ALLIUM METAFAZNI GENOTOKSIČNI TEST ZA TESTIRANJE PITNE VODE, OKOLJSKIH VZORCEV IN KEMIKALIJ

Transcription

1 ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO ALLIUM METAFAZNI GENOTOKSIČNI TEST ZA TESTIRANJE PITNE VODE, OKOLJSKIH VZORCEV IN KEMIKALIJ Naročnik: MIK, MEDNARODNO TRGOVSKO IN PROIZVODNJO PODJETJE, d.o.o. Celjska c. 55; SI 3212 Vojnik, Slovenija Energijska okna z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC) po tehnologiji MOP Poznik (v nadaljevanju: Energijska okna) za izboljšanje kakovosti prostora A: Poslovni prostor, MIK; Arclin; Celjska c. 55, SI 3212 Vojnik B:Kabinetni prostor, Ljubljanska c. 74, SI 1230 Domžale Raziskani vzorci: Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica (vzorčenje ) Isto traktacija z Energijskim oknom Citogenetske raziskave so potekale od do DOMŽALE 20. NOVEMBER 2010 TESTNO POROČILO Z REZULTATI RAZISKAV PODAJA 1. Protokol ALLIUM metode 2. Rezultate splošne strupenosti (toksičnosti) in raven genotoksičnosti vzorca pitne vodovodne traktirane z ENERGIJSKIM OKNOM 3. Traktirani pitni vodovodni vodi se kakovost na obeh lokacijah izboljša. V poslovnem prostoru v obrtni coni Arclin (p = 0,0325 < 0,05) in v kabinetnem prostoru Domžale (p = 0,0106 < 0,05). 4. Poročilo obsega 8 strani, 2 preglednici s prilogo 8. fotografij ALLIUM Raziskave v rastlinski aplikativni citogenetiki PETER FIRBAS s.p. univ. dipl. biol. Ljubljanska c. 74 SI 1230 Domžale 1

2 Kako zdrav je prostor Kako zdrav je prostor je vprašanje, ki ne pušča ravnodušnosti. Njegovo sporočilo zamotano v biološko znanost, nam odpira svet, da lahko z danes znanim biološkim opazovanjem razlik v dolžini rasti korenin testne rastline (Allium cepa L.) in poškodbah kromosomov v njihovih celicah v odvisnosti od okolja določa kakovost bivalnega prostora. Think before you Samo fizikalno-kemične analize ne dajo dovolj zanesljivega odgovora na vprašanje kako zdrava je voda. Komplementarna raziskava skupno z biološkimi in kemičnimi raziskavami pa podaja popolnoma drugo sliko, kajti težko je identificirati najrazličnejše vplive (sevanja) v okolju. Biološka metoda ALLIUM razkriva celosten vpliv na rast in razvoj živih celic ali organizmov ter zaznava prisotnost škodljivih snovi v mejah in sposobnosti analitskih metod. Od najrazličnejših ionizirajočih in ne ionizirajočih sevanj, ki se lahko znajdejo na primer v okolju, jih z običajnimi fizikalnokemijskimi analizami ne moremo povsem in zagotovo utemeljiti posledičnosti na živ organizem: Think before you Pretehtajte preden se vselite ). Splošna strupenost - toksičnost Različna odzivnost rasti korenin testne rastline (Allium cepa L) je splošni pokazatelj kakovosti okoljskega vzorca. Rast naravnost pokaže v kako za življenje primernem prostoru zrastejo. Daljše ko so korenine boljša je kakovost okoljskega prostora in krajše ko so korenine slabša je kakovost okoljskega prostora. Raven genotoksičnosti Pogled na celično raven v rastnih vršičkih korenin testne rastline, še bolj pa pregledovanje celic, ter njihovo razmerje brez poškodovanih kromosomov in celic s poškodbami kromosomov v njej, pa daje že zelo natančno sliko o kakovosti okoljskega prostora, oziroma kar odgovor na vprašanje, kako zdrava je prostor. Ocena tveganja Ni dovolj le ugotoviti, kaj nas ogroža (različna sevanja v okolju), temveč, kako resno je (kako prihaja do škodljivih učinkov v bioloških sistemih). S tem nesporno dokazujejo, da ni varnih doz, torej da so MDD (Mejne Dovoljene Doze) nek sporazum podrejen praktični uporabi. Na te izzive pa odgovarjajo biološki testi, ki pokažejo sinergistične in komulativne učinke škodljivih sevanj, mehanizme prenosa in tudi pretvorb teh škodljivih sevanj v bioloških sistemih. Soodvisnost ionizacije okolja Polucija ionizirajočih sevanj dokazana z biološkimi testi je prvi genotoksični biomarker. Obstajajo tehtni dokazi da nekatera sevanja, ki povzročajo kromosomske poškodbe; znane kot genotoksična sevanja izkazujejo lastnosti kancerogenosti. 2

