i/ili molekule vodonika da prodiru kroz stakleni prozor fotomultiplikatora i izazivaju kvar. Plameno fotometrijski detektor šematski je prikazan na Slici

79 Gasna hromatografija Slika Šematski prikaz plameno fotometrijskog detektora Filteri mogu biti izabrani za mnoga različita jedinjenja e se koriste za selektivnu detekciju sumpornih i fosfornih jedinjenja u kompleksnim smešama. Sumporna jedinjenja se detektuju pomoću emisije ekscitovanog S2. Talasna dužina na kojoj je maksimalna emisija (Lambda max) S2 je 394 nm. Fosforna jedinjenja se detektuju preko ekscitovanih molekula HPO (Lambda max = dublet nm). Iako nije u potpunosti selektivan, FPD je oko puta osetljiviji na sumporna i fosforna jedinjenja nego na ugljovodonike. Jedinjenja sumpora kao što su H2S ili SO2 se mogu detektovati u koncentracijama oko 200 ppb, a fosforna jedinjenja u koncentracijama oko 10 ppb. Gasna hromatografija sa plameno fotometrijskim detektorom se u analizi hrane koristi za detekciju neželjenih ukusa (engl. off-flavors) koji nastaju kao rezultat oslobađanja isparljivih sumpornih jedinjenja. Takođe se koristi i za detekciju pesticida koji sadrže fosfor i sumpor u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima. U oblasti životne sredine se koristi za otkrivanje organofosfornih pesticida i herbicida. Nekoliko EPA metoda za detekciju pestic. Takođe se koristi za istovremeno otkrivanje sumpora i fosfora u hemijskim bojnim otrovima. Može se koristiti i za detekciju sumpora u sirovoj nafti i sumpornih kontaminanata u prirodnom gasu Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi Maseni spektrometar, svakako, ne može da se posmatra kao običan detektor. Kombinacija gasne hromatografije i masene spektrometrije predstavlja najmoćniju metodu za razdvajanje i kvalitativnu i kvantitativnu analizu isparljivih organskih jedinjenja. Detaljan opis ove metode zahteva mnogo prostora i u mnogome prevazilazi 73

80 Gasna hromatografija obim i namenu ovog rukopisa. Međutim, zbog velikog značaja i široke upotrebe, ovde će ukratko biti opisani osnovni principi i mogućnosti koje pruža ova metoda. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) je najzastupljenija analitička tehnika za identifikaciju i kvantifikaciju organskih jedinjenja u složenim uzorcima. Kombinacija gasnog hromatografa i masenog spektrometra danas je neophodna u oblasti ekologije, forenzike, zdravstvene zaštite, medicinskih i bioloških istraživanja, zdravlja i bezbednosti, industrije aroma i poboljšivača ukusa i mirisa, bezbednosti hrane, pakovanja hrane, i mnogim drugim oblastima.. Gasni hromatograf razdvaja komponente smeše u vremenu, a maseni spektrometar pruža informacije koje pomažu u strukturnoj identifikaciji svake komponente. Ova kombinacija ima nekoliko prednosti. Prvo, odvaja komponente kompleksne smeše tako da se dobijaju maseni spektri pojedinačnih jedinjenja za kvalitativne svrhe; drugo, može da obezbedi kvantitativne informacije o ovim istim jedinjenja. Jonizacione tehnike masene spektrometrije koje zahtevaju analite u gasnoj fazi su idealne za GC/MS, jer je isparljivost uzorka uslov za gasnu hromatografiju. GC/MS može da obezbedi kompletan maseni spektar ako je sadržaj analita u uzorku oko 1 x g. Ovaj spektar daje molekulski jon i fragmentacione jone ili "hemijski" otisak prsta koji se može koristiti kao osnova za identifikaciju zajedno sa retencionim vremenima dobijenih gasnohromatografskim razdvajanjem. Metoda GC/MS je ograničena na analite koji, osim što treba da budu isparljivi, takođe treba da budu stabilni u gasnohromatografskoj koloni u uslovima razdvajanja (temperatura kolone, interakcije sa stacionarnom fazom, injektovanje, itd.). Čak i sa ovim ograničenjem, postoje mnoga jedinjenja koja mogu da budu odvojena i identifikovana i /MS. Maseni spektrometar u sistemu GC/MS ima dvostruku ulogu, služi kao detektor i snima masene spektre eluiranih jedinjenja. Neprekidnim merenjem ukupne jonske struje (Total Ion Current - TIC), odnosno sume svih jona koji se stvore u jonskom izvoru za vreme hromatografisanja, dobija se gasni hromatogram. Dobijeni gasni hromatogram je po izgledu isti kao i gasni hromatogrami dobijeni pomoću nekog od standardnih gasnohromatografskih detektora. Maseni spektar se dobija merenjem struja koje potiču od jona razdvojenih prema masa/naelektrisanje (m/z) vrednostima. Maseni spektar predstavlja zavisnost jačine jonske struje od m/z vrednosti. Intenziteti jonskih struja (obilnosti jona) u masenom spektru izražavaju (u %) u odnosnu na intenzitet najobilnijeg jona, koji se zove osnovni jon i njegov intenzitet je 100 %. Maseni spektrometar se sastoji od sledećih osnovnih delova: - Jonskog izvora gde se stvaraju joni od analiziranih molekula. - Masenog analizatora ili filtera masa gde dolazi do razdvajanja jona nastalih u jonskom izvoru u zavisnosti od odnosa m/z ili m/e. - Detektora i sistema za obradu podataka. 74

81 Gasna hromatografija U jonskom izvoru ili jonizacionoj komori dolazi do stvaranja jona od analiziranih molekula. Do jonizacije molekula, u zavisnosti od konstrukcije jonskog izvora, može doći na više načina. U GC/MS sistemima najčešće se koriste bombardovanje elektronima sa visokim sadržajem energije i hemijska jonizacija. Osim ovih načina u masenoj spektrometriji koriste se još i bombardovanje brzim atomima (Fast Atom Bombardment - FAB), jonizacija u plazmi (Plasma Desorption Ionisation - PDI), elektrosprej jonizacija (Electrospray Ionisation - ESI), jon sprej jonizacija (Ion Spray Ionisation - ISI) i laserska jonizacija (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation - MALDI). Jonizacija molekula elektronskim bombardovanjem (engl. Electron Impact -EI) izvodi se u komori koja je smeštena između dva magneta. Elektroni se emitiju sa usijane katode, koja je napravljena od volframa ili rutenijuma, i imaju energiju od E = 70 ev. Za jonizaciju molekula dovoljno je 13 ev. Elektroni se na putu prema anodi sudaraju sa molekulima analita i prilikom sudara im izbijaju jedan elektron i tako nastaju pozitivni molekulski joni. Nastali joni su nestabilni i dalje se fragmentišu i daju nove jone. Joni nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka analizatoru masa. Fragmetacija molekulskih jona je specifična za svako jedinjenje i predstavlja otisak prsta jedinjenja. Na slici 4.32 šematski je dat prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima. M + e - M + + 2e - Odbijač Filament (W ili Ru) Magnet Magnet Trap MS Fokus Slika Šematski prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima Komora za hemijsku jonizaciju je slična opisanoj komori. Razlika je u tome što se u ovu komoru uvodi takozvani reagens gas - metan, amonijak, izobutan, u koncentracijama i 1000 puta većim od koncentracije analita. Elektroni se sudaraju sa molekulima reagens gasa i jonizuju ih: 75

82 Gasna hromatografija 2 CH 4 + 2e - CH CH 3 + +H + 4e - CH CH 4 CH CH 3 CH CH 4 C 2 H H 2 Joni nastali jonizacijom molekula reagens gasa su nestabilni i reaguju sa molekulima analizirane supstance i daju nove jone: + M + CH 5 MH + + CH 4 M + C 2 H 5 + MH + + C 2 H 4 Proizvod nove jonizacije su takozvani kvazimolekulski joni MH + čija je molekulska masa za 1 veća od molekulske mase jedinjenja. Ovi joni su stabilniji od jona koji se dobijaju elektronskim bombardovanjem i samo se delimično fragmentišu. Joni nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka masenim analizatorima - filterima, gde se razdvajaju po masama. Za razdvajanje jona po masama u sistemima gasni hromatograf / maseni spektrometar najčešće se koriste magnetni analizator (magnetno polje) i kvadrupolni maseni analizator. Osim ovih načina u masenoj spektrometriji koriste se i sledeći analizatori masa: analizator koji meri vreme preletanja jona (engl. time-of-flight, TOF) i jonski trap (engl. ion trap analyser). Joni razdvojeni u masenom analizatoru dolaze do detektora gde se registruju u obliku signala. Što ima više jona sa određenim odmosom m/z dobija se intenzivniji signal. Jon koji daje najintenzivniji signal zove se osnovni jon i uzima se da je intenzitet tog signala 100%. Intenziteti ostalih signala se daju kao procenti od osnovnog signala. Svaki molekul se fragmentiše (raspada) na jone na isti način pod istim uslovima. Grafički prikaz zavisnosti intenziteta signala od odnosa m/z zove se maseni spektar. Maseni spektar je karakterističan za svako jedinjenje i zove se još i otisak prsta. Intenzitet pika je direktno proporcionalan vremenu života jona. Stabilan jon traje duže i daje intenzivniji pik. Visokoenergetski joni su nestabilni i kratkoživući, pa ne traju dovoljno dugo da stignu do detektora. Šematski prikaz sistema gasni hromatograf/maseni spektrometar dat je na Slici Slika Šematski prikaz sistema gasni hromatograf/maseni spektrometar 76

83 Gasna hromatografija Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i dobru razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od niza činilaca od kojih su najvažniji: - Hemijska i fizička svojstva jedinjenja koja se razdvajaju, u prvom redu, njihova polarnost i napon pare; - Hemijska i fizička svojstva stacionarne faze - polarnost, viskozitet i termička stabilnost; - Brzina protoka nosećeg gasa; - Temperatura kolone i - Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze. Činioci koji se odnose na hemijska i fizička svojstva analita i stacionarne faze, kao i brzinu protoka nosećeg gasa, su detaljno razmatrani u prethodnim poglavljima (1.2.2.; i ). U ovom poglavlju će biti razmatran uticaj temperaturnog režima i karakteristika kolone na gasno-hromatografsku analizu Temperatura kolone Izbor temperature kolone zavisi od termičke stabilnosti njene tečne stacionarne faze i od osobina jedinjenja koja se razdvajaju. Minimalnu i maksimalnu temperaturu na kojoj se može koristiti kolona daje proizvođač i u ovom opsegu temperatura kolona ima optimalne karakteristike. Zagrevanje preko maksimalne temperature dovodi do termičke degradacije polimera stacionarne faze, isparavanja i eluiranja stacionarne faze - curenja kolone. Rad na nižoj temperaturi od minimalne preporučene temperature, znatno smanjuje efikasnost kolone, zbog toga što su viskoziteti tečnih faza na tim temperaturama veliki, neke mogu preći i u čvrsto agregatno stanje. Postoje dve vrste temperaturnih režima: izotermalni - konstantna temperatura kolone i programirani - temperatura se linearno podiže. Raspodela analiziranog jedinjenja između tečne i gasovite faze veoma zavisi i od temperature. Koeficijent raspodele se porastom temperature kolone za 30 C smanjuje za polovinu u najvećem broju slučajeva. Kao posledica povećanja temperature dolazi do bržeg eluiranja supstanci sa kolone, smanjivanja njihovih retencionih vremena i smanjivanja širine bazne linije pika, što je prikazano na Slici Sa povećanjem temperature smanjuje se i razlika u retencionim vremenima, odnosno opada i stepen razdvajanja i potrebno je za svaku analiziranu smešu odabrati kompromisnu temperaturu koja će obezbediti dobro razdvajanje, sa uskim pikovima za kratko vreme. 77

84 Gasna hromatografija Optimalna radna temperatura kolone zavisi od niza faktora od kojih su najvažniji: tačke ključanja analiziranih komponenti, njihova polarnost, polarnost tečne faze, debljina filma tečne faze i dužina kolone. a) T = 100 C, izotermalno, širina pika(2) 1,4 minuta b) T = 130 C, izotermalno, širina pika(2) 0,5 minuta Slika Hromatogrami smeše hromatografisane pod istim uslovima na dve različite temperature pri izotermalnom režimu Izotermalni temperaturni režim se primenjuje na smeše jedinjenja čije se tačke ključanja i polarnosti nalaze u relativno uzanim opsezima. Kod razdvajanja smeša u kojima postoji širok opseg tačak ključanja, pod izotermalnim uslovima će najisparljivija jedinjenja da se eluiraju isuviše brzo, a najmanje isparljiva suviše sporo. Programirani temperaturni režim podrazumeva linerano povećavanje temperature kolone nakon ubrizgavanja uzorka. Najčešće se primenjuje linearno programiranje temperature. Temperatura se od početne postepeno povećava do zadate temperature određenom brzinom, na primer 5 C / min. Primenjuje se i multilinearno programiranje, temperatura se od početne do prve zadate temperature linearno povećava određenom brzinom, na toj temperaturi kolona ostaje određeno vreme, a zatim linearno povećava do druge zadate temperature brzinom koja može biti ista ili različita sa prvom brzinom. Primena programiranja temperature ima mnogo prednosti u odnosu na izotermalni režim od kojih su najvažnije sledeće: - Znatno kraće vreme analize; - Podjednako dobro razdvajanje komponenti sa niskim i visokim tačkama ključanja; - Ujednačene širine osnova pikova i - Minimalno zaostajanje komponenti sa visokim tačkama ključanja na koloni. 78

85 Gasna hromatografija Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze Dužina kolone je direktno proporcionalna efikasnosti, odnosno broju teorijskih podova. Hromatografisanje na dužim kolonama daje bolju rezoluciju, međutim, udvostručena 1,4, dok su troškovi i vreme analize proporcionalni dužini kolone. Uticaj dužine kolone na rezoluciju i retenciono vreme prikazan je na Slici Rutinska razdvajanja e sa kolonama dužine 25 ili 30 m, dok se za razdvajanja složenih smeša koriste duže kolone 50 ili 60 m. Kapilarne kolone se proizvode sa unutrašnjim prečnicima od 0,1 do 0,530 mm. Što je manji prečnik kolone veći je broj teorijskih podova po metru kolone ali je manji kapacitet. Uticaj unutrašnjeg prečnika kolone na rezoluciju prikazan je na Slici Najčešće se koriste kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,25 mm. Kolone sa većim prečnicima od 0,32 i 0,53 mm se koriste za rutinske analize jednostavnijih smeša i lako isparljivih jedinjenja, kao i koncentrovanijih uzoraka jer imaju veći kapacitet. r = 0,53 mm r = 0,32 mm Slika Uticaj dužine kolone na rezoluciju i retenciono vreme Slika Uticaj unutrašnjeg prečnika kolone na rezoluciju Debljina filma u GC kapilarnim kolonama se kreće od 0,1 do 5,0 µm. Standardna debljina filma je 0,25 µm. Tanki filmovi (0,1-0,2 µm) su veoma pogodni za razdvajanje jedinjenja sa visokim tačkama ključanja ili nestabilnih jedinjenja, za razdvajanje supstanci sa vrlo sličnim osobinama (sa bliskim retencionim vremenima) i brza razdvajanja. Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne faze prikazana je na Slici Sa p anjem debljine filma se ava kapacitet kolone, povećavaju se retenciona vremena jedinjenja sa niskim tačkama ključanja i poboljšava inertnost. Veća debljina filma takođe znači više stacionarne faze u koloni, a samim tim i e curenje. Ovo rezultira nižim maksimalnim radnim temperaturama za kolone sa debljim filmovima. 79

86 Gasna hromatografija Debljina filma 0,25 µm Debljina filma 1,00 µm Slika Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne faze Kvalitativna gasnohromatografska analiza Danas se kvalitativna gasnohromatografska analiza radi najčešće korišćenjem GC/MS metode gde gasni hromatograf služi da razdvoji komponente smeše, a maseni spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti. Poređenjem masenih spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih jedinjenja vrši se identifikacija nepoznatih komponenti smeše. Svi sistemi gasni hromatograf - maseni spektrometar danas se isporučuju sa bibliotekom masenih spektara velikog broja jedinjenja u elektronskom obliku. Osim toga, komercijalno su dostupne biblioteke masenih spektara u elektronskom obliku, kao i programi za njihovo korišćenje, odnosno brzu pretragu i poređenje. U slučaju analize jednostavnijih smeša i dobrog preklapanja dobijenih masenih spektara sa literaturnim, maseni spektar je dovoljan za identifikaciju jedinjenja prisutnih u smeši. Međutim, kod analiza složenih smeša koje sadrže komponente sa sličnim retencionim vremenima i gde nije postignuta najbolja rezolucija, dobijeni maseni spektri mogu biti značajno različiti od literaturnih i onda je neophodno koristiti i retencione parametre za identifikaciju komponenti smeše. Svi retencioni parametri su detaljno opisani u Poglavljima i 4.1. Retenciono vreme nekog jedinjenja zavisi od njegovih fizičko - hemijskih osobina i uslova hromatografisanja i, ako su uslovi hromatografisanja identični, predstavlja karakterističnu veličinu za neko jedinjenje. Kako retenciono vreme zavisi od velikog broja spoljašnjih faktora, uslova hromatografisanja, koje jako teško kontrolisati, koriste se podešeno retenciono vreme, korigovano retenciono vreme i relativno retenciono vreme. Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog vremena posmatrane komponente i retencionog vremena standarda: t'rk = trk / trs gde je trk - retenciono vreme komponente, a trs - retenciono vreme standarda. 80

87 Gasna hromatografija Kao standard se obično koristi sastojak smeše sa najmanjim retencionim vremenom. Na relativno retenciono vreme, od spoljašnjih činilaca, utiču samo temperatura kolone i vrsta tečne stacionarne faze. Zbog jednostavnog određivanja i visoke reproduktivnosti, relativno retenciono vreme se najčešće koristi u kvalitativnoj analizi. Kombinacijom podataka o retencionim parametrima i literaturnih masenih spektara dolazi se do nedvosmislene identifikacije nepoznatog jedinjenja Kvantitativna gasnohromatografska analiza Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog jedinjenja. Najednostavniji način za određivanje koncentracije datog jedinjenja bio bi merenje površine pika i deljenjem te površine sa zbirom površina svih pikova. Međutim, ovakav način određivanja koncentracije je povezan sa mnogim ograničenjima od kojih su najčešća: - Različite osetljivosti detektora na različita jedinjenja. - Smanjenje intenziteta ili potpuno odsustvo pika usled trajnog zadržavanja pojedinih jedinjenja na koloni ili termičkog razlaganja u isparivaču ili koloni. - Način uzimanja uzorka i način injektovanja Metoda normalizacije površina Metoda normalizacije površina je najbrža i najednostavnija metoda za određivanje procentnog sastava analizirane smeše. Danas se hromatografi prodaju sa računarima koji služe za obradu podataka. Ovi računari su snabdeveni programima za izračunavanje površina pikova i izračunavanje procenata svake površine pika u smeši. Greške do kojih može doći zbog različitih osetljivosti detektora na različita jedinjenja mogu biti svedene na minimum korišćenjem računarskih programa sa korekcionim faktorima koji su komercijalno dostupni i isporučuju se sa aparatom. Ovi programi omogućavaju i eliminciju pikova koji potiču od rastvarača (znatno veći od ostalih pikova) i eventualno prisutnih nečistoća (priprema uzorka, curenje kolone i slično) Metoda internog standarda Metoda internog standarda je najpreciznija metoda za kvantitativnu analizu i podrazumeva prethodnu pripremu kalibracionih krivih za svako jedinjenje čija se koncentracija određuje. Kalibraciona kriva se pravi hromatografisanjem standardnih rastvora koji sadrže različite masene odnose jedinjenja koje se određuje i standarda. Obično se rastvori prave tako što se odmerava ista masa standarda za sve rastvore i 81

88 Gasna hromatografija različite mase ispitivane supstance. Standardni rastvori se hromatografišu pod istim uslovima, određuju se površine pikova PA i PS, a kalibraciona kriva (za jedinjenje A) konstruiše se nanošenjem količnika PA / PS u zavisnosti od ma (Slika 4.38). Jedinjenje koje se koristi kao interni standard mora da zadovolji sledeće uslove: - Da se dobro rastvara u analiziranoj smeši i da bude hemijski slično komponentama koje se određuju; - Da bude hemijski inertno u odnosu na sastojke smeše i stacionarnu fazu kolone; - Njegov pik ne sme da se preklapa ni sa jednim iz analizirane smeše, ali je poželjno da ima retenciono vreme blisko retencionim vremenima komponenti; - Mora da postoji pouzdan podatak da to jedinjenje ne može da se pojavi u prirodnom uzorku (kod analize metil estra masnih kiselina kao interni standard se uzima metil estar masne kiseline sa neparnim brojem ugljenikovih atoma, zbog toga što se biosintezom uvek dobijaju masne kiseline sa parnim brojem ugljenikovih atoma). Slika Kalibraciona kriva za jedinjenje A Posle konstruisanja kalibracione krive, u uzorak se dodaje odmerena količina standarda, ista kao u standardnim rastvorima za pravljenje kalibracione krive. Uzorak se zatim hromatografiše na isti način kao i standardni rastvori. Mere se površine pikova standarda i jedinjenja koje se određuje i na osnovu njihovog količnika određuje masa supstance jedinjenja koje se određuje - crvena linija na slici Kalibraciona kriva se pravi za svako jedinjenje čija se koncentracija određuje. Dobra strana metode je što promena uslova hromatografisanja (temperatura kolone, detektora i injektora, kao i protok nosećeg gasa) ne utiču bitno na tačnost rezultata, odnosno na sličan način utiču i na standard i na analizirano jedinjenje. Metoda je veoma tačna i nije neophodno da se u gasni hromatograf uvek injektuju iste zapremine. Ako se ova metoda koristi za određivanje malih koncentracija, kao što su tragovi pesticida u hrani, tragovi veterinskih lekova u animalnim proizvodima, biomedicinske analize itd., potrebno je prethodno prečišćavanje uzorka. Prethodno prečišćavanje uzorka podrazumeva nekoliko koraka: ekstrakciju, hromatografiju na koloni ili 82

89 Gasna hromatografija tankoslojnu hromatografiju i derivatizaciju. Kod svakog od ovih koraka može doći do gubitaka supstance koja se određuje. Da bi se ovi gubici kompenzovali, interni standard se dodaje u smešu koja se analizira pre prečišćavanja. Na taj način su praktično približno jednaki gubici i internog standarda i analizirane supstance, tako da se njihov maseni odnos praktično ne menja Metoda standardnog dodatka Za analizu malih koncentracija supstanci bez prethodnog prečišćavanja uzorka, na primer alkohola u krvi, koristi se metoda standardnog dodatka. Vrlo je često da se pik primese čija se koncentracija određuje nalazi na repu signala glavne komponente. Kod ove metode, tačno odmerena, uvek ista zapremina uzorka se više puta hromatografiše pod istim uslovima i odredi srednja visina pika jedinjenja koje se određuje (h1). Zatim se u uzorak doda tačno odmerena količina supstance koja se određuje (najbolje približno jednaka količini supstance u uzorku) i ponovo više puta hromatografišu iste zapremine pod istim uslovima i odredi srednja visina pika (h2). Na osnovu razlike u visini pikova h2 i h1, dobija se visina (h) koja je proporcionalna količini dodatog standarda i na osnovu te visine se određuje količina supstance: a = h1 x b / h gde je: a - količina supstance koja se određuje b - odmerena količina supstance koja se određuje Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji Cilj ovih reakcija je prevođenje neisparljivih jedinjenja u stabilne isparljive derivate pogodne za hromatografisanje, kao i za snimanje masenih spektara. Pored toga, promena retencionog vremena izazvana derivatizacijom, često omogućava i identifikaciju funkcionalnih grupa u nepoznatom jedinjenju. Svaka hemijska reakcija koja se koristi za derivatizaciju mora da zadovolji sledeće uslove: - Velika brzina reakcije; - Kvantitativan prinos reakcije; - Blagi reakcioni uslovi; - Minimum sporednih proizvoda; - Termička stabilnost nagrađenog derivata i - Jednostavna obrada reakcione smeše pre hromatografisanja. Najčešće se derivatizuju jedinjenja koja sadrže aktivne vodonikove atome vezane za azot ili kiseonik, kao što su: karboksilne kiseline, alkoholi, fenoli, ugljeni hidrati, 83

90 Gasna hromatografija amini i amino kiseline. Osim njih derivatizuju se i jedinjenja velike molekulske mase sa polarnim grupama, kao što su amidi i steroidi. Danas je komercijalno dostupan veliki broj reagenasa za brzu derivatizaciju glavnih funkcionalnih grupa. Ovi reagensi su dostupni kao pojedinačni ili kao kompleti za derivatizaciju više funkcionalnih grupa ili više reagenasa za derivatizaciju jedne funkcionalne grupe (na primer kit-ovi za derivatizaciju masnih kiselina). U Tabeli 4.3. su prikazane najčešće metode za derivatizaciju funkcionalnih grupa, nagrađeni derivati i komercijalni nazivi reagenasa. Strukture i imena reagenasa za derivatizaciju nalaze se u Tabeli 4.4. Tabela 4.3. Derivatizacija funkcionalnih grupa Klasa jedinjenja Metod Derivat Komercijalni reagensi Alkoholi Sililovanje RO TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TSIM, SILYL 2110, SILYL-21, SILYL-1139 Fenoli Amini (prim. i sekundarni) Hidrohloridi Acilovanje Alkilovanje Sililovanje Sililovanje Acilovanje Sililovanje RO CO R RO R RO TMS R NR TMS R NR CO R R NR TMS TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA TMSH TSIM, BSTFA, SILYL-991 BSA, MSTFA, MSHFBA, SILYL-991 TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA MSTFA Amidi Acilovanje R CO NH-CO R TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA Amino kiseline Sililovanje BSA, BSTFA, MSTFA, MSHFBA Masne kiseline Alkilovanje Acilovanje MeOH/TMCS, TMSH TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA Sililovanje R CO O TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TMCS, TSIM, SILYL-2110, SILYL-21 Alkilovanje R CO O R DMF-DMA, MeOH/TMCS, TMSH Soli masnih k. Sililovanje R CO O TMS TMCS Ugljeni hidrati Steroidi Sililovanje Acilovanje Sililovanje Acilovanje - MSTFA, TSIM, HMDS, SILYL-1139 TFAA, MBTFA - BSA, TSIM TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA 84

91 Gasna hromatografija Tabela 4.4. Reagensi za derivatizaciju Komercijalno ime Formula Hemijsko ime BSA N,O-bis(trimetilsilil)acetamid MSTFA N-Metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamid MSHFBA N-Metil-N-trimetilsililheptafluorobutilamid TSIM N-Trimetilsilil-imidazol SILYL-2110 HMDS Heksametildisilazan (HMDS) trimetilhlorsilan(tmcs) piridin 2:1:10 TCMS SILYL-21 Heksametildisilazan (HMDS) trimetilhlorsilan(tmcs) 2:1 SILYL-1139 N-Trimetilsilil-imidazol (TSIM) piridin 11:39 SILYL-991 BSFTA TFAA HFBA MBTFA N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid(BSTFA) trimetilhlorosilan (TMCS) 99:1 N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid Anhidrid trifluorosirćetne kiseline Anhidrid heptafluorobutanske kiseline N-Metil-bis(trifluoroacetamid) MBHFBA N-metil-bis(heptafluorobutilamid) TMSH TMCS Trimetilsulfonijum-hidroksid Trimetilhlorosilan DMF-DMA 1,1-Dimetoksi-N,N-dimetilmetilamin 85

92 Gasna hromatografija 4.5. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda Gasna hromatografija ima veoma široku primenu u analizi hrane. Veliki broj gasnohromatografskih metoda je standardizovan i rutinski se koristi u analizi hrane. Spisak standarnih gasnohromatografskih metoda koji se koriste u analizi hrane je veoma dugačak i prevazilazi okvire ovog rukopisa. Gasna hromatografije se koristi za analizu, kako osnovnih sastojaka hrane, tako i za analizu kontaminanata koji u hranu dospevaju na različite načine. Značajnu primenu gasna hromatografija ima i u analizi aromatskih kopleksa pojedinih prehrambenih proizvoda kao što su: sir, vino, pivo, neki proizvodi od mesa kojima se dokazuje autentičnost, odnosno geografsko poreklo ovih proizvoda. O primeni ove metode bilo je reči i u prethodnim poglavljima koja se odnose na kolone i detektore. Gasnohromatografske metode u analizi hrane možemo podeliti u dve osnovne grupe: metode za određivanje prirodnih sastojaka hrane i metode za određivanje toksičnih supstanci u hrani dospelih zagađivanjem hrane. U prvu grupu spadaju metode za određivanje masnih kiselina, koje se pre određivanja prevode u odgovarajuće derivate, vidi Tabelu 4.3. U ovu grupu spadaju i metode za određivanje aromatičnih materija u hrani, kao i materija koje utiču na ukus hrane. U drugu grupu spadaju metode za određivanje toksičnih materija koje na različite načine mogu da dospeju u hranu. Sigurno su najvažnije metode za određivanje pesticida u hrani, polihlorovanih bifenila (PCB), polihlorovanih dibenzo-p-dioksina i dibenzofurana, policikličnih aromatičnih ugljovodonika (PAH), akrilamida, ftalata, estara adipinske kiseline itd. Veliki broj toksina se pre određivanja prevodi u odgovarajuće derivate, kao na primer: veterinarski lekovi, mikotoksini, hloropropanoli, heterociklični amini, epoksi jedinjenja itd. Danas se sve više unapređuju osobine gasnohromatografskih kolona, pomeraju granice osetljivosti detektora, razvijaju i koriste metode kuplovanih tehnika kao što su GC/GC/MS, GC/MS/MS itd. Sve ovo omogućava razdvajanje i određivanje velikog broja supstanci iz najrazličitijih supstrata u veoma niskim koncentracijama. Oblast primene gasne hromatografije u analizi hrane i, uopšte, u analitičkoj hemiji se svakodnevno proširuje. Rezime poglavlja U gasnoj hromatografiji (GC) mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta (GSC) ili tečna (GLC). Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih derivata,, kliničkoj hemiji i 86

93 Gasna hromatografija brojnim drugim oblastima. Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su: visoka rezolucija, brzina, osetljivost, preciznost i tačnost. Osnovne komponente gasnog hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom, regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona, termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač. Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i dobru razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od: hemijskih i fizičkih svojstava analita i stacionarne faze, temperature i karakteristika kolone. Kvalitativna gasnohromatografska analiza se radi najčešće korišćenjem metode gasna hromatografija - masena spektrometrija, gde gasni hromatograf služi da razdvoji komponente smeše, a maseni spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti. Poređenjem masenih spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih jedinjenja vrši se identifikacija nepoznatih komponenti smeše. Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog jedinjenja. Površina pika, osim od koncentracije, zavisi i od mnogih drugih faktora. Iz tog razloga koncetracije analiziranih supstanci se određuju: metodom normalizacije površina, metodom internog standarda i metodom standardnog dodatka. Pitanja za proveru znanja ili diskusiju 1. Koja su tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u koloni? Objasniti kako dolazi do širenja zona. 2. Objasniti split i splitless režim injektovanja. Koje su prednosti, a koji nedostaci ovih načina injektovanja? U kojim slučajevima se koristi split, odnosno splitless režim? 3. Šta je statični, a šta dinamični headspace? 4. Koji su najvažniji zahtevi koje čvrsti nosač treba da zadovolji kod pakovanih kolona? 5. Koje kriterijume treba da zadovolji stacionarna faza? Literatura 1. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd,

94 Gasna hromatografija 3. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 2, Library4science, R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series Book 4, Library4science, C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, S. Ahuja, Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier Science, San Diego, E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library Volume 69A, Elsevier, Amsterdam, F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, S. Ötles (Ed.) Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass Spectrometry A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA,