3 PROTOKOL TESTA ALLIUM METAFAZNI GENOTOKSIČNI TEST ZA TESTIRANJE OKOLJSKIH VZORCEV, KEMIKALIJ IN PITNE VODE Peter Firbas Peter Firbas, univ. dipl. biol., Zasebni raziskovalec Laboratorij za rastlinsko citogenetiko, E-pošta: 1. Uvod ALLIUM metafazni test je test za ugotavljanje splošne celične strupenosti (citotoksičnosti) in ravni genotoksičnosti v vodnih, kopenskih in zračnih ekosistemih, kjer dokazujemo potencialne genotoksične snovi. Test je kratkotrajen in pokaže usklajen in celokupen učinek onesnaževanja in medsebojno delovanje med testno rastlino (Allium cepa L.) in potencialnimi genotoksiki, nakar se še rezultati statistično ovrednotijo. Rezultate raziskav s statistično kalkulacijo prikazuje Fisher s Exact Test. V 2x2 frekvenčnih tabelah dvosmerna p-vrednost determinira statistično značilnost ali neznačilnost dveh kategoričnih vzorcev. Biološki test ALLIUM ali čebulni test razkriva celosten vpliv na rast in razvoj živih celic ali organizmov ter zaznava prisotnost škodljivih snovi v koncentracijah, ki so bistveno nižje od mejnih sposobnosti analitskih metod. Od približno 700 prepoznavnih toksičnih in genotoksičnih snovi, ki se lahko znajdejo na primer v pitni vodi, jih z običajnimi fizikalnokemijskimi analizami nadzorujemo le slabih 10 odstotkov (Vir: EU Chemical Bureau, Natural Resources Defence Council: Think before you drink). Polucija genotoksičnih snovi dokazana s biološkimi testi je prvi genotoksični biomarker. Obstajajo tehtni dokazi da kemikalije, ki povzročajo kromosomske poškodbe; znane kot genotoksične snovi lahko tudi inducirajo kancerogeni učinek, kakor tudi značilnost HDC hormone distruptors chemicals (hormonska distruptorska kemizacija ali kemikalije hormonskih motenj). Z biološkimi (genotoksičnimi) testi ugotavljamo odzivnost testne rastline navadne čebule (Allium cepa L), ki se odraža v morebitnih poškodbah genetskega materiala (kromosomov) ne glede na dopustne meje, ki ga lahko povzročajo razni onesnaženi vzorci v okolju. Glede na univerzalnost genske kode živih organizmov so rezultati raziskav prenosljivi (aplikatibilen) tudi na človeka. Cilj raziskav je nedvomno ta, da ugotovimo, ne le to ali onesnaženje jé ali ga ni, ampak glede na rezultate raziskav kakšna je ocena tveganja glede na raven genotoksičnosti raziskanih okoljskih vzorcev npr. podtalnice kot pitnega vira in ostalih površinskih voda. Vsi smo pred odgovorno nalogo kako reševati problem kakovosti okolja in pitne vode v njem. 3

4 2. Material in metode Test se izvaja po: Tecnical Methods Section 1993, 1994; INVITTOX - Protokol No. 8, 1989, Fiskesjö, 1985, Al-Sabti 1989, Nielsen & Rank 1994, Rank 2003, Firbas 2004, 2006; Kumar P. in Panneerselvam N. (2007); Ragunathan I. in Panneerselvam N. (2007). Citogenetske raziskave potekajo na raziskovalnem mikroskopu znamke OLYMPUS BX 41 Japonska) s samodejnim fotosistemom PM 10 SP, pri povečavi 400X in 1000X Parametri ALLIUM metafaznega testa Parametri ALLIUM metafaznega testa podajajo: splošno strupenost (toksičnost), raven genotoksičnosti, metafazni indeks in vzporedno kontrolo testa. SPLOŠNA STRUPENOST podaja dolžino korenin testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa L.); je obratno sorazmerni z dolžino korenin testnih rastlin. Daljše kot so korenine manjša je splošna toksičnost in krajše kot so korenine testnih rastlin večja je splošna strupenost ali toksičnost(slika 1, 2.). RAVEN GENOTOKSIČNOSTI podaja poškodbe kromosomov v celicah koreninskih vršičkov testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa L.); je odstotkovno razmerje med vsemi metafaznimi celicami in s metafaznimi celicami s poškodbami kromosomov (Al-Sabti 1985, 1989; Firbas 2004, 2006). Pregleda se do 200 metafaznih celic, pri visoki raveni genotoksičnosti pa največ do 100 celic (Slika 3, 4). METAFAZNI INDEKS: število metafaznih celic na 1000 pregledanih celic. Indeks ima vrednosti med 20 in 100 (Promilnih točk). ALLIUM metafazni test (Firbas 2004, 2006): 1. Prvi dan: odvzem vzorcev na terenu, ki so namenjeni raziskavi s testom ALLIUM 2. Drugi dan: nastavitev testnih rastlin na specifične vzorce 3. Tretji dan: po 24 urah menjava vodnih vzorcev 4. Četrti in peti dan: testne rastline ostanejo na vodnem mediju še 48 ur. 5. Šesti dan: potek raziskav splošne toksičnosti in ravni genotoksičnosti 6. Sedmi dan: statistična kalkulacija (Fišerjev eksaktni test (Fisher s Exact Test). Preglednica 1. Primerjava rezultatov ravni genotoksičnosti različnih kakovosti pitnih voda (Firbas P.) Raven genotoksičnosti (izražena v odst. t. je razmerje med vsemi metafaznimi celicami in celicami s poškodbami kromosomov; n = 200) Raven Ogroženosti (ocena tveganja) Vzorci pitnih voda in nekaterih kemikalij 2 naravna mutagenost Kakovostna pitna voda testnih organizmov 3 Ničelna do Nizka 5 mg NO 3 /l 5 9 Srednja 0,01 µg/l biocidov, 25 mg/l nitratov Visoka 0,1 µg/l biocidov, 40 mg/l nitratov Kritična (>0,1 µg/l biocidov, 50 mg/ll nitratov 4

5 Za vsak vzorec in obe kontroli se uporabi pet čebulic Allium cepa L. velikosti mm in težke 3-4 g; stare največ do 6 mesecev. Testne rastline mlade čebule se shranjujejo pri temperaturi C 0 in zračni vlagi 50 %. V vodnih vzorcih, kakor tudi v obeh kontrolah se gojijo gomolji testnih rastlin mlade čebule 72 ur pri temperaturi C 0. Izpostavljanje testnih rastlin v vodni raztopini kolhicina blokira celične delitve v fazi metafaze, kjer so kromosomi najbolj vidni (metafazne celice). ALLIUM test podaja rezultate splošne toksičnosti in ravni genotoksičnosti. Po barvanju v karminocetu (3 4 min., 60 0 C), se izdelajo mikroskopski preparati mečkanci (macerati). V kromosomskih garniturah opazujemo morebitne kromosomske poškodbe. Preparate po obdelavi z tekočim CO 2 (-70 0 C) vključimo v euparal Kariotipizacija kromosomov mlade čebule (Allium cepa L.) Preden analiziramo poškodbe kromosomov, je potrebno omeniti na splošno začilnost morfologije kromosomov, saj nam le omogočajo pojasniti mehanizme nastajanja različnih kromosomskih poškodb. Navadna čebula (Allium cepa L.) ima 16 kromosomov (Slika 3). Kromosom tvorita dve vzporedno potekajoči in enako dolgi kromatidi, ki vsaka predstavlja vzdolžno polovico kromosoma. Kromosom še ima primarno zožitev (centromero), ki kromosom deli v daljši in krajši krak. Kromosomska kraka sta lahko tudi enako dolga. Razmerje med dolžinama krakov podaja obliko kromosoma in je osnova za kromosomsko kariotipizacijo (Levan in sod. 1964, Firbas 2004) KATEGORIJE STRUKTURNIH KROMOSOMSKIH POŠKODB Strukturna kromosomska poškodba je vsaka sprememba v strukturi kromosoma (Slika 4). Kromosomske poškodbe so kromatidne in kromosomske. Večina kemičnih mutagenov povzroči poškodbe kromatidnega tipa in so tudi najpogosteje nastale poškodbe. Centromerne poškodbe (v primarni zožitvi kromosoma) so tudi poškodbe kromatidnega tipa in so lokacijsko vezane na centomerno regijo kromosoma. Sploh pa so najpogostejše poškodbe kromosomov prav v centromerni regiji, oziroma v sami centromeri (LC). V tem predelu je kromosom tudi najobčutljivejši na poškodbe (Slika 4). KROMATIDNE POŠKODBE Enojni lom kromatide (ELK) Single break chromatide (SBC) Dvojni lom kromatide (DLK) Double break chromatide (DBC) Večkratni lomi kromatide (VLK) Multiple breake chromatide (MBC) CENTROMERNE POŠKODBE Lom v centromeru (LC) Break centromere (BC) Špranjasti (gap) lom kromatide (GK) gap break chromatide (GBC) KROMOSOMSKE POŠKODBE Krožni kromosom (KK) Ring Chromosom (RC) Dicentrični kromosom (DK) Dicentric Chromosom (DC) Poškodbe v kromosomski garnituri prizadenejo enega do dva kromosoma v garnituri, nadalje 3 do 7 ali 8, redkeje tudi do 12. Poškodovani pa so lahko vsi kromosomi v kromosomski garnituri. Višja kot je raven genotoksičnosti več je poškodovanih tudi kromosomov v garnituri. Prav tako se pojavlja tudi več različnih poškodb na posamičnem kromosomu v garnituri. 5