95 5. Tečna hromatografija visokih performansi HPLC Cilj poglavlja Upoznavanje sa principom rada tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i osnovnim delovima HPLC sistema. Upoznavanje sa kvalitativnim i kvantitativnim određivanjem jedinjenja primenom HPLC tehnike, kao i sa različitim režimima razdvajanja - na osnovu polarnosti, naelektrisanja i veličine molekula. Opis afinitetne hromatografije kao najspecifičnijeg oblika visokoefikasne tečne hromatografije. Prikaz primene HPLC tehnike u analizi prehrambenih proizvoda Uvod u HPLC Tečna hromatografija (engl. Liquid Chromatography, LC), je tehnika hromatografskog razdvajanja kod koje je mobilna faza tečnost. Tečna hromatografija može biti planarna (hromatografija na papiru ili tankom sloju) ili hromatografija u koloni. Moderna tečna hromatografija, kod koje se koriste manje čestice za pakovanje kolona i veći pritisci u koloni naziva se tečnom hromatografijom visokih performansi. Za tečnu hromatografiju visokih performansi, koja se ranije označavala kao tečna hromatografija pod visokim pritiskom, odomaćena je skraćenica HPLC, koja predstavlja akronim od High-Performance (pressure) Liquid Chromatography (engl.). Od godine, tečna hromatografija ultra performansi, UPLC (engl. Ultra-Performance Liquid Chromatography), dramatično je podigla mogućnosti tečne hromatografije na još viši nivo. Kao što je već pomenuto, tehniku tečne hromatografije je definisao ruski botaničar Mihail Cvet početkom dvadesetog veka, kada je razdvojio pigmente iz listova biljaka, nanoseći ekstrakt na kolonu pakovanu kalcijum-karbonatom i zatim propuštajući rastvarač, što je dovelo do pojave traka različitih boja, usled različite brzine kretanja komponenti ekstrakta kroz kolonu, Slika 5.1. Cvet je povezao te razdvojene, obojene trake sa različitim jedinjenjima koja su bila prisutna u ekstraktu pigmenata. Analitičko razdvajanje pigmenata zasnivalo se na različitoj jačini vezivanja svakog pojedinačnog jedinjenja za čestice pakovane kolone. Jedinjenja koja su bila jače vezana kretala su se sporije, dok su se jedinjenja koja su bila slabije vezana kretala brže kroz kolonu. Ovaj proces se može opisati na sledeći način: jedinjenja koja sadrži uzorak raspodeljuju se između rastvarača koji se kreće, i označava se kao mobilna faza, i čestica kojima je punjena (tj. pakovana) kolona, i koje se označavaju kao stacionarna faza. Ovo omogućava da se svako pojedinačno jedinjenje kreće različitom brzinom, što vodi razdvajanju jedinjenja određene smeše. Kovanicu hromatografija predložio je Cvet (hroma boja i graphein pisati), da bi opisao svoj eksperiment. Zanimljivo, prezime 89

96 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC ovog naučnika, Cvet (рус. Цвет), na ruskom znači boja. U današnje vreme, tečna hromatografija, u svojim različitim oblicima, je postala jedna od najmoćnijih metoda u analitičkoj hemiji. Ekstrakt biljaka Slika 5.1. Eksperiment M. Cvet-a 5.2. Tehnike tečne hromatografije Tečna hromatografija može biti planarna (hromatografija na tankom sloju ili na papiru) ili hromatografija na koloni. Kod svih ovih tehnika, uzorak se najpre mora rastvoriti a zatim naneti na/u uređaj za hromatografisanje. Na primeru razdvajanja smeše FD&C boja, koje se koriste u prehrambenoj industriji, prikazan je dalje u tekstu princip hromatografije na tankom sloju, papiru i u koloni. Kod hromatografije na tankom sloju (engl. thin-layer chromatography, TLC) uzorak se kreće kroz tanki sloj čestica (stacionarna faza) koje su fiksirane na površini staklene ploče (Slika 5.2). Donja ivica ploče je smeštena u rastvarač. Do protoka rastvarača dolazi zahvaljujući kapilarnim silama, kada rastvarač (mobilna faza) difunduje u tanki sloj suvih čestica i penje se uz staklenu ploču. Obratite pažnju da je crni uzorak (Slika 5.2, levo) smeša FD&C žute, crvene i plave boje koje se koriste u industriji hrane i koja se hromatografski razdvaja (Slika 5.2, desno). Kod hromatografije na papiru, uzorak se nanosi na papir (nosač stacionarne faze), a rastvarač se zatim nanosi na centar mrlje (tj. uzorka), da bi se postigao spoljašnji radijalni protok. Ovo je jedan od oblika hromatografije na papiru. Klasična papirna hromatografija se izvodi na način sličan opisanoj hromatografiji na tankom sloju, sa 90

97 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC linearnim tokom tečnosti. Na Slici 5.3 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C boja papirnom hromatografijom. Kadica za analizu Rastvarač Nulto vreme Rastvarač Posle 10 minuta Slika 5.2. Tankoslojna hromatografija razdvajanje FD&C boja za industriju hrane Očigledna je razlika u moći razdvajanja ove vrste papirne hromatografije i hromatografije na tankom sloju. Zeleni prsten ukazuje da se ovom tehnikom ne mogu razdvojiti žuta i plava boja jedna od druge, ali se ove boje mogu odvojiti od crvenih boja (vrh Slike 5.3). Na dnu Slike 5.3, zeleni uzorak, koji čine žuta i plava boja, nanesen je na papir. Kao što se može videti, ove dve boje se ne mogu razdvojiti primenjenom tehnikom. U sredini Slike 5.3, ljubičasti uzorak, koji čine crvena i plava boja, nanesen je na papir. Očigledno je da se ove boje mogu razdvojiti primenjenom tehnikom hromatografije na papiru. Žuta 5 Plava 1 / Žuta 5 Crvena Crvena 3 40 Crvena 40 Plava 1 Plava 1 / Žuta 5 Opaska: ovaj papir ne može da razdvoji plavu od žute boje, pa se one pojavljuju kao zelena! Slika 5.3. Hromatografija na papiru razdvajanje FD&C boja za industriju hrane 91

98 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Kod hromatografije u koloni uzorak prolazi kroz kolonu (ili kertridž engl. cartridge), koja sadrži odgovarajuče čestice (stacionarna faza). Te čestice se još nazivaju materijal za pakovanje hromatografske kolone. Rastvarač (mobilna faza) teče, tj. kreće se kroz kolonu i pri tome struja rastvarača nosi uzorak kroz kolonu. Kao i u Cvet-ovom eksperimentu, jedinjenja iz uzorka se razdvajaju zahvaljujući različitim brzinama putovanja kroz kolonu. Na Slici 5.4 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C boja primenom ekstrakcije čvrstom fazom (engl. Solid-Phase Extraction, SPE). U tehnici ekstrakcije čvrstom fazom koristi se uređaj za hromatografisanje koji se zove kertridž, obično uz protok rastvarača pod dejstvom sniženog pritiska. Ekstrakcija čvrstom fazom koristi se da bi se analizirale ili prečistile veoma kompleksne smeše pre njihovog daljeg ispitivanja. Kao što je prikazano na Slici 5.4, različiti rastvarači su korišćeni u svakom pojedinačnom koraku da bi se postiglo razdvajanje smeše FD&C boja. Kada se koristi oblik kertridža, postoji nekoliko načina da se postigne odgovarajući protok rastvarača. Gravitacija ili vakuum se koriste za kolone koje nisu dizajnirane da izdrže povišeni pritisak. Čestice su u tom slučaju većeg promera (> 50 mikrona), tako da pružaju manji otpor proticanju rastvarača. Za prečišćavanje i pripremu uzoraka takođe mogu da se koriste i male plastične kolone, koje imaju oblik šprica, i koje su napunjene odgovarajućim materijalom za pakovanje. Čestice manjih dimenzija (<10 mikrona) su potrebne da bi se povećala moć razdvajanja. Međutim, manje čestice daju veći otpor protoku tečne faze, pa su potrebni viši pritisci da bi se dobila odgovarajuća brzina proticanja rastvarača. Tada su potrebne pumpe i kolone dizajnirane tako da mogu da proizvedu i izdrže visok pritisak. Ako se primenjuju umereno visoki do visokih pritisaka da bi rastvarač tekao kroz hromatografsku kolonu, tada se hromatografska tehnika naziva HPLC. Nanošenje uzorka Eluiranje Stupanj 1 Eluiranje Stupanj 2 Eluiranje Stupanj 3 Opaska: plava boja se može eluirati smešom izopropilalkohol/voda Jedan kertridž može da razdvoji sve tri boje Slika 5.4. Hromatografija na koloni (ekstrakcija čvrstom fazom) razdvajanje FD&C boja za prehrambenu industriju 92

99 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC 5.3. Šta je HPLC? Akronim HPLC, predložen od strane prof. Horváth-a godine, pre svega je ukazivao na činjenicu da se u tečnoj hromatografiji, kada se primenjuju pakovane kolone, koristi visok pritisak da bi se omogućio protok rastvarača. U početku, pumpe su imale sposobnost da proizvedu pritisak od 500 psi (35 bar). Takva tehnika je označena kao tečna hromatografija pod visokim pritiskom, HPLC (engl. High-Pressure Liquid Chromatography). Početkom godine dolazi do ogromnog tehnološkog napretka, pa su novi HPLC instrumenti mogli da razviju pritisak do 6000 psi (400 bar) i uključivali su unapređene i poboljšane injektore, detektore i kolone. Sa daljim poboljšanjem performansi instrumenata (manje čestice za pakovanje kolona, još viši pritisci), akronim HPLC ostaje isti, ali se naziv menja u tečna hromatografija visokih performansi (engl. High-Performance Liquid Chromatography). Tečna hromatografija visokih performansi je danas jedna od najmoćnijih tehnika u analitičkoj hemiji. Ona pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog određivanja jedinjenja koja su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u tečnosti. Danas, jedinjenja u tragovima, čija je koncentracija reda veličine parts per trillion (ppt), mogu lako da se identifikuju uz pomoć tečne hromatografije visokih performansi. HPLC može da se primeni na skoro svaki uzorak, kao što su lekovi, prehrambeni proizvodi, kozmetika, uzorci iz životne sredine, forenzički uzorci i industrijske hemikalije. HPLC je brza tehnika kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska; zatim veoma efikasna tehnika za razdvajanje, zahvaljujući česticama malih dimenzija kojima se pune kolone, a koje imaju veliku specifičnu površinu za interakcije između stacionarne faze i molekula koji se razdvajaju; i takođe osetljiva tehnika kod koje se detektuju veoma male koncentracije analita. Značajna karakteristika HPLC metode jeste ta da je često pogodna za analizu organskih jedinjenja koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasnohromatograsku analizu bez prethodne derivatizacije. Broj publikovanih HPLC metoda je danas toliko veliki da se pretraživanjem literature mogu pronaći hromatografski uslovi za skoro bilo koju vrstu jedinjenja. U analizi hrane, HPLC se primenjuje za nekoliko kategorija jedinjenja: ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive, sintetičke boje, prirodne pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide), aminokiseline i druga jedinjenja. Od godine dalji napredak u tehnologiji izrade instrumenata i kolona doveli su do značajnog povećanja rezolucije, brzine i osetljivosti tečne hromatografije. Kolone sa još manjim česticama (1,7 mikrona) i instrumenti dizajnirani za rad na pritiscima od psi (1000 bar) potrebni su da se postigne novi nivo mogućnosti u tzv. tečnoj hromatografiji ultra performansi (engl. Ultra-Performance Liquid Chromatography, UPLC). Osnovna istraživanja se danas izvode i sa kolonama koje sadrže čestice koje su prečnika manjeg od 1 mikrona, i instrumentim sposobnim da rade na pritiscima od 93

100 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC psi (6800 bar). Ovi podaci nam pružaju dovoljno informacija o onome što možemo očekivati u budućnosti Princip rada tečne hromatografije visokih performansi Pod principom rada HPLC-a podrazumeva se forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smeše) kroz kolonu, odnosno cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a time i velike površine, pri čemu se tečnost (mobilna faza) pumpa pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smeše na koloni. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vreme za koje se supstanca eluira, tj. dođe do kraja kolone (drugim rečima vreme koje provede u stacionarnoj fazi) naziva se redukovano retenciono vreme i ono je karakteristično za određenu supstancu (Poglavlje 1.2.). Korišćenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje jedinjenjima manje vremena za zadržavanje na koloni, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastvarači, čisti ili kao smeše (npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja Osnovni delovi HPLC sistema Osnovni delovi HPLC sistema su prikazani na Slici 5.5. U rezervoaru se nalazi rastvarač, tj. mobilna faza. Pumpa za proizvodnju visokog pritiska (sistem za isporuku, tj. raznošenje rastvarača) se koristi za generisanje i održavanje specifičnog protoka mobilne faze, koji je obično reda veličine mililitar po minuti. Injektor (sistem za upravljanje uzorcima) služi za uvođenje, tj. injektovanje (engl. inject) uzorka u kontinualni tok mobilne faze koja ga nosi u HPLC kolonu. Kolona je napunjena česticama hromatografskog materijala, koji je neophodan da bi došlo do razdvajanja komponenti unetog uzorka. Materijal kojim je pakovana kolona se naziva stacionarnom fazom. Kolona je smeštena u termostatu koji održava temperaturu kolone konstantnom u toku analize, što je veoma značajno jer promena temperature utiče na raspodelu ispitivanog jedinjenja između stacionarne i mobilne faze, kao i na njegovu rastvorljivost i viskoznost mobilne faze. Detektor je neophodan da se vide trake razdvojenih jedinjenja nakon što se ona eluiraju sa HPLC kolone. Mobilna faza zatim napušta detektor i može biti poslata u otpad, ili po želji prečišćavana. Cevi i ostali delovi opreme koja se koristi za povezivanje pumpe, injektora, kolone i detektora, da bi se omogućio nesmetani protok mobilne faze i uzorka, izrađeni su od materijala koji može da podnese visok pritisak. 94

101 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Slika 5.5. Schema sistema za tečnu hromatografiju visokih performansi - tečnog hromatografa Legenda : (1) Rezervoari rastvarača, (2) Uređaj za degaziranje rastvarača, (3) Gradijentni ventil, (4) Posuda za mešanje i isporuku mobilne faze, (5) Pumpa za proizvodnju visokog pritiska, (6) Injekcioni ventil u poziciji za injektovanje, (6') Injekcioni ventil u poziciji za punjenje (engl. load position), (7) Petlja za injektovanje uzorka, (8) Pretkolona, (9) Analitička kolona, (10) Detektor, (11) Kompjuter - obrada podataka, (12) Kolektor za otpad ili frakcioni kolektor. Detektor je povezan sa kompjuterom koji obrađuje dobijene podatke. Detektor beleži i obrađuje električni signal potreban za generisanje hromatograma na ekranu. Hromatogram omogućava identifikaciju i kvantitativno određivanje koncentracije pojedinačnih jedinjenja u analiziranoj smeši (Slika 5.5) Injektor Injektor predstavlja deo HPLC sistema putem koga se uzorak uvodi u kolonu. Injektovanje je jedan od kritičnih momenata HPLC analize. Ako se injektovanje ne izvodi pažljivo, čak i najbolja kolona može da da loše rezultate razdvajanja. U teoriji, veoma mala zapremina uzorka treba da se uvede u centar vrha kolone, vodeći računa da se spreči ulaženje vazduha u isto vreme. Postoji više načina da se uzorak injektuje: pomoću šprica i septuma, pomoću injekcionog ventila sa petljom ili pomoću automatskog sistema za injektovanje, tj. autosemplera (engl. autosampler). Mada je injektovanje kroz septum na vrh kolone najdirektniji način nanošenja uzorka, koji daje najmanje moguće širenje hromatografskih traka, takav način nije pogodan za HPLC. Injektovanje kroz septum je jedino prihvatljivo pri pritiscima nižim od 100 bar, mada uvek postoji opasnost od zapušenja igle česticama septuma, a osim toga septum mora da bude hemijski stabilan preme različitim mobilnim fazama koje se koriste za hromatografisanje. 95

102 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Najčešće se injektovanje izvodi putem petlje, u koju se se uzorak unosi mikrolitarskim špricem, tako što se iglom probode zaptivena guma na ulazu u petlju. Prebacivanjem injekcionog ventila iz položaja za punjenje u položaj za injektovanje, mobilna faza se usmerava kroz petlju, povlači uzorak sa sobom i unosi ga u kolonu (Slika 5.5). Petlje su dizajnirane tako da se specifična zapremina injektuje u kolonu i dostupne su u veličinama od 5 do 2000 µl. One se lako vezuju za ventil i lako menjaju. Manje zapremine uzoraka, koje su potrebne kod rada sa mikrokolonama, najbolje je injektovati koristeći specijalan ventil sa petljom kapaciteta od 0,5 do 5 µl. Nedostatak ovakvog manuelnog injektora je što se svaki uzorak mora posebno injektovati. Autosempler omogućava da se automatski injektuje jedan uzorak za drugim, čime se obezbeđuje da se bez prisustva analitičara uradi sto i više analiza Stacionarna faza kolona Stacionarna faza tj. kolona predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika ili stakla i njihov izbor zavisi od prirode supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti različite dužine, najčešće od 2,5 do 25 cm (i više), sa različitim unutrašnjim prečnikom (najčešće 2,0-4,6 mm) i različitim dijametrom čestica (od 2 do 50 µm). Uobičajeni materijali za pakovanje HPLC kolona su sledeći: silika-gel, kopolimeri na bazi stirena i divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje. Hemijska struktura silikagela prikazana je na Slici 5.6. Slobodni silanol Siloksan Geminalni silanoli Vodonično vezani silanoli Kiseli silanol blizu Me + Slika 6. Hemijska struktura silika-gela Silika-gel može hemijski da se modifikuje na različite načine, što je prikazano na Slici 5.7, pa se tako dobija veliki broj materijala koji se koriste za punjenje HPLC kolona, tj. kao stacionarne faze (Tabela 5.1). Izbor vrste kolone zavisi od vrste analize, tj. od primene. 96