6 3. Rezultati raziskav in razprava Vzorčenje pitne vodovodne vode: Izpostavljenost testnih rastlin je potekalo na dveh lokacijah: V poslovnih prostorih MIK Celje (od do ) in z 24 urnim zamikom v kabinetnih prostorih v Domžalah (od do ) Citogenetske raziskave so potekale od do S testom Allium so bili raziskani naslednji vzorci: I. Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica II. Isto voda traktirana z Energijskim oknom (kabinet Domžale) III. Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica IV. Isto voda traktirana z Energijskim oknom (poslovni prostor MIK Celje) V. Negativna kontrola (voda filtrirana z reverzno osmozo R. O.) VI. Pozitivna kontrola (1 mg/l ali 1 ppm metil metansulfonat MMS 4016 SIGMA) Vzorca I. in II. lokacija Domžale; Vzorca III. In IV. lokacija MIK, Obrtna cona Arclin (Vojnik) Splošna strupenost in raven genotoksičnosti (Fisherjev eksaktni test (Fisher s Exact Test). Rezultati splošne strupenosti (toksičnosti) in ravni genotoksičnosti so podani v preglednici 2 in fotografijah 5, 6, 7 in 8. Splošna strupenost (dolžina korenin testnih rastlin) med pitno vodovodno vodo (Vzorec I) in traktirano pitno vodovodno vodo (Vzorec II,) statistično signifikantno je značilno. Splošna strupenost (dolžina korenin testnih rastlin) med pitno vodovodno vodo (Vzorec III) in traktirano pitno vodovodno vodo (Vzorec IV,) statistično signifikantno ni značilno. Traktirane testne rastline (Vzorec II) imajo daljše korenine od netraktiranih testnih rastlin (Vzorec I); p < 0,05. Preglednica 2. Citološki učinki raziskanih vzorcev - raziskava ravni genotoksičnosti in Povprečna dolžina korenin testne rastline Allium cepa L. raziskava splošne strupenosti Vzorec Metafazni Indeks (n/ ) Število metafaznih celic Število celic s poškodbami kromosomov Raven Genotoksičnosti (odst. t.) Povprečna dolžina korenin (mm) I ,50 36 II ,50 37 III ,50 34 IV ,0 40 V ,5 42 VI ,0 19 6

7 Traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec II) se statistično značilno razlikuje od vzorca netraktirane pitne vodovodne vode (vzorec I); s stopnjo značilnosti: p = 0,0325 < 0,05; in traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec IV) od vzorca netraktirane pitne vodovodne vode (Vzorec III) s stopnjo značilnosti: p = 0,0106 < 0,05. Traktirana vodna vzorca (Vzorec II, IV) imata zmanjšano raven genotoksičnosti v razmerju do netraktirane pitne vodovodne vode (Vzorec I, III). Traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec II, IV) statistično signifikantno med seboj ni značilna; p = 1. Netraktirana pitna vodovodna voda (Vzorec I, III) statistično signifikantno med seboj ni značilna; p = 0, Zaključek Iz rezultatov je razvidno, da je raven genotoksičnosti se pitni vodovodni vodi po traktaciji z Energijskimi okni z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC) po tehnologiji MOP Poznik kakovost izboljša, oziroma iz kakovosti visoke ocene tveganja (18,50 / 19,50 odst. t.) postane kakovost pitne vodovodne vode z srednjo oceno tveganja (10,50 / 10,0 odst. t.) (Primerjava preglednic 1 in 2). Razlika v rasti in razvoju korenin testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa L.), kakor tudi citogenetska raziskava meristemskih celic koreninskih vršičkov testnih rastlin kažejo: da energijska okna z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC) izboljšajo kakovost prostora in posledično delujejo na naše počutje in zdravje. 5. Cilji raziskav in statistična značilnost Cilj raziskav je nedvomno ta, da nam rezultati raziskav pokažejo ali onesnaženje je ali ga ni ter predvsem kakšno je tudi tveganje za organizme, vključno z ljudmi. Omenjeni ALLIUM test pa nas tudi pripelje kaj je vzrok onesnaževanju oz. kje je vir. Šele z znanimi izvori lahko preidemo k ukrepom in tako prispevamo čim večji delež k ohranjanju zdravega okolja. Vključitev genotoksičnih raziskav za varovanje okolja je velikega pomena, saj omogočajo spoznanja o vplivu in posledicah genotoksičnih snovi na organizme. Čas je, da odgovorno in dodatno skrbimo za zdravo okolje in posledično za visoko kakovostno pitno vodo. Statistično ugotovljeno signifikantno razliko med preiskanimi vzorci potrjuje statistična kalkulacija analiza parnih podatkov s dvosmernim Fisherjevim eksaktnim testom, ki podaja lastnost p vrednosti med paroma podatkov in sicer ali sta para (raziskana vzorca) različna (statistično značilna) ali se ne razlikujeta (statistično neznačilna) in kakšno je tudi tveganje. Katero tveganje pa je dovolj majhno. Najpogostejše vrednosti so 0,05 nato 0,01 in 0,001. Glede na te meje govorimo tudi o 5%, 1% in 0,1% stopnji značilnosti rezultatov. Katerega od teh nivojev izberemo, je precej odvisno od narave podatkov in od problema, ki ga obravnava osnovna domneva. Statistična značilnost pa naj nebi bila edini odločilni dejavnik pri vrednotenju rezultatov. 6. Viri in literatura LEVAN A. (1964) Hereditas, 52. ROYAL SWEDISH ACADEMY OF SCIENCE (1973). Ambio 3. GRANT W. F. (1982). Mutation Research, 99. FISKESJÖ G. (1985). Hereditas, 102. AL-SABTI K. (1985). Environ. Contam. Toxicol. 34 AGRESTI A. (1992). Statitical Science,7,

8 INVITTOX PROTOKOL No. 8, IP 8. (FISKESJÖ G.,1989) AL-SABTI K. (1989). Cytobios, 58. AL-SABTI K. (1992). Cytobios, 70. AL-SABTI K. (1992). Mutation Research, 280. NIELSEN M. H., RANK J. (1994). Hereditas 121. FISKESJÖ G. (1993,). TECHNICAL METHODS SECTION. Environmental Toxicology and Water Quality , John Wiley & Sons, Inc. FISKESJÖ G. (1994,). TECHNICAL METHODS SECTION. Environmental Toxicology and Water Quality John Wiley & Sons, Inc. FIRBAS P. & AL- SABTI K. (1995). Archives of Biological Sciences, 47 (1-2). FIRBAS P. (1995). II. International Symposium on Exant and Fosil Charophytes, Madisom USA. FIRBAS P. (1997). 5 th Yugoslav Ecological Congres, Beograd YU. FIRBAS P. (1998). 5. Slovenski Festival Znanosti, Ljubljana Slovenija FIRBAS P. (1999). DELO - Znanost, 08. Dec FIRBAS P. (2003). DELO - Znanost, 7. Apr RANK J. (2003). Ekologija 1, FIRBAS P. (2004). ARA založba, Ljubljana FIRBAS P. (2007). DELO - Znanost, 04. Jan KUMAR P. AND PANNEERSELVAM N. (2007). Facta Universitatis Series: Medicine and Biology, Vol. 14, No. 2 RAGUNATHAN I. AND PANNEERSELVAM N. (2007). Journal of Zhejiang University Science B. 8(7) Peter Firbas 8