103 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Anhidrovani uslovi Anhidrovani uslovi = Silika-gel Slika 5.7. Hemijske modifikacije silika-gela Veliki broj HPLC razdvajanja izvodi se na sobnoj temperaturi. U slučajevima kada temperaturu kolone treba promeniti, to može da se učini pomoću odgovarajućeg vodenog kupatila ili peći za zagrevanje kolone. Ako se HPLC kolonama rukuje na pravilan način, one mogu da imaju dug vek trajanja. Kolone mogu često da se regenerišu propuštanjem serije rastvarača u kojoj se povećava sposobnost eluiranja, što je zatim praćeno propuštanjem rastvarača obrnutog redosleda u pogledu sposobnosti eluiranja (npr. heksan-metilenhlorid, metanol- metilenhlorid-heksan). Zapremina svakog od upotrebljenih rastvarača za ispiranje treba da bude oko 20 zapremina kolone, i propušta se pri veoma visokom protoku. Najvažniji koraci koji mogu da se preduzmu za zaštitu HPLC kolone su filtracija rastvarača, filtracija rastvorenog uzorka, upotreba dodatnih filtera i/ili pretkolona (engl. guard column), pažljivo rukovanje, održavanje priključaka čistim i izbegavanje preteranog zatezanja, i čuvanje dobro zatvorne kolone u odgovarajućem rastvaraču kada je van upotrebe. 97

104 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Tabela 5.1. Funkcionalne grupe u hemijski modifikovanom silika-gelu Grupa Formula Grupa Formula Triakontil Difenil Dokosil Oktadecil Amino Oktil Nitro Heksil Nitrilna (Cijano) Trimetilsilil vic-hidroksil (diol) Cikloheksil Fluoralkil Fenil Dimetilamino Oksipropannitril Alkilkarbamat Poli(kaprolaktam) Mobilna faza Mobilna faza za HPLC analizu treba da se bira tako da pre svega dobro rastvara sve komponente ispitivane smeše. Drugim rečima, ako se analiziraju nepolarna jedinjenja, tada biramo nepolarne rastvarače, i obrnuto - pri analizi polarnih jedinjenja kao mobilna faza se biraju polarni rastvarači. Polarnost mobilne faze može da se varira 98

105 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC od puferovanih vodenih rastvora do ugljovodonika. Rastvarači koji se koriste kao mobilna faza moraju biti odgovarajuće čistoće, bez stranih primesa organskog i neorganskog porekla. HPLC rastvarači su komercijalno dostupni i treba ih uvek koristiti. Takođe, mobilna faza mora biti oslobođena mehurića gasova. Zbog toga se pre upotrebe mobilna faza filtrira i degazira. Degaziranje može biti postignuto na različite načine: primenom toplote, sniženog pritiska ili ultrazvuka, ili produvavanjem inertog gasa kao što je helijum. Poslednji način je najpogodniji, s obzirom da omogućava kontinualno degaziranje tokom izvođenja eksperimenta. Neki od problema koje rastvarači mogu da prouzrokuju ako nisu degazirani su: nastajanje mehurova vazduha u pumpi, što vodi gubitku protoka rastvarača; formiranje mehurića na izlazu iz kolone, gde nastaje visok pritisak koji vodi ozbiljnom narušavanju hromatograma i pomeranje bazne linije zbog rastvorenog vazduha. Mobilna faza ne sme da menja karakteristike kolone i mora da bude kompatibilna sa detektorom. Viskoznost, temperatura, ph vrednost mobilne faze i protok biraju se u zavisnosti kako od primenjene stacionarne faze, tako i od prirode analizirane supstance Pumpa Pumpe koje se koriste za HPLC sisteme moraju biti izrađene od materijala koji je otporan na rastvarče koji se koriste kao mobilna faza. Takođe moraju biti sposobne da proizvedu i izdrže pritiske do 6000 psi, i da obezbede protoke od 1 do 10 pl/min, pa sve do 0,5 do 10 ml/min. Kako se efikasnost razdvajanja povećava sa opadanjem protoka mobilne faze, generalno je poželjan nizak protok. Pumpe su elektronski kontrolisane da regulišu pritisak i protok mobilne faze u veoma uskom opsegu. Programator se obično koristi za regulisanje isporuke rastvarača ili smeše rastvarača konstantnog (izokratski način) ili promenljivog sastava (gradijentni način eluiranja). Veoma je važno da se pumpa redovno održava, da bi protok rastvarača tokom hromatografisanja bio konstantan. Promena u protoku rastvarača će uticati na retenciona vremena analiziranih jedinjenja, i zbog toga može doći do grešaka u identifikaciji uzorka. Reproduktivnost hromatograma, kako standarda, tako i uzoraka, je od suštinskog značaja. Pritisak koji obezbeđuje pumpa zavisi od dimenzija kolone i veličine čestica kojima je pakovana, a isto tako i od protoka i viskoznosti mobilne faze koja se koristi Detektor Detektor je vezan na izlaz HPLC kolone i njegova uloga je da prati rastvor koji se eluira sa kolone u realnom vremenu. Detektor je uglavnom najsofisticiraniji i najskuplji deo HPLC opreme. Kako karakteristike jedinjenja prisutnih u uzorku mogu biti veoma različite, razvijeno je nekoliko tipova detektora. Postoje selektivni detektori, koji daju različite odgovore u zavisnosti od strukture analiziranog uzorka, i tzv. univerzalniji detektori, kod kojih je odgovor sličan za većinu jedinjenja. Na primer, ako 99

106 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC jedinjenje apsorbuje ultraljubičastu ili vidljivu svetlost, koristi se UV-Vis apsorbujući detektor (engl. ultraviolet-visible detector). Ako jedinjenje ima sposobnost fluorescencije, koristi se fluorescentni detektor. Oba tipa detektora su selektivni detektori. Ako analizirano jedinjenje nema ni jednu od pomenutih karakteristika, koristi se univerzalniji tip detektora, kao što je RI detektor, tj. detektor koji radi na principu prelamanja svetlosti (engl. refractive index detector), ili ELSD detector, tj. detektor koji radi na principu isparavanja i rasipanja svetlosti (engl. evaporative-light-scattering detector). Najbolji pristup je korišćenje više serijski vezanih detektora. Recimo, UV-Vis i/ili ELSD detektor mogu da se koriste u kombinaciji sa masenim spektrometrom (MS), da bi se analizirali rezultati HPLC razdvajanja. To omogućava sveobuhvatnije informacije o ispitivanom uzorku (analitu), na osnovu samo jednog HPLC injektovanja. Kuplovanje HPLC sistema sa masenim spektrometrom se u praksi zove LC/MS. UV-Vis detektor je selektivniji i osetljiviji od RI detektora. Dok je UV-Vis detektor u stanju da detektuje količinu supstance od g/ml, osetljivost RI detektora je u oblasti od 10-7 g/ml. Osetljivost fluorescentnih detektora je u oblasti od g/ml za izabrana jedinjenja. Osetljivost detektora se definiše kao odnos odgovora detektora prema koncentraciji uzorka. HPLC detektori mogu da apsorbuju u tri različite optičke apsorpcione oblasti: ultraljubičastoj ( nm), vidljivoj ( nm) i infracrvenoj oblasti (IR engl. infrared, 2,5-25 µm). Postoje tri glavne klase optičkih apsorpcionih detektora: a) detektori koji rade na fiksnoj talasnoj dužini u UV oblasti, gde je obično talasna dužina fiksirana na 254 ili/i 280 nm; b) UV-Vis detektori sa promenljivom talasnom dužinom; i c) IR apsorpcioni detektori. Najmanje se koriste IR detektori, koji imaju ograničenu osetljivost i kod kojih se kao problem javljaju značajne smetnje zbog uticaja rastvarača. Njihova glavna upotreba je u okviru ekskluzione hromatografije. Veoma bitna karakteristika pri izboru detektora je i da li je on destruktivan prema ispitivanom uzorku ili ne. Uobičajeno korišćeni optički detektori nisu destruktivni, pa je nakon hromatografisanja moguće prečistiti analizirano jedinjenje i koristiti ga u daljim koracima za karakterizaciju. Gradijentno eluiranje zahteva detektor koji će biti neosetljiv na promenu sastava rastvarača. UV-Vis i fluorescentni detektori zadovoljavaju ovaj zahtev, za razliku RI detektora, koji se veoma retko koristi za gradijentno eluiranje, Očigledno je, da kao i kod drugih tehnika za hromatografisanje, ne postoji univerzalni detektor za HPLC. UV-Vis, fluorescentni i elektrohemijski detektori su bazirani na specifičnoj prirodi supstance koja se analizira. Na primer, jedinjenje koje hromatografišemo apsorbuje svetlost određene frekvence, dok sistem rastvarača u kome se analiza izvodi tu istu svetlost ne apsorbuje. S druge strane, RI detektori reaguju na promenu indeksa prelamanja, koji je karakteristično svojstvo rastvora. Promena 100

107 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC indeksa prelamanja je direktni rezultat eluiranja rastvorenog hemijskog jedinjenja koje se hromatografiše. U nekim slučajevima, potrebno je modifikovati eluat da bi uzorak mogao da se detektuje. Ti slučajevi se odnose na detektore koji zahtevaju isparavanje rastvarača koji se koristi za eluiranje, pre detekcije jedinjenja koje se analizira. Ovo uključuje FID i masene detektore (videti Poglavlje 3 o gasnoj hromatografiji). Mogućnost detekcije nekih jedinjenja može se poboljšati hemijskom derivatizacijom pre HPLC analize, ili posle hromatografskog razdvajanja a pre detekcije (tzv. derivatizacija posle kolone). Postoje raznovrsne komercijalno dostupne mogućnosti, od strane nekoliko proizvođača, da se drugi način, tj. derivatizacija posle kolone automatizuje. U rutinskoj analizi prehrambenih proizvoda, 90 % analiza se vrši uz upotrebu UV-Vis ili RI detektora. Fluorescentni detektor se koristi u 8-9 % slučajeva, dok se detektori koji rade na principu amperometrijske provodljivosti koriste u 1-2 % slučajeva Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om Jednostavan način da se razume kako dolazi do razdvajanja jedinjenja nekog uzorka u HPLC koloni je prikazan na Slici 5.8. Traka injektovanog uzorka - pojavljuje se kao crna boja (smeša plave, crvene i žute ) Nulto vreme Mobilna faza Nulto vreme + 10 minuta Mobilna faza Trake analita Slika 5.8. Hromatografske trake - ilustracija rada hromatografske kolone Mobilna faza ulazi u kolonu sa leve strane, prolazi kroz čestice kojima je napunjena kolona i izlazi sa desne strane. Smer protoka mobilne faze je predstavljen zelenim strelicama. Gornji deo Slike 8 predstavlja kolonu u nultom vremenu (trenutak kada se injektuje uzorak), kada uzorak ulazi na kolonu i počinje da formira traku. Ispitivani uzorak, koji je smeša jedinjenja žute, crvene i plave boje, javlja se na ulasku u kolonu kao jedna crna traka. U stvarnosti, ovaj uzorak može biti bilo šta što se može rastvoriti u 101

108 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC rastvaraču. Tipično jedinjenje će biti bezbojno a zid kolone neproziran, tako da bi bio neophodan detektor da se vide razdvojena jedinjenja nakon što se eluiraju sa kolone. Nakon nekoliko minuta (donji deo Slike 5.8), tokom kojih mobilna faza teče kontinualno i stalno prolazi kroz čestice materijala kojim je napunjena kolona, možemo da vidimo da su se jedinjenja premestila u odvojene trake, što znači da su se kretala različitim brzinama kroz kolonu. Razlog ovakvom ponašanju je postojanje konkurencije između mobilne i stacionarne faze za privlačenje svakog od jedinjenja, tj. analita. Može se primetiti da se traka žute boje kreće najbrže i samo što nije izašla iz kolone. Jedinjenje žute boje je vezano za mobilnu fazu jače od jedinjenja dugih boja i zbog toga se kreće većom brzinom, koja je bliska brzini kretanja mobilne faze. Jedinjenje plave boja više voli materijal za pakovanje kolone nego mobilnu fazu. Ono je jako vezana za čestice stacionarne faze, što prouzrokuje da se značajno sporije kreće kroz kolonu. Drugim rečima, jedinjenje plave boje se najduže zadržava na koloni od svih komponenti ispitivane smeše. Traka crvene boje kreće se srednjom brzinom kroz kolonu, odnosno jedinjenje crvene boje vezano je srednjom jačinom za mobilnu fazu. Kako se svaka od traka kreće različitom brzinom, ova tri jedinjenja je moguće hromatografski razdvojiti. HPLC kolona Detektor protočna ćelija Injektovanje Start Bazna linija Slika 5.9. Hromatogram kao rezultat obrade električnog signala u kompjuteru vezanom za HPLC hromatograf Čim razdvojene trake analizirane smeše napuste kolonu, odmah prelaze na detektor. Detektor ima protočnu ćeliju koja vidi, tj. detektuje svaku pojedinačnu traku, tj. jedinjenje. Odgovarajući detektor ima sposobnost da oseti prisustvo određenog jedinjenja i da pošalje odgovarajući električni signal kompjuteru za obradu podataka. Izbor se vrši između mnogo različitih tipova već pomenutih detektora, a u zavisnosti od osobina i koncentracije jedinjenja koja treba da se razdvoje i analiziraju. Idealan detektor bi trebalo da je visoko osetljiv, odnosno utoliko je bolji ukoliko daje veći signal pri niskoj koncentraciji analizirane supstance. Zatim, detektor treba da bude pogodan za 102

109 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC sva jedinjenja u ispitivanoj smeši i da se njegov odgovor ne menja sa promenama u sastavu mobilne faze i temperature. Detektor treba da daje brz odgovor proporcionalan koncentraciji, tj. da ima širok opseg linearnosti i mali šum na baznoj liniji. Najzad, odgovor detektora treba da bude nezavistan od mobilne faze, inertan prema dejstvu mobilne faze i treba da bude lak i jednostavan za upotrebu. Danas su najčešće u upotrebi UV/VIS, fluorescentni, infracrveni, maseni, elektrohemijski, kao i detektori bazirani na indeksu refrakcije. Kao rezultat obrade električnog signala koji je poslat detektoru, dobija se HPLC hromatogram. Hromatogram je grafički prikaz razdvajanja koje se odigralo u HPLC sistemu. Serija pikova koji se izdižu iznad bazne linije nacrtana je na vremenskoj osi. Svaki pik predstavlja odgovor detektora na različito hemijsko jedinjenje (Slika 5.9). Žuta traka na Slici 5.9 je potpuno prošla kroz protočnu ćeliju detektora i generisani električni signal je poslat kompjuteru za obradu podataka. Rezultujući hromatogram se pojavljuje na ekranu. Hromatogram u stvari počinje kada se uzorak injektuje, i to kao prava linija pri dnu ekrana, koja se naziva baznom linijom. Bazna linija predstavlja čistu mobilnu fazu koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora tokom vremena. Kako traka žutog jedinjenja prolazi kroz protočnu ćeliju, sve jači signal se šalje kompjuteru. Površina ispod krive linije, koja je najpre uzlazna, a zatim silazna, proporcionalna je koncentraciji jedinjenja žute boje u uzorku. Na ovaj način kreira se pik u hromatogramu. Nakon što žuta traka potpuno izađe iz ćelije detektora, nivo signala se vraća na baznu liniju. Kroz detektor sada ponovo prolazi samo čista mobilna faza. Kako se žuta traka kreće najbrže, eluirajući se najbrže sa kolone, to je prvi pik koji se javlja u hromatogramu. Malo kasnije, crvena traka stiže do protočne ćelije detektora. Signal se ponovo diže sa osnovne linije kako crvena traka ulazi u detektor, i pik koji predstavlja crvenu traku počinje da se pojavljuje na ekranu. Na Slici 5.9 crvena traka još uvek nije potpuno prošla kroz protočnu ćeliju detektora. Slika pokazuje kako bi crveni pik izgledao ako bi u ovom trenutku zaustavili proces hromatografisanja. S obzirom da je veći deo crvene trake prošao kroz ćeliju, veći deo pika je nacrtan, kao što pokazuje puna linija na Slici 5.9. Kada bi proces hromatografisanja restartovali, crvena traka bi potpuno prošla kroz ćeliju detektora i crveni pik bi bio potpun (isprekidana linija). Plava traka, koja se najduže zadržala na koloni, odnosno koja putuje najmanjom brzinom, eluira se sa kolone posle crvene trake. Isprekidana linija pokazuje kako bi izgledao potpuni hromatogram, ako bismo pustili proces hromatografisanja do kraja. Zanimljivo je primetiti da bi širina plavog pika bila najveća, zbog toga što se plava traka kreće najsporije kroz pakovanu kolonu i zahteva više vremena i veću zapreminu mobilne faze da bi se potpuno eluirala. Pošto mobilna faze teče konstantnom brzinom, plava traka se širi i razblažuje. Kako detektor reaguje proporcionalno koncentraciji trake, to za posledicu ima da je plavi pik manji po visini ali veće širine u poređenju sa prethodna dva pika. 103

110 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC 5.7. Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om Na Slici 5.9 su tri obojena jedinjenja su predstavljena sa tri pika na hromatogramu, koja su razdvojena u vremenu. Svaki se pojavljuje u posebnom vremenskom trenutku, odnosno na posebnom retencionom vremenu (tr), koje se meri od momenta kada se uzorak injektuje (nulto vreme) do trenutka kada se javlja maksimalna vrednost, tj. vrh pika. Poređenjem retencionih vremena svakog pojedinačnog pika sa retencionim vremenima odgovarajućih referentnih standarda, koji se pod istim uslovima hromatografišu (ista mobilna i stacionarna faza, protok i temperatura), nepoznata jedinjenja se mogu identifikovati. Na Slici 5.10 vidi se da će, pod određenim uslovima za hromatografisanje, analit, u ovom slučaju akrilamid, imati retenciono vreme od 2,85 minuta (Uzorak A). Kada se novi uzorak, koji sadrži akrilamid, injektuje u HPLC sistem pod istim hromatografskim uslovima, njegov pik će se takođe pojaviti na 2,85 minuta (Uzorak B). Kada je jedinjenje idetifikovano, sledeći važan korak je ustanoviti količinu, tj. koncentraciju jedinjenja u ispitivanom uzorku. Hromatogram i odgovarajući podaci sa detektora omogućavavaju da se koncentracija prisutnog jedinjenja izračuna. Kako detektor reaguje na koncentraciju jedinjenja, veća koncentracija će davati veći signal, što će se u hromatogramu videti kao viši pik iznad iznad bazne linije. Na Slici 5.10, hromatogrami uzoraka A i B su prikazani na istoj vremenskoj skali, jedan iznad drugog. Ista zapremina uzorka je injektovana u oba slučaja, i oba hromatograma pokazuju pikove na retencionom vremenu od 2,85 minuta, što ukazuje da svaki od uzoraka sadrži akrilamid. Međutim, uzorak A pokazuje mnogo veći pik akrilamida. Površina ispod pika je mera koncentracije prisutnog jedinjenja. Vrednost površine se integrali i računa automatski od strane kompjutera vezanog na HPLC uređaj. U slučaju sa Slike 5.10, pik za akrilamid u uzorku A ima 10 puta veću površinu od pika u uzorku B. Nepoznata koncentracija uzorka, u ovom slučaju akrilamida, može se odrediti metodom normalizacije pikova, metodom eksternog standarda ili metodom internog standarda. Metoda internog standarda, koja se smatra najpouzdanijom, zasniva se na dodatku odabrane supstance (interni standard) rastvorima akrilamida poznatih koncentracija i rastvoru uzorka nepoznate koncentracije, u potpuno istoj koncentraciji. Pik izabranog internog standarda mora biti dobro razdvojen od pika analiziranog jedinjenja, ali ne i previše udaljen od njega. Takođe je potrebno da bude slične hemijske strukture kao i ispitivano jedinjenje, kako bi se izbegle razlike u odgovoru detektora, a i da bi se mogla koristiti ista kolona za hromatografisanje. Dobar interni standard za određivanje nepoznate koncentracije akrilamida HPLC-om je npr. metakrilamid, i ova metoda se koristi prilikom određivanja akrilamida u suncokretovom ulju za pripremu hrane. Precizno pripremljeni standardni rastvori se zatim injektuju u HPLC sistem i nakon hromatografisanja se izračunava odnos površine pika supstance koja se analizira 104

111 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC i internog standarda. Kalibraciona kriva se konstruiše koristeći odnose površine pika standarda i internog standarda u funkciji od koncentacije standardnih rastvora. Na opisani način može se izračunati da Uzorak A sadrži 10 pikograma akrilamida, što je deset puta više od količine akrilamida u uzorku B (1 pikogram). U hromatogramima uzoraka A i B može se takođe uočiti još jedan neidentifikovani pik na retencionom vremenu od 1,8 minuta. Kako je površina ovog pika u oba uzorka otprilike ista, to nepoznato jedinjenje može imati istu koncentraciju u oba uzorka. Akrilamid Uzorak B Injektovanje 1 pg t R = 2:85 Akrilamid Uzorak A 10 pg Površina ispod pika t R pg Retenciono vreme identifikacija uzorka Površina ispod pika kvantitativno odreďivanje Injektovanje t R = 2:85 Slika Identifikacija i kvantitativno određivanje HPLC metodom 5.8. Izokratsko i gadijentno eluiranje U HPLC-u se koriste dva osnovna načina eluiranja. Prvi je izokratsko eluiranje, kod koga sastav mobilne faze, bilo da se radi o čistom rastvaraču ili o smeši rastvarača, ostaje isti tokom hromatografisanja. Tipičan izokratski sistem eluiranja je prikazan na Slici Drugi način eluiranja je gradijentno eluiranje, kada se, kao što samo ime ukazuje, sastav mobilne faze menja tokom HPLC razdvajanja. Ovaj način je koristan za uzorke koji sadrže jedinjenja u širokom opsegu polarnosti, kada izokratsko eluiranje ne dovodi do zadovoljavajućeg razdvajanja komponenti ispitivane smeše. Naime, na početku eksperimenta mobilna faza može eluirati neke komponente smeše ali je previše slaba da bi eluirala ostale komponente. Dakle snaga, odnosno sposobnost eluiranja mobilne faze će se tokom eksperimenta povećavati, da bi se da bi se eluirala jedinjenja koja su jače vezana za stacionarnu fazu. U najjednostavnijem slučaju, u okviru HPLC sistema, 105

112 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC kada se koristi gradijentno eluiranje, postoje dve boce sa rastvaračem i dve pumpe (Slika 5.12). Slika Izokratski sistem eluiranja pod visokim pritiskom Brzina svake pumpe se kontroliše, da bi se isporučilo manje ili više rastvarača tokom razdvajanja. Dve struje rastvarača se mešaju u mešaču (mikseru) da bi se dobio stvarni sastav mobilne faze koja se isporučuje koloni tokom vremena. Na početku eksperimenta, mobilna faza sadrži veći udeo rastvarača koji eluira jedinjenja slabije vezana za stacionarnu fazu (rastvarač A, Slika 5.12). Tokom vremena, udeo rastvarača koji eluira jedinjenja jače vezana za stacionarnu fazu se povećava (rastvarač B, Slika 5.12), prema određenom režimu. HPLC kolona Hromatogram Injektor Rastvarač B Mikser Kompjuterska obrada podataka Uzorak Rastvarač A Detektor Pumpe Otpad Slika Gradijentni sistem eluiranja pod visokim pritiskom 106

113 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Na Slici 5.13 uređaj za mešanje rastvarača se nalazi posle pumpi, tako da se gradijent stvara pod visokim pritiskom. Drugi HPLC sistemi su dizajnirani da mešaju više struja rastvarača pod niskim pritiskom, ispred jedne pumpe, kao što je prikazano na Slici Ventil za formiranje gradijenta bira udeo svakog od rastvarača iz četiri boce, menjajući na taj način jačinu, tj. sposobnost eluiranja mobilne faze. Rastvarač D HPLC kolona Hromatogram Rastvarač B Rastvarač C Injektor Rastvarač A Kompjuterska obrada podataka Ventil za formiranje Gradijenta Pumpa Uzorak Detektor Slika 13. Gradijentni HPLC sistem pod niskim pritiskom Otpad 5.9. Analitički, preparativni i industrijski HPLC Do sada je pokazano kako HPLC analiza obezbeđuje podatke koji mogu biti korišćeni kako za idektifikaciju, tako i za kvantitativno određivanje jedinjenja prisutnih u analiziranom uzorku (analitički HPLC). Međutim, HPLC takođe može da se koristi za prečišćavanje i sakupljanje željene količine svakog od analiziranih jedinjenja, uz primenu frakcionog kolektora, koji se montira iza protočne ćelije detektora. Ovaj proces se naziva preparativnom hromatografijom, tj. preparativni HPLC. U preparativnoj hromatografiji je moguće prikupiti individualna jedinjenja, tj. analite, po redosledu kako se ona eluiraju, odnosno izlaze sa kolone. Frakcioni kolektor selektivno sakuplja eluat u određenom vremenskom periodu, pri čemu sakupljeni eluat sada sadrži prečišćeni analit. Prihvatni sudovi kolektora se pomeraju, tako da svaki sakuplja samo jedno jedinjenje, tj. jedan eluirani pik. Analitičar koji je odgovoran za HPLC eksperiment utvrđuje koji nivo čistoće i koju količinu analita želi da dobije kao rezultat. Postavljeni ciljevi u pogledu čistoće i količine analita koji želi da se dobije, zajedno sa informacijama 107

114 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC o prirodi i složenosti uzorka, sa druge strane određuju veličinu uzorka za hromatografisanje i potreban kapacitet kolone. U principu, kako se količina uzorka povećava, neophodna je i veća HPLC kolona. Određivanje kapaciteta HPLC sistema naziva se izbor HPLC skale. U Tabeli 5.2 prikazane su različite HPLC skale i njihovi hromatografski ciljevi. Tabela 5.2. Različite HPLC skale Skala Hromatografski cilj Analitička Informacije - identifikacija jedinjenja i koncentracija Semi-preparativna Podaci i mala količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g) Preparativna Veća količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g) Industrijska Proizvodne količine prečišćenog jedinjenja ( g kg) Maksimalno povećanje selektivnosti sa određenom kombinacijom stacionarne i mobilne faze, postizanjem najboljeg mogućeg razdvajanja između dve komponente analiziranog uzorka, je kritični momenat u određivanju zahteva za skaliranje hromatografskog razdvajanja. Kapacitet HPLC sistema tada postaje pitanje skaliranja zapremine kolone (Vc) prema količini uzorka koji će se injektovati, kao i izbora odgovarajuće veličine čestica, što određuje pritisak u koloni i efikasnost kolone. Zapremina kolone, koja zavisi od njene dužine (L) i unutrašnjeg prečnika (r), određuje količinu materijala za pakovanje (čestica) koju kolona treba da sadrži. Generalno, HPLC kolone su dužine od 2 do 50 cm, i unutrašnjeg prečnika 1 do 100 mm (Slika 5.14). Kako se hromatografska skala povećava, tako se povećavaju i dimenzije kolone, naročito njihov prečnik (Tabela 5.3). Analitičke Preparativne Unutrašnji prečnik 1 mm 50 mm Dužina 2 50 cm Slika Dimenzije HPLC kolona 108

115 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Da bi se optimizovao protok, on se mora povećati u srazmeri sa površinom poprečnog preseka kolone. Ako je poželjna manja veličina čestica za veću moć razdvajanja, tada pumpa mora biti dizajnirana da održi visok protok mobilne faze pri visokom povratnom pritisku. Tabela 5.3 prikazuje jednostavne smernice za izbor kolone odgovarajućeg unutrašnjeg prečnika koji se preporučuje za svaku skalu hromatografije. Tabela 5.3. Hromatografska skala prema unutrašnjem prečniku kolone i prečniku čestica za pakovanje kolone Skala Prečnik kolone, 1-8 mm Prečnik kolone, mm Prečnik kolone, mm Prečnik kolone, 100 mm Veličina čestica, m Analitička x 1,7-10 Semi-preparativna x 5-15 Preparativna x Industrijska x Na primer, za primenu u okviru preparativne skale koristila bi se kolona unutrašnjeg prečnika mm, koja sadrži čestice veličine mikrona. Optimalna dužina kolone tada može da se izračuna na osnovu količine prečišćenog jedinjenja koja želi da se obradi u svakom eksperimentu i na osnovu zahtevane moći razdvajanja Performanse hromatografskog razdvajanja Rezolucija Stepen do koga su jedinjenja razdvojena naziva se hromatografskom rezolucijom. Dva glavna faktora koji određuju moć razdvajanja ili rezoluciju koja se može postići HPLC kolonom su: sposobnost mehaničkog razdvajanja, koja je određena dužinom kolone, veličinom čestica i uniformnošću pakovanja i sposobnost hemijskog razdvajanja, koja je određena fizičko-hemijskim takmičenjem za jedinjenja, između stacionarne i mobilne faze. Efikasnost kolone je mera mehaničke sposobnosti razdvajanja, dok je njena selektivnost mera hemijske sposobnosti razdvajanja Sposobnost mehaničkog razdvajanja efikasnost Ako je kolona stabilna i uniformno pakovana, sposobnost mehaničkog razdvajanja je određena njenom dužinom i veličinom čestica kojima je napunjena. Sposobnost mehaničkog razdvajanja, koja se zove efikasnost kolone, se često meri i predstavlja brojem podova 109

116 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC (N). Kolone punjene manjim česticama imaju veću efikasnost i viši povratni pritisak. Za određenu veličinu čestica dobija se veća sposobnost mehaničkog razdvajanja sa povećanjem dužine kolone. Međutim, povećanje dužine kolone vodi dužim vremenima potrebnim za hromatografisanje, većoj potrošnji rastvarača i većim povratnim pritiscima. Kraće kolone minimiziraju sve prethodno navedeno, ali takođe imaju manju efikasnost, kao što je prikazano na Slici 5.15.A. A) 50 mm 100 mm B) 50 mm 5 m 50 mm 1,7 m Slika A) Dužina kolone i sposobnost mehaničkog razdvajanja (pri istoj veličini čestica) i B) Veličina čestica i sposobnost mehaničkog razdvajanja pri istoj dužini kolone Pri određenoj hemijskoj strukturi čestica za punjenje kolone, određenoj mobilnoj fazi i protoku, kolona iste dužine i unutrašnjeg prečnika, ali punjena manjim česticama, imaće veću sposobnost mehaničkog razdvajanja (Slika 5.15.B). Međutim, njen povratni pritisak će biti mnogo veći nego u koloni za čije punjenje su korišćene čestice većih dimenzija Sposobnost hemijskog razdvajanja selektivnost Izbor kombinacije vrste stacionarne faze (hemijske strukture čestica) i sastava mobilne faze, odnosno izbor sistema za razdvajanje, određuje stepen hemijskog razdvajanja, tj. selektivnost. Optimizacija selektivnosti je najefikasniji način za postizanje razdvajanja, koji može otklaniti nepovoljne eksperimentalne uslove neophodne kod najvećih mogućih mehaničkih efikasnosti. Da bi se postiglo razdvajanje bilo koja dva jedinjenja, analitičar može da bira kako između velikog broja kombinacija stacionarne i mobilne faze, tako i retencionih mehanizama, odnosno načina za hromatografisanje. O tome će biti reči u sledećem Poglavlju. 110

117 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Režimi HPLC razdvajanja U principu, tri osnovne karakteristike hemijskih jedinjenja mogu da se koriste da bi se postiglo HPLC razdvajanje: polarnost, naelektrisanje i veličina molekula. Prvo će biti razmatrana polarnost i dva osnovna načina razdvajanja koji se zasnivaju na ovoj karakteristici: hromatografija normalnih faza i hromatografija reverznih faza. Na osnovu polarnosti stacionarne i mobilne faze, HPLC se deli na dve različite podklase. Režim ili tehnika kod koje je stacionarna faza polarnija od mobilne faze (npr. toluen kao mobilna faza a silika-gel kao stacionarna faza), naziva se hromatografijom normalnih faza (engl. normal phase liquid chromatography, NPLC). Suprotno, kada je mobilna faza polarnija od stacionarne faze (npr. voda-metanol kao mobilna faza i oktadecilsilil- modifikovani silika-gel kao stacionarna faza, C18), takva tehnika se naziva hromatografijom reverznih faza (engl. reversed phase liquid chromatography, RPLC). Ironija je da hromatografija normalnih faza ima znatno manju primenu od hromatografije reverznih faza, koja se znatno više koristi Razdvajanje na osnovu polarnosti Struktura molekula i njegove fizičko-hemijske karakteristike su određeni rasporedom njegovih konstitutivnih atoma i vrstama veza između njih. Specifični raspored određenih atoma, koji je odgovoran za specijalna svojstva i predvidive hemijske reakcije molekula, naziva se funkcionalna grupa. Funkcionalna grupa često određuje da li je molekul polaran ili nepolaran. Organska jedinjenja su klasifikovana prema funkcionalnim grupama koje sadrže. Kada se razdvajanje zasniva na polarnosti jedinjenja, relativno hromatografsko zadržavanje različitih vrsta molekula u velikoj meri zavisi od prirode i položaja funkcionalnih grupa. Kao što je prikazano na Slici 5.16, klase organskih jedinjenja mogu se poređeti u niz, od veoma polarnih do veoma nepolarnih. Polarni molekul Nepolarni molekul Soli Alkoholi Etri Aromatični ugljovodonici Fluoralkani Kiseline Ketoni Halogenalkani Alifatični ugljovodonici Slika Niz hromatografske polarnosti prema funkcionalnoj gupi analita 111

118 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Voda, mali molekul sa velikim dipolnim momentom, je polarno jedinjenje. Benzen, aromatični ugljovodonik, je nepolarno jedinjenje. Molekuli sa sličnom polarnošću imaju tendenciju da se međusobno privlače, dok se oni sa različitom polarnošću ili mnogo slabije privlače, ili čak odbijaju. Pravilo slično privlači slično postaje osnova za hromatografske režime razdvajanja koji se zasnivaju na različitoj polarnosti. Da bi se dobio efikasan sistem za hromatografsko razdvajanje, biraju se mobilna i stacionarna faza različitih polarnosti. Jedinjenja iz uzorka koja su slične polarnosti sa stacionarnom fazom (tj. sa materijalom za pakovanje kolone), će se mnogo sporije kretati kroz kolonu, zato što su jače vezana za čestice stacionarne faze. S druge strane, jedinjenja slične polarnosti sa mobilnom fazom kretaće se brže. Na osnovu ovih razlika u relativnom vezivanju jedinjenja za stacionarnu/mobilnu fazu dolazi do njihovog razdvajanja, i to zahvaljujući različitoj brzini kretanja svakog pojedinačnog jedinjenja kroz kolonu. Slike 5.17 i 5.18 prikazuju tipične opsege polarnosti za mobilne i stacionarne faze. Niz koji je prikazan na Slici 5.17, na kome su neki uobičajeni rastvarači poređeni po relativnoj polarnosti, naziva se eluotropnom serijom. Molekuli mobilne faze, koji se takmiče sa molekulima analita za pogodna mesta vezivanja za stacionarnu fazu, pomeraju analite, prouzrokujući njihovo brže kretanje kroz kolonu, tj. manje zadržavanje. Voda je polarni kraj ovog niza mobilnih faza, tj. rastvarača, dok je heksan, alifatični ugljovdonik, nepolarni kraj. Između se nalaze pojedinačni rastvarači, kao i smeše rastvarača (sa odnosom rastvarača pogodnim za određeno hromatografsko razdvajanje), koji su poređani po eluacionoj sposobnosti. Koji kraj ovog niza predstavlja najjaču mobilnu fazu, zavisi od prirode površine stacionarne faze gde se odigrava takmičenje za molekule analita. Polarni molekul Nepolarni molekul Mobilne faze Voda Alkohol Acetonitril THF Heksan Slika Niz mobilnih faza (rastvarača) različite polarnosti Površina silika-gela je hidrofilna površina koja sadrži kisele silanolne grupe. Zbog toga se silika-gel nalazi na polarnom kraju niza stacionarnih faza, što je prikazano na Slici Polarnost ili aktivnost površine silika-gela može biti modifikovana hemijskim vezivanjem manje polarnih grupa (engl. bonded phase). Primeri koji su prikazani na Slici 18, redosledom opadajuće polarnosti, obuhvataju cijanopropilsilil- 112

119 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC (CN), n-oktilsilil- (C8) i n-oktadecilsilil (C18, ODS) grupe na silika-gelu. Modifikacija silika-gela n-oktadecilsilil- grupama daje veoma nepolarne, hidrofobne stacionarne faze. Polarni molekul Nepolarni molekul Stacionarne faze Silika-gel CN C8 C18 (ODS) Slika Niz stacionarnih faza različite polarnosti Za datu stacionarnu fazu analitičar mora da izabere odgovarajuću mobilnu fazu, odnosno najbolju kombinaciju faza suprotnih polarnosti. Hromatografsko pravilo slično privlači slično određuje koji će se od analita kretati sporije a koji brže kroz kolonu. Između rastvarača sličnih polarnosti, razmatra se koji od njih, u kombinaciji sa datom stacionarnom fazom, može najbolje iskoristiti suptilne razlike u polarnosti i rastvorljivosti različitih analita iz uzorka, i na taj način maksimalno povećati selektivnost hromatografskog sistema. Razdvajanje na bazi polarnosti podrazumeva dobro poznavanje uzorka i iskustvo sa različitim analitima i režimima razdvajanja HPLC normalnih faza Prilikom razdvajanja ekstrakta dobijenog iz listova biljaka, Cvet je koristio polarnu stacionarnu fazu (kalcijum-karbonat u staklenoj cevi, Slika 5.1), u kombinaciji sa mnogo manje polarnom, tj. nepolarnom mobilnom fazom. Ovaj klasični način hromatografisanja je postao poznat kao hromatografija normalnih faza. Polarna stacionarna faza silika -gel Nepolarna mobilna faza heksan Uzorak Razdvajanje komponenti uzorka Slika Hromatografija normalnih faza Slika 5.19 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja test smeše koju čine tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima normalnih faza. 113

120 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Stacionarna faza je polarna (silika-gel) i najjače zadržava polarno žuto obojeno jedinjenje. Nepolarno plavo obojeno jedinjenje se eluira brzo, zahvaljujući najboljoj rastvorljivosti u mobilnoj fazi (heksan). Kako je plavo obojeno jedinjenje slično mobilnoj fazi (oboje su nepolarni), ono se kreće najbrže. Crveno jedinjenje je po polarnosti između žutog i plavog, pa se zbog toga kreće brzinom koja je veća od brzine kretanja žutog a manja od brzine kretanja plavog jedinjenja. Opisano ponašanje je tipično za hromatografiju normalnih faza HPLC reverznih faza Hromatografija reverznih faza opisuje način razdvajanja koji je upravo obrnut od hromatografije normalnih faza, naime koristi se nepolarna (hidrofobna) stacionarna faza i polarna mobilna faza. Slika 5.20 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja test smeše koju čine tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima reverznih faza. Sada je za stacionarnu fazu najjače vezano nepolarno plavo obojeno jedinjenje i ono se najduže zadržava na nepolarnoj stacionarnoj fazi. Polarno žuto jedinjenje, koje je najslabije vezano, kreće se najbrže kroz čestice stacionarne faze, i zbog toga eluira najranije sa kolone. Nepolarna stacionarna faza C18 Polarna mobilna faza vodeni rastvor Uzorak Razdvajanje komponenti uzorka Slika hromatografija reverznih faza U današnje vreme, zbog veće reproduktivnosti i širokog opsega primene, reverzno-fazna hromatografija se koristi u otprilike 75 % svih HPLC metoda. Mnoge od reverzno-faznih metoda koriste kao mobilnu fazu smešu vode i nekog polarnog organskog rastvarača, kao što je acetonitril ili metanol. Ovakav sastav mobilne faze obezbeđuje odgovarajuću interakciju analita sa površinom nepolarnih, hidrofobnih čestica stacionarne faze. Nepolarna kolona koja je punjena modifikovanim C18 silikagelom (ODS kolona, tj. n-oktadecilsilil- modifikovani silika-gel) je najpopularnija i najčešće korišćena vrsta reverzno-fazne kolone. 114

121 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija je jedna od varijanti hromatografije normalnih faza. U hromatografiji normalnih faza, mobilna faza je 100 % organski rastvarač. Jedino tragovi vode mogu biti prisutni u mobilnoj fazi i u porama materijala kojim je pakovana HPLC kolona. Polarni molekuli se vezuju veoma čvrsto za stacionarnu fazu i ponekad ne mogu da se eluiraju. Dodavanjem izvesne količine vode (< 20 %) organskoj mobilnoj fazi, koja je obično aprotični rastvarač kao npr. acetonitril, omogućeno je razdvajanje i eluiranje polarnih jedinjenja koja su čvrsto vezana za stacionarnu fazu u hromatografskom režimu normalnih faza. Voda, kao veoma polarni rastvarač, efikasno se takmiči sa polarnim analitima u vezivanju za stacionarnu fazu. Razdvajanje na bazi hidrofilnih interakcija može da se izvodi primenom bilo izokratskog, bilo gradijentnog načina za eluiranje. Polarna jedinjenja, koja su inicijalno vezana za čestice polarnog materijala kojim je pakovana kolona, mogu se eluirati sa povećanjem polarnosti mobilne faze, tj. sa povećanjem udela vode u smeši sa organskim rastvaračem. Analiti se tada eluiraju redosledom u kome se povećava njihova hidrofilnost, odnosno polarnost izražena relativno prema vodi. Puferi ili soli se takođe mogu dodati mobilnoj fazi da bi se analiti koji mogu da jonizuju zadržali u nejonizovanom obliku Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija Razdvajanje na osnovu hidrofobnih reakcija je jedna od varijanti hromatografije reverznih faza, koja se koristi za razdvajanje velikih biomolekula, kao što su proteini. Poželjno je da ovi molekuli ne menjaju strukturu, odnosno da ostanu intaktni u vodenim rastvorima, izbegavajući kontakt sa organskim rastvaračima ili supstancama koje mogu da ih denaturišu. Hromatografsko razdvajanje zasnovano na hidrofobnim intereakcijama velikih molekula sa umereno hidrofobnim stacionarnim fazama, na primer sa češće korišćenim butilsilil-modifikovanim silika-gelom (C4 kolone), nego oktadecilsililmodifikovanim silika-gelom (C18 kolone). Početno veća koncentracija soli u vodi će podstaći proteine da se da se zadrže na česticama kojima je pakovana kolona (tzv. isoljavanje ). Stepen razdvajanja se uobičajeno postiže smanjenjem koncentracije soli. Na ovaj način, biomolekuli se eluiraju redosledom u kome se povećava njihova hidrofobnost Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena Pokazano je da za razdvajanje na bazi polarnosti važi hromatografsko pravilo slično privlači slično. U hromatografiji koja se zasniva na izmeni jona, i naziva se jonska hromatografija (engl. ion-exchange chromatography), kao i u drugim metodama razdvajanja koje se zasnivaju na naelektrisanju, ovo pravilo je obrnuto. Kod ovih metoda slično i slično se odbijaju, dok se suprotnosti privlače. 115

122 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Jonska hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje imaju neki adsorbensi. Adsorbensi mogu biti sintetički i prirodni, a takođe neorganskog i organskog porekla, i nazivaju se jonskim izmenjivačima. Jonski izmenjivači se dele na katjonske i anjonske, u zavisnosti od toga da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone i koriste se kao stacionarne faze u jonskoj hromatografiji. Katjonski izmenjivači se koriste za zadržavanje i razdvajanje pozitivno naelektrisanih jona, tj. katjona, na negativno naelektrisanoj površini. Obrnuto, anjonski izmenjivači se koriste za zadržavanje i razdvajanje negativno naelektrisanih jona, tj. anjona, na pozitivno naelektrisanoj površini (Slika 5.21). U praksi se uglavnom koriste polimeri na bazi polistirena koji je umrežen divinilbenzenom, koji se nazivaju jonoizmenjivačke smole. Smole sadrže aktivne kisele ili bazne funkcionalne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora. Katjonski izmenjivači sadrže kisele grupe, kao što su sulfonske kiseline ( SO3H) i karboksilne kiseline ( COOH), a anjonski izmenjivači sadrže bazne grupe, kao što su hidroksilne ( OH) ili amino grupe ( NH2, NHR, NR2). Negativno naelektrisani analit (anjon) vezan za pozitivno naelektrisanu površinu Čestica stacionarne faze + (anjonski + + jonoizmenjivač) Pozitivno naelektrisani analit (katjon) vezan za negativno naelektrisanu površinu Čestica stacionarne faze (katjonski jonoizmenjivač) Slika Principi hromatografije zasnovane na izmeni jona U jonskoj hromatografiji mobilna vaza je obično vodeni rastvor, koji sadrži konkurentne jone istog naelektrisanja kao i analiti koji se razdvajaju. Kada je potrebno, mobilnoj fazi se dodaje mala količina metanola ili acetona. Jonoizmenjivači tipa jakih baza ili jakih kiselina (npr. kvaternerni amini ili sulfonska kiselina) imaju funkcionalne grupe koje su uvek u jonizovanom obliku. Tipična primena takvih jonoizmenjivača je za razdvajanje jona koji mogu biti eluirani 116

123 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC istiskivanjem, pomoću mobilne faze koja sadrži jone koji se mogu jače vezati za stacionarnu fazu. Alternativno, joni analita mogu zaostati na koloni, a zatim biti neutralizovani promenom ph vrednosti mobilne faze in situ, što dovodi do njihovog naknadnog eluiranja. Jonoizmenjivači tipa slabih baza i slabih kiselina (npr. sa sekundarnim amino ili sa karboksilnim funkcionalnim grupama), mogu biti neutralizovani iznad ili ispod određene ph vrednosti, pri čemu gube sposobnost zadržavanja jona. Slabi jonoizmenjivači se za razdvajanje jona koriste u jonizovanom obliku. Ako se joni analita, vezani za jonoizmenjivač, ne mogu eluirati istiskivanjem, tada se mesta za izmenu, odnosno joni izmenjivača, moraju neutralizovati. Neutralizacija vodi onemogućavanju privlačenja jona analita od strane stacionarne faze i dozvoljava njihovo eluiranje. Kada se slabi jonoizmenjivači neutralizuju, oni mogu zadržavati i razdvajati analite na osnovu hidrofobnih (reverzno fazno razdvajanje) ili hidrofilnih interakcija (razdvajanje na principu normalnih faza). U ovim slučajevima, sposobnost eluiranja je određena polarnošću mobilne faze (Slika 5.17), pa tako slabi jonoizmenjivači mogu da se koriste za razdvajanje analita koje je zasnovano i na njihovoj polarnosti i na naelektrisanju. U Tabeli 5.4. prikazane su glavne smernice za primenu jonske hromatografije. Na primer, da bi se zadržao veoma bazni analit (pozitivno naelektrisan) na stacionarnoj fazi, koristiće se slabi katjonski izmenjivač pri ph > 7, što obezbeđuje negativno naelektrisanu površinu stacionarne faze. Da bi se eluirala jaka baza, ph vrednost mobilne faze mora biti niža od 3, što dovodi do neutralizovanja naelektrisanja na površini stacionarne faze i onemogućava dalju razmenu i zadržavanje jona. Ne treba koristiti jake katjonske izmenjivače za hromatografisanje jakih baza to će rezultovati jakim privlačenjem analita i stacionarne faze koji će ostati naelektrisani, te će biti gotovo nemoguće eluirati bazu sa kolone. Tada se baza jedino može ukloniti istiskivanjem sa konkurentnom bazom koja pokazuje još jače vezivanje za jone stacionarne faze. Ovaj pristup retko ima praktičnu primenu, zbog toga što je opasno raditi sa veoma jakim bazama i kiselinama u HPLC tehnici. Veoma jake kiseline i baze takođe mogu biti korozivne prema materijalima koji se koriste za izradu HPLC kolona i ostalih delova instrumenta. Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje koncentracije jona, razdvajanje elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, itd. Pomoću katjonskih izmenjivača se mogu razdvojiti aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza. Anjonski izmenjivači se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, aldehida, ketona, organskih kiselina male molske mase, itd. Nitriti u povrću, fluoridi u pastama za zube, organske kiseline u pićima, amonijum, kalijum, nitrati i fosfati u zemljištu i veštačkim đubrivima su samo neki od specifičnih primera primene jonske hromatografije. 117

124 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Tabela 5.4. Smernice za jonsku hromatografiju Afinitetna hromatografija Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije. Kod afinitetne hromatografije specifičan molekul iz smeše vezuje se za kompatibilan molekul koji je kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz kolonu bez zadržavanja, kao što je to prikazano na Slici Najveći broj interakcija na kojima se zasniva afinitetna hromatografija su po prirodi biohemijske interakcije, npr. antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor. Visoko specifična priroda ovih interakcija leži u činjenici da dva jedinjenja koja učestvuju u njima idealno odgovaraju jedno drugom, kako u prostornom, tako i u elektrostatičkom pogledu. Jedno jedinjenje (ligand) je vezano za nosač (stacionarna faza), dok se drugo jedinjenje (uzorak) nalazi u odgovarajućem rastvaraču (mobilna faza). Proces vezivanja uzorka za ligand je reverzibilan. Uzorak se zadržava na stacionarnoj fazi, dok se drugi molekuli, koji ne mogu da se specifično vežu za stacionarnu fazu, eluiraju iz kolone mobilnom fazom. Uzorak se na taj način oslobađa pratećih nečistoća, a sa stacionarne faze se naknadno uklanjanja eluiranjem rastvorom koji sadrži neko jedinjenje sa još većim afinitetom prema ligandu ili promenom ph vrednosti ili jonske jačine mobilne faze. Kako bilo koja biohemijska interakcija može da se odigrava samo u jednoj, specifično definisanoj sredini, jasno je da promena ph ili koncentracije mogu raskinuti te specifične interakcije. Afinitetna hromatografija se razlikuje od drugih hromatografskih metoda po tome što pogodna stacionarna faza 118

125 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC hvata ili pojedinačnu komponentu ili eventualno nekoliko komponenti iz smeše jedinjenja, zahvaljujući nastajanju (bio)specifičnih veza. Zatim sledi pogodan proces eluiranja, koji obezbeđuje čisto jedinjenje, odnosno čisti željeni analit. Slika Princip afinitetne hromatografije U afinitetnoj hromatografiji se obično koriste kolone veoma malih dimenzija. Stacionarne faze za afinitetnu hromatografiju, koje mogu da se koriste za veoma različite procese razdvajanja, u današnje vreme su komercijalno dostupne. Mnoge od njih sadrže dugolančanu grupu, tzv. spejser (engl. spacer) između nosača na bazi silika-gela i liganda, da bi se obezbedio potpuno slobodan, nesmetani pristup molekula uzorka mestu za vezivanje, koje se nalazi na ligandu (Slika 5.23). Osim opisanim načinima koji uključuju uspostavljanje neke vrste gradijenta (ph, jonska jačina ili konkurentni uzorak), vezani uzorak se može eluirati i primenom sredstava koja menjaju strukturu analita, što uslovljava raskidanje interakcija između analita i liganda (npr. urea ili guanidin-hlorovodonik menjaju strukturu proteina). Ovu tehniku ipak treba izbegavati kad kod je to moguće, jer se može desiti, ako se npr. eluira protein, da dođe do njegove denaturacije. Stacionarna faza A Ligand 280 A 280 Biomolekul Spejser Neefikasno vezivanje Efikasno vezivanje Ligand je vezan direktno za stacionarnu fazu Ligand je vezan za stacionarnu fazu preko spejsera Slika Primer boljeg vezivanja biomolekula za ligand i boljeg eluiranja u prisustvu spejsera između liganda i stacionarne faze 119

126 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija Pedesetih godina prošlog veka, Porath i Flodin su otkrili da biomolekuli mogu da se razdvoje na osnovu njihove veličine, putem prolaženja ili filtriranja kroz hidrofilni polimer na bazi dekstrana, koji je imao kontrolisanu poroznost. Ovaj proces je označen kao gel filtriranje. Kasnije je analogna metoda primenjena za razdvajanje sintetičkih organskih oligomera i polimera. Za pakovanje kolona su korišćeni takođe organski polimeri sa specifičnim opsegom veličine pora. Ovaj proces je označen kao gel-propusna hromatograija (engl. Gel- Permeateon Chromatography, GPC). Slična razdvajanja su postignuta korišćenjem silika-gela kontrolisane poroznosti kao materijala za pakovanje kolona, pri čemu je takav proces označen kao ekskluziona hromatografija na osnovu veličine molekula (engl. Size-Exclusion Chromatography, SEC). Prvi komercijalni HPLC instrument, koji je plasiran na tržište godine od strane kompanije Waters (SAD), bio je upravo dizajniran za GPC primenu. Čestice umreženog polimera, koji se koristi za pakovanje kolone, u rastvaraču prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje gela. Raspodela veličina pora gela mora biti u opsegu koji dozvoljava polimernim molekulima (makromolekulima) da uđu u pore ili da, manje ili više, budu istisnuti iz zapremine pora. Gel-propusna hromatografija predstavlja specifični oblik tečno-tečne hromatografije, koji se zasniva na tom fenomenu. Dakle, kada rastvor polimera, koji sadrži makromolekule različitih veličina, dovedemo u kontakt sa gelom, iz rastvora će u gel moći da difunduju samo makromolekuli sa određenom hidrodinamičkom zapreminom, odnosno makromolekuli čiji je prečnik u rastvoru manji od prečnika pora gela (Slika 5.24). U rastvoru ostaju oni makromolekuli čiji je prečnik veći od prečnika pora gela. Slika Mehanizam razdvajanja makromolekula po veličini hidrodinamičke zapremine prilikom kretanja kroz GPC kolonu (Strelica označava smer kretanja rastvarača) 120

127 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Razdvajanje makromolekula po veličini se izvodi tako što se kroz kolonu, u kojoj se nalazi gel umreženog polimera, propušta rastvor polimera koji se analizira. Na Slici prikazano je razdvajanje polimera koji se sastoji od dve frakcije makromolekula različitih po veličini, tj. molskoj masi. Protok rastvarača Čestica umreženog, poroznog polimera Uzorak polimera Detektor Hromatogram Retenciono vreme Slika Razdvajanje makromolekula po veličini prilikom prolaska kroz GPC kolonu Granica faza gel/rastvarač, odnosno aktivna površina, je veoma velika, što vodi relativno kratkom vremenu koje je potrebno za uspostavljanje difuzione ravnoteže, odnosno raspodele makromolekula između rastvarača koji se kreće kroz kolonu (mobilna faza) i rastvarača koji miruje u porama čestica gela (stacionarna faza). Kod tehnike gel-propusne hromatografije, materijal kojim je pakovana kolona predstavlja nosač stacionarne faze. Slobodna zapremina između sfernih čestica gela omogućava neometan prolaz rastvarača i rastvorenih makromolekula kroz kolonu. Da bi mehanizam razdvajanja bio jasan, analizirani polimer na Slici 5.25 sastoji samo se od dve frakcije makromolekula, koji su prikazani u obliku kugli sa značajno različitim prečnicima. Manji makromolekuli mogu da difunduju u pore čestica gela, dok veliki makromolekuli ne mogu da difunduju i oni se kreću bez zadržavanja, zajedno sa rastvaračem, između čestica gela. Kretanje manjih molekula kroz kolonu se usporava usled difuzije u pore gela. Što je makromolekul manji, on se duže zadržava u koloni, usled dubljeg prodiranja u čestice pora gela. Zapremina rastvarača koja je neophodna da bi se makromolekul eluirao iz kolone je obrnuto proporcionalna njegovoj veličini što 121

128 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC je makromolekul manji, potrebna je veća zapremina rastvarača za njegovo eluiranje i obrnuto. Dakle, prilikom propuštanja rastvora polimera kroz GPC kolonu, kolonu će prvo napustiti veliki makromolekuli, a zatim manji, upravo kao što je prikazano na Slici Očigledno je da postoji veza između molske mase molekula (M) i zapremine rastvarača koja je potrebna za njegovo eluiranje (zapremina eluata ili eluaciona zapremina, Ve), koja se može iskoristiti za eksperimantalno određivanje molskih masa polimera: M = f(ve) Ova funkcija zavisi od više faktora: hemijske strukture gela kojim je napunjena kolona, hemijske strukture polimera koji se analizira i njegove koncentracije, vrste mobilne faze i brzine njenog proticanja kroz kolonu, kao i od temperature i dimenzija kolone. Za određenu vrstu gela i određeni rastvarač, pri konstantnoj temperaturi i konstantnoj brzini proticanja rastvarača, pri istim dimenzijama kolone, makromolekuli iste molske mase će napuštati kolonu posle tačno određene zapremine eluata koja protekne kroz kolonu. Danas je GPC jedna od najmoćnijih analitičkih tehnika za razumevanje i predviđanje svojstava polimera. Ona je takođe najpogodnija tehnika za karakterizaciju kompletne raspodele molskih masa polimera Gelhromatograf Danas na tržištu postoji veliki broj gelhromatografa, potpuno automatizovanih aparata, kojima je moguće veoma brzo i jednostavno odrediti molsku masu i raspodelu molskih masa polimera. Gelhromatograf se sastoji od sledećih delova: - Injektora sa petljom - Jedne ili više kolona koje služe za razdvajanje uzorka po hidrodinamičkim zapreminama, odnosno molskim masama makromolekula - Pumpe za proizvodnju visokog pritiska, kojom se podešava brzina proticanja mobilne faze - Detektora - Sistema za obradu podataka. Različiti polimeri daju rastvore različitih viskoznosti. Pumpa mora da obezbedi istu brzinu proticanja rastvora, nezavisno od razlike u viskoznosti. Takođe su neki detektori veoma osetljivi na preciznost protoka mobilne faze. Zbog toga konstantan protok mora biti suštinska karakteristika pouzdanog gelhromatografa. Kolone moraju da daju reproduktivne rezultate u dužem vremenskom periodu. Visoko efikasne kolone obezbeđuju maksimalnu sposobnost razdvajanja i brze analize. Detektori moraju da budu osetljivi i da pokazuju širok opseg linearnosti, kako bi mogli da reaguju na tragove analita, kao i na velike koncentracije, ako je potrebno. Kako sva jedinjenja prelamaju svetlost, diferencijalni refraktometar (RI) se koristi kao 122

129 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC univerzalni detektor. On je najčešće korišćeni detektor za praćenje raspodele molskih masa. Indeks prelamanja polimera je konstantan iznad molske mase od 1000, pa zbog toga detektor reaguje proporcionalno koncentraciji. Pored informacija o srednjim vrednostima molskih masa i raspodeli molskih masa polimera, koje se dobijaju sa RI detektorom, korišćenje UV apsorbujućih detektora može obezbediti informacije o sastavu polimera, dok detektori na bazi rasipanja svetlosti, u sprezi sa viskozimetrima daju informacije o strukturi polimera Materijal za pakovanje kolone nosač stacionarne faze Kao nosač stacionarne faze najčešće se primenjuju gelovi dobijeni bubrenjem umreženih polimera u rastvaraču u kome je rastvoren i polimer kome se određuje raspodela molarnih masa. Čestice gela treba da budu sfernog oblika, iste po veličini i što je moguće manje. Ove uslove je neophodno ispuniti da bi se uspostavila brza difuziona ravnoteža, odnosno raspodela makromolekula između mobilne i stacionarne faze. Kao materijali za punjenje kolona za GPC najčešće se koriste umreženi polistiren, polimetilmetakrilat i polivinilacetat. S obzirom da na uspešnost razdvajanja nema uticaja priroda nosača stacionarne faze, već veličina i raspodela pora po veličini, kao nosači stacionarne faze koriste se i porozno staklo i silica-gel. Ovi nosači stacionarnih faza primenjuju se kod određivanja raspodele molskih masa poliolefina, koji su rastvorni u ograničenom broju rastvarača, kao što su npr. trihlorbenzen i m-krezol, i to na povišenoj temperature iznad 110 C. Na temperaturama iznad 100 C umreženi sintetički polimeri su uglavnom nestabilni, pa ne mogu da se koriste kao nosači stacionarne faze. Umreženi dekstrani, umreženi poliakrilamid i porozni silika-gel koriste se kao nosači stacionarnih faza prilikom karakterisanja vodorastvornih polimera. Ovi nosači bubre u vodi ili se dobro kvase vodom Mobilna faza Mobina faza treba da bude dobar rastvarač za analite koji se hromatografišu i, takođe, mora da onemogućava bilo koju vrstu interakcije (na bazi polarnosti ili naelektrisanja) između analita i površine stacionarne faze, koje postoje kod konvencionalne HPLC tehnike. Ako se obezbede eksperimentalni uslovi bez interakcija analita sa materijalom za pakovanje kolone, biće omogućeno da se najveći molekuli eluiraju prvi, dok će manji putovati sporije i eluiraće se kasnije (ulaze/izlaze u veliki broj pora gela). Razdvajanje makromolekula je bazirano na njihovoj veličini u rastvoru i zbog toga uzorak mora da bude rastvoren u pogodnom rastvaraču. 123

130 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Pri analizi sintetičkih polimera nerastvornih u vodi, kao rastvarači se mogu koristiti svi organski rastvarači u kojima dobro bubri umreženi polimer i dobro se rastvara polimer koji se ispituje. Najčešće se u praksi koriste tetrahidrofuran, hloroform i toluen. Koncentracija uzorka polimera u rastvoru zavisi od njegove molske mase, pa je npr. za vrednosti molskih masa od ~ uobičajeno se radi sa koncentracijama od 0,10 % (m/v) Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom GPC tehnikom može da odredi nekoliko parametara koji su važni za karakterizaciju polimera. To su molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti, molska masa srednja po masenoj zastupljenosti, srednja z vrednost molske mase i najosnovnija karakteristika polimera kriva raspodele molskih masa, koja je, zajedno sa označenim srednjim vrednostima (momentima krive raspodele), prikazana na Slici Ovi parametri su veoma važni, s obzirom da utiču na mnoga karakteristična fizička svojstva polimera. Kriva raspodele molskih masa polimera predstavlja matematičku funkciju koja povezuje zastupljenost svake pojedine vrste makromolekula (wi na Slici 5.26) i njegovu molsku masu. M i Slika Diferencijalna kriva raspodele molskih masa polimera Legenda: molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti; - molska masa srednja po masenoj zastupljenosti; - srednja z vrednost i srednja viskozimetrijska vrednost molske mase. Niskomolekulske supstance se sastoje od molekula istog hemijskog sastava i iste molske mase, pa su zbog toga monodisperzne. Monomeri, kao što su etilen, stiren, vinilhlorid i drugi, su monodisperzni. Ovo ne važi za polimere, zato što se oni sastoje od 124

131 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC makromolekula istog hemijskog sastava ali različite veličine, odnosno različitih molskih masa. Polimeri su polidisperzni u odnosu na veličinu makromolekula, odnosno molsku masu. Zbog toga se za polimere koriste srednje vrednosti molskih masa, od kojih najveći značaj upravo imaju, i. Izuzetak su veoma retki slučajevi polimera koji mogu biti monodisperzni, tačnije veoma blizu monodisperznom uzorku, i koji se dobijaju specijalni tehnikama anjonske polimerizacije, a koriste se kao standardi za kalibraciju GPC instrumenata. Širina GPC pika odražava širinu raspodele veličina molekula za određeni uzorak polimera. Širi pik znači da uzorak ima širu raspodelu molskih masa, i obrnuto. Širina raspodele molskih masa izražava se indeksom polidisperznosti (polimolekularnosti), koji predstavlja odnos vrednosti molske mase polimera po masenoj zastupljenosti i vrednosti molske mase po brojnoj zastupljenosti, /. Ukoliko je polimer polidisperzniji utoliko su razlike u vrednostima i veće, pa je i njihov odnos veći. Ako je polimer monodisperzan, indeks polidisperznosti iznosi 1. Kada se dobije kriva raspodele molskih masa uzorka polimera, potreban je dalje način da se ona kvantifikuje. Srednje vrednosti molskih masa su statističke veličine. Da bi se srednje vrednosti mogle izračunati, instrument mora da se kalibriše. Za kalibraciju, tj. eksperimentalno određivanje funkcije M = f(vi), koriste se tri načina: - Konstruisanje kalibracione krive na osnovu standardnih uzoraka ispitivanog polimera, koji imaju poznate molske mase i veoma usku raspodelu ( / < 1,10), - Primena uzorka ispitivanog polimera sa širokom, ali poznatom raspodelom molskih masa i - Metoda univerzalne kalibracije Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom raspodelom molskih masa Kada se za kalibraciju koriste standardni uzorci koji imaju različite molske mase i veoma usku raspodelu, potrebno je da se za seriju uzoraka (obično desetak) ispitivanog polimera, odrede eluacione krive i sa njih očita vrednost eluacionih zapremina, Ve, koje odgovaraju maksimumu na krivoj (Slika 5.27). Ekperimentalno je pokazano da je zavisnost logaritamskih vrednosti poznatih molskih masa polimera, Mi, od odgovarajućih očitanih vrednosti Ve, za veliki broj polimera pravolinijska, i to u širokom opsegu molskih masa. S obzirom da makromolekuli različitih polimera, iste molske mase, imaju različite hidrodinamičke zapremine (zbog različite hemijske strukture i interakcija sa rastvaračem), to praktično znači da se za svaki polimer mora konstruisati posebna kalibraciona kriva. Na tržištu se mogu nabaviti standardi polistirena, polimetilmetakrilata, poliizoprena, polietilenoksida, polietilenglikola, dekstrana i pululana, uskih raspodela molskih masa, koji se koriste za GPC kalibraciju. Molske mase standarda određuju se nekom od apsolutnih metoda, na primer: 125

132 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC - može da se dobije membranskom osmometrijom ili analizom završnih grupa (titracija, NMR), - može da se dobije metodom rasipanja svetlosti, - vrednost može da se dobije ultracentrifugiranjem. Polidisperzni uzorak Signal detektora Monodisperzni standardi logm i M i Isključeni makromolekuli Molekuli koji delimično prodiru u gel Molekuli koji potpuno prodiru u gel V i V e Slika Konstruisanje kalibracione krive logmi Ve, za određivanje molske mase nepoznatog uzorka polimera Kada se izvrši kalibracija GPC instrumenta, sve ove srednje vrednosti mogu da se dobiju na osnovu samo jednog injektovanja. Izračunavanje raspodele molskih masa iz podataka dobijenih GPC metodom zasniva se na činjenici da je odgovor detektora proporcionalan koncentraciji polimera u rastvoru koji protiče kroz kolonu, pa je zbog toga i površina ograničena baznom linijom i krivom, koja prikazuje promenu odgovora detektora sa eluacionom zapreminom, proporcionalna ukupnoj masi uzorka polimera koji je hromatografisan (Slika 5.28). Kod difrakcionog refraktometra kao detektora, odgovor detektora predstavlja razliku u indeksima prelamanja ( n) čistog rastvarača (eluent) i rastvora makromolekula (eluat), koja se kontinualno meri. 126

133 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Da bi se dobio maseni udeo pojedinih frakcija polimera, površina treba da se podeli na odgovarajući broj intervala (Slika 5.28), pri čemu je visina, hi, koja odgovara sredini intervala, proporcionalna masi frakcije, čija je molska masa Mi. Maseni udeo frakcije, wi, sada može da se izračuna iz izraza: Molska masa frakcije Mi se očitava sa kalibracione krive, za odgovarajuću eluacionu zapreminu Ve,i. Koristeći određene vrednosti za wi i Mi, za sve frakcije, može se konstruisati kriva raspodele molskih masa hromatografisanog polimera. Srednje vrednosti molskih masa mogu se izračunati prema sledećim jednačinama: Svi gelhromatografi su su automatizovani i povezani sa sistemom za obradu podataka, tj. kompjuterom, koji je povezan sa detektorom, a isto tako i sa meračem zapremine rastvora koja istekne iz kolone. U memoriju kompjutera ubace se podaci za kalibracionu krivu i program po kome se rezultati obrađuju. Kao rezultat hromatografisanja uzorka polimera dobijamo izračunatu krivu njegove raspodele molskih masa i sve srednje vrednosti. Normalizovana površina w i = 1 w i Eluaciona zapremina V i Slika Idealizovani hromatogram uzorka polimera i podela na intervale koji odgovaraju određenim molskim masama 127

134 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa Gelhromatograf se takođe može kalibrisati korišćenjem standarda koji ima široku raspodelu molskih masa i istu hemijsku strukturu kao i ispitivani uzorak polimera nepoznate raspodele molskih masa. Standardi sa širokom raspodelom molskih masa, dobro okarakterisani u pogledu, i, mogu se kupiti od različitih proizvođača. Srednje vrednosti molskih masa ovih standarda određene su drugim metodama kao što su na primer membranska osmometrija, rasipanje svetlosti i ultracentrifugiranje. Alternativno, i aktuelnom uzorku za analizu (ako ga ima u dovoljnoj količini) mogu se odrediti molske mase pomenutim tehnikama. Srednje vrednosti molskih masa se unose u softver kompjutera i standard sa širokom raspodelom molskih masa se zatim hromatografiše na uobičajeni način, pod istim uslovima pod kojima će se hromatografisati i nepoznati uzorak. Softver zatim fituje široki oblik hromatografskog pika prema datim srednjim vrednostima molskih masa. Rezultujuća kalibraciona kriva sadrži tačke za svaku srednju vrednost. Ako su poznate samo i vrednosti, kalibraciona kriva će se sastojati od te dve tačke i od tačke koja odgovara molskoj masi vrha hromatografskog pika, odnosno kriva će imati ukupno tri tačke. Preporučuje se da se za kalibraciju koriste dva široka standarda različitih molskih masa, da bi se povećao opseg molskih masa kalibracione krive. Tada se dobija kalibraciona kriva sa šest tačaka, što i dalje predstavlja mali broj tačaka, ali je ovakva kriva ipak zadovoljavajuća za svakodnevnu, rutinsku analizu polimera koji ima molske mase u istom opsegu kao i široki standardi korišćeni za kalibraciju Univerzalna kalibracija Kako se GPC tehnikom makromolekuli razdvajaju prema veličini hidrodinamičke zapremine u rastvoru, a ne prema hemijskom sastavu, veliki broj istraživača je pokušao da iskoristi ovu činjenicu i da postavi univerzalnu kalibracionu krivu. Najviše uspeha u konstruisanju univerzalne kalibracione krive imao je Benoit, koji krenuo od poznate jednačine Flory-Fox-a: [ ]M = r(< r 2 >) 3/2 Benoit je konstatovao da je za jedan rastvarač, bez obzira na hemijsku strukturu polimera, proizvod graničnog viskozitetnog broja, [ ], i molske mase polimera, M, proporcionalan trećem stepenu poluprečnika inercije, r 3. Pošto je r konstanta, proizvod [ ]M se može uzeti kao mera hidrodinamičke zapremine, odnosno mera veličine makromolekula u rastvoru. Eksperimentalno je pokazano da za veliki broj polimera u istom rastvaraču važi da je: 128

135 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC log([ ]M) = A - bve gde su A i b konstante. Kada se za čitav niz različitih polimera eksperimantalno odrede vrednosti [ ]M i Ve u istom rastvaraču i unesu u koordinatni sistem log([ ]M) - Ve, tada sve tačke leže na jednoj krivoj, koja se može smatrati univerzalnom kalibracionom krivom (Slika 5.29). PS (polistiren) PS u obliku češlja PS u obliku zvezde Hetero-kalemljeni kopolimer PMMA (polimetilmetakrilat) PVC polivinilhlorid Kalemljeni kopolimer PS/PMMA Polifenilsiloksan Polibutadien Eksponencijalna kriva Eluaciona zapremina (5 ml, rastvarač THF) Slika Tipična univerzalna kalibraciona kriva Primena HPLC tehnike u analizi hrane Veoma veliki broj metoda koje se odnose na primenu HPLC tehnike za analizu hrane je do sada opisan u literaturi. Pored primera koji su već dati u Poglavlju 5, ovde će biti dat pregled još nekih tipičnih primera primene HPLC metoda u analizi prehrambenih proizvoda. Sve velike kompanije za proizvodnju HPLC instrumenata (Waters, Agilent) publikovale su svoje kataloge u kojima su opisani brojni standardizovani postupci i metode koje se primenjuju u analizi hrane. 129

136 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC U Tabeli 5.5. prikazan je samo mali broj jedinjenja koja su značajna za prehrambenu industriju, a koja se mogu analizirati primenom HPLC metoda. Skoro svi osnovni sastojci namirnica, kao što su proteini, lipidi, ugljeni hidrati i vitamini su pogodni za analizu tečnom hromatografijom. Primena različitih vrsta kolona i detektora za ove analize odražava prilagodljivost ove tehnike različitim analitima. Tabela 5.5. Primeri jedinjenja značajnih za prehrambenu industriju, koja se mogu analizirati HPLC metodama Analit Askorbinska kiselina Kofein; teobromin Saharin; acesulfam-k Benzoeva kiselina; sorbinska kiselina; metil-, etil- i propil-phidroksibenzoat Stiren Šećeri Slobodni tokoferoli i tokotrienoli Proizvod koji se analizira Bezalkoholna pića; hrana za bebe; mleko u prahu; krompir i ljuske od krompira. Kakao; čokolada, čokoladni premazi i likeri od čokolade. Pića na bazi pomorandže; čokolada za dijabetičare. Jogurt; sir; bezalkoholna pića; vino. Sve vrste prehrambenih proizvoda. Meso; cerealije; voće; voćni sokovi i sirupi. Životnjska i biljna ulja i masti. Kolona i detektor Kolona - silika-gel sa amino-nitrilnim grupama ; izokratsko eluiranje; mobilna faza sirćetna kiselina/metanol (75/25); UV detektor (248 nm). Kolona silika-gel sa oktadecil- grupama (ODS); izokratsko eluiranje; mobilna faza methanol/voda/sirćetna kiselina (20/79/1); UV detektor (272 nm). ODS kolona; mobilna faza kalijumdihidrogen-ortofosfat, tetrabutilamonijumhidrogen-sulfat, methanol, hlorovodonična kiselina, voda, konačni ph = 4; UV detektor (212 nm za saharin i 227 nm za acesulfam-k). Kolona silika-gel sa oktil- grupama (C8); mobilna faza methanol/0,01mol dm -3 amonijum acetat (40/60), ph = 4,5; UV detektor (240 nm). ODS kolona; mobilna faza methanol/voda (7/3); UV detektor (254 nm. Jonska hromatografska kolona; pulsni amperometrijski detector sa Au elektrodom; mobilna faza 150 mmol dm -3 natrijum-hidroksida + 0,30 mmol dm -3 zink acetata (analiza od sukroze do maltose) ili Pakovana GPC kolona; RI detektor; mobilna faza voda. ODS kolona; mobilna faza heptan/ heptan zasićen vodom/2-propanol (49,55/49,55/0,9); Fluorescentni detektor (pobuđivanje na 290 nm i emisija na 330 nm). 130

137 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Skoro svaka vrsta prehrambenog proizvoda može da se ekstrahuje u cilju identifikacije i kvantitativnog određivanja tragova analita. U cilju upoznavanja sa vrstom pripreme uzorka koja je neophodna i informacijama koje daje HPLC metoda, može se na primer opisati analiza organskih kiselina u voćnim sokovima. Voćni sokovi se veoma često analiziraju da bi se ispitalo da li je proizvod neovlašćeno izmenjen i/ili da li je pokvaren. Analitičar koji vrši ispitivanje proizvoda pretražuje spisak standardnih HPLC metoda i utvrđuje da li postoji pogodna metoda za tip jedinjenja koje treba da se analizira. Kada se takva metoda pronađe, ona može da se primeni na uzorak bez izmena ili neznatno modifikovana, u zavisnosti od supstrata donetog na analizu. Pri ispitivanju voćnih sokova metoda obuhvata analizu organskih kiselina kao što su askorbinska, maleinska i ćilibarna. Režim HPLC razdvajanja koji se u ovom slučaju primenjuje je jonska hromatografija i to reverzno-fazno razdvajanje na osnovu hidrofobnih reakcija, kada je slabi jonoizmenjvač neutralizovan (engl. hydrophobic ion suppression). Kiseli pufer se koristi da bi se smanjila ph vrednost mobilne faze i na taj način suzbila jonizacija organskih kiselina. To takođe omogućava zadržavanje kiselina na koloni. Komponente uzorka se eluiraju i razdvajaju na reverznofaznoj koloni (C18) i detektuju UV-detektorom podešenim na 220 nm. Koncentracija kiselina se određuje pomoću eksternog standarda (u ovom slučaju su korišćene i jabučna i fumarna kiselina). Mobilna faza je 2 % vodeni rastvor kalijum-hidrogenfosfata (KH2PO4), podešen na ph 3,2 pomoću fosforne kiseline. Brzina proticanja mobilne faze je 0,5 ml/min. Oblast primene GPC metode, osim za određivanje molskih masa i raspodele molskih masa polimera, obuhvata razdvajanje kompleksnih smeša u cilju prečišćavanja uzoraka. Primeri su uklanjanje soli i drugih niskomolekularnih jedinjenja iz biološkog materijala i uklanjanje plastifikatora iz sintezičkih polimera. Polimeri su takođe veoma važni za prehrambenu industriju, pošto se mnogi od njih koriste kao materijali za pakovanje hrane. Gel-propusnom hromatografijom mogu da se razdvoje smeše polimera i drugih jedinjenja na, na primer, frakcije polimera, oligomera, monomera i aditiva. Jedan od prvih GPC eksperimenata od strane kompanije Waters bio je analiza gume za žvakanje. Guma za žvakanje je smeša sintetičkog polimera sa aditivima kao što arome, stabilizatori, omekšivači, itd. Na Slici prikazan je GPC hromatogram gume za žvakanje, gde su komponente smeše razdvojene uz upotrebu nekoliko serijski vezanih kolona. Polimer, tj. guma u ovom slučaju se eluira prva, zato što je najveći molekul u smeši, a zatim se ređaju aditivi opadajućim redosledom u pogledu veličine molekula. 131

138 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC guma zažvakanje GPC polimer omekšivač stabilizator aroma komponente Slika Razdvajanje komponenata gume za žvakanje GPC tehnikom Primenom GPC metode se mogu određivati različite arome u prehrambenim proizvodima, a takođe se mogu analizirati uzorci biološkog porekla, npr. izolovati proteini. Rezime poglavlja U tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) mobilna faza je tečnost a stacionarna faza je čvrsta. HPLC je jedna od najmoćnijih tehnika u analitičkoj hemiji koja pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog određivanja jedinjenja koja su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u tečnosti. HPLC je veoma efikasna tehnika za razdvajanje, kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska kroz kolone punjene česticama malih dimenzija a velike specifične površine za interakciju sa molekulima koji se razdvajaju. HPLC metoda je pogodna za analizu organskih jedinjenja koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasnohromatograsku analizu bez prethodne derivatizacije. Osnovni delovi HPLC instrumenta su injektor, kolona, pumpa za proizvodnju visokog pritiska, detektor i sistem za obradu podataka. Za pakovanje HPLC kolona najčešće se koriste: silika-gel i različite vrste hemijski modifikovanog silika-gela, kopolimeri na bazi stirena i divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje. Razdvajanje u HPLC tehnici može da se postigne na osnovu polarnosti, naelektrisanja i veličine molekula. 132

139 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC Dva osnovna načina razdvajanja zasnovana su na polarnosti: hromatografija normalnih faza i hromatografija reverznih faza. Kada je stacionarna faza polarnija od mobilne faze, radi se o režimu normalnih faza Suprotno, kada je mobilna faza polarnija od stacionarne faze, takva tehnika se naziva hromatografijom reverznih faza. Ako se razdvajanje zasniva na naelektrisanju, odnosno na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa nekih adsorbenasa, tada se tehnika razdvajanja naziva jonska hromatografija. Tehnika razdvajanja na osnovu veličine molekula je gel-propusna hromatografija (GPC). GPC se najčešće koristi za razdvajanje prirodnih i sintetičkih makromolekula. Kolone koje se koriste za GPC su punjene umreženim polimerima sa specifičnim opsegom veličine pora. Čestice umreženog polimera u rastvaraču prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje gela. Raspodela veličina pora gela je u opsegu koji dozvoljava analiziranim makromolekulima da uđu u pore ili da, manje ili više, budu istisnuti iz zapremine pora, što vodi njihovom razdvajanju po veličini, odnosno molskoj masi. Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije kod koje se specifičan molekul iz smeše vezuje se za kompatibilan molekul koji je kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Najveći broj interakcija na kojima se zasniva afinitetna hromatografija su biohemijske interakcije, npr. antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor. U analizi hrane, HPLC se primenjuje za ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive, sintetičke boje, prirodne pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide), aminokiseline i druga jedinjenja. Pitanja za proveru znanja ili diskusiju 1. Objasniti princip rada tečne hromatografije visokih performansi. 2. Navesti i opisati osnovne delove HPLC sistema. 3. Opisati dva osnovna režima HPLC razdvajanja koji su zasnovani na polarnosti: hromatografiju normalnih faza i hromatografiju reverznih faza. 4. Objasniti princip rada jonske hromatografije. 5. Opisati tehniku gel-propusne hromatografije. 6. Objasniti princip rada afinitetne hromatografije. Literatura 1. L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 3, Library4science,

140 Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC 3. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series Book 5, Library4science, V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološkometalurški fakultet, Beograd, L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam,

141 6. LITERATURA 1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380, A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd, Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp , F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier, Amsterdam, S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, 5th Edition, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold- Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G. Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography, Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp , R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 1, Library4science, R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 2, Library4science, R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series Book 3, Library4science, R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series Book 4, Library4science, R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series Book 5, Library4science,

142 Literatura 17. C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, S. Ahuja, Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier Science, San Diego, E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library Volume 69A, Elsevier, Amsterdam, V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološkometalurški fakultet, Beograd, R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, S. Ötles (Ed.) Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass Spectrometry A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam, Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA,

143 CIP - Каталогизација у публикацији Народна библиотека Србије, Београд (075.8)( ) АНТИЋ, Весна В., Hromatografija u analizi hrane [Elektronski izvor] / Vesna V. Antić, Mališa P. Antić izd. - Zemun : Poljoprivredni fakultet, 2014 (Zemun : Poljoprivredni fakultet). - 1 elektronski optički disk (CD-ROM); 12 cm Sistemski zahtevi: Nisu navedeni. - Nasl. sa naslovnog ekrana. - Tiraž Sadrži bibliografiju. ISBN Антић, Малиша П., [аутор] a) Хроматографија COBISS.SR-ID

144