M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće BIOCHEMIA MEDICA

Transcription

1 M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće BIOCHEMIA MEDICA ČASOPIS HRVATSKOG DRUŠTVA MEDICINSKIH BIOKEMIČARA Broj: 3 4 Zagreb, srpanj prosinac Godište: 14 Molekularna dijagnostika postaje dio rutinske kliničke prakse, a vidljivi rezultati zabilježeni su u dijagnostici nasljednih, malignih i infektivnih bolesti. Program uključuje pre- i postnatalnu dijagnostiku, utvrđivanja prenositelja, kromosomske translokacije, genske varijacije u definiraju rizika bolesti ili metabolizma lijeka, te genotipizaciju virusa, bakterija i tkiva. To je kompleksan proces koji, uz analitički rezultat, uključuje i tumačenje modela složenih korelacija genotipa i fenotipa. U ovom broju časopisa prikazan je suvremen pristup dijagnostici s primjerima istraživanja genoma koji su doprinijeli razumijevanju molekularne patobiokemije, zatim organizacija novije analitike DNA u konceptu medicinskobiokemijske djelatnosti uz osiguranje kvalitete. To su primijenjena istraživanja na osnovu kojih je uvedena molekularna dijagnostika u Hrvatskoj godine u KBC-u Zagreb. Cilj ove strategije je dijagnostika, potvrda dijagnoze i prediktivna dimenzija u zdravstvenoj skrbi i promicanju zdravlja. U sklopu analize DNA, uz informirani pristanak bolesnika i smjernice za pojedine kliničke entitete, vrednuje se nalaz molekularne dijagnostike. Općenito, genom je ključni čimbenik nove epohe laboratorijske djelatnosti i poznavanja biokemije bolesti. Kako molekularna dijagnostika postaje dominantna laboratorijska jedinica s međunarodnom verifikacijom, neophodna je kontinuirana edukacija i harmonizacija programa za dobrobit bolesnika i unaprjeđenje profesije. Gost urednik: Prof.dr.sc. Jadranka Sertić BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4,

2 Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće M. Sikirica i sur. 82 BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4, 2004.

3 M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće Stručni članak Professional paper ANALITIČKA PROCJENA AUTOMATSKOG MIKROSKOPSKOG ANALIZATORA IRIS iq 200 U KVALITATIVNOJ ANALIZI MOKRAĆE Mirjana Sikirica, Tanja Bobetić-Vranić Zavod za kliničku kemiju, Klinička bolnica Merkur, Zagreb SAŽETAK Cilj: Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora iq 200. Metode: Procjena automatskog mikroskopskog analizatora iq 200 (IRIS International Remote Imaging Systems, Inc) izvršena je usporednim ispitivanjem s mikroskopskom analizom supravitalno obojenog sedimenta mokraće. Rezultati: Dobiveni rezultati u 350 ispitanih uzoraka u najučestalijim klinički relevantnim elementima sedimenta mokraće pokazuju linearnu korelaciju s koeficijentom korelacije za eritrocite r = 0,973,uz osjetljivost 91% i specifičnost 94%; za leukocite r = 0,.976, uz osjetljivost 91% i specifičnost 94%; za pločasti epitel r = 0,936, uz osjetljivost 97% i specifičnost 89%; za male epitelne stanice r = 0,703, uz osjetljivost 89% i specifičnost 85%; i za cilindre r = 0,845, uz osjetljivost 89% i specifičnost 84%. Nepreciznost u seriji određivana je u deset mjerenja suspenzije fiksiranih eritrocita u potpuno čistoj otopini kao pozitivna kontrola (1000 čestica /µl) s koeficijentom varijacije KV = 1,80% i kao negativna kontrola (0 čestica/µl) s KV = 36%. Stabilnost analizatora mjerena iz dana u dan određivana je tijekom 10 dana s pozitivnom kontrolom (1000 čestica/µl) i KV = 1,5% te negativnom kontrolom (0 čestica/µl) s KV = 28,6%. Ispitivanjem je potvrđena linearnost do 1000 čestica/µl. Zaključak: Analizator značajno smanjuje vrijeme za izvođenje pretrage i postiže visoki stupanj standardizacije u analizi mokraćnog sedimenta. Analizator može razlikovati 12 elemenata na osnovnoj razini dok je subklasifikacija elemenata grubo procijenjena i zahtijeva daljnju analizu. Ključne riječi: Analiza urina+metode Adresa za dopisivanje: UVOD Automatizacija u kliničkoj kemiji i hematologiji naišla je na veliku primjenu i postala osnovni koncept laboratorijske prakse, dok njezina primjena u analitici mokraće tek postaje novi izazov. Prvi instrumenti koji su omogućili automatiziranu mikroskopsku analizu mokraće bili su Yellow IRIS (International Remote Imaging Systems, Chatsworth, CA) u Sjedinjenim Američkim Državama kao automatska inteligentna mikroskopija (AIM) temeljena na načelu mikroskopskog prepoznavanja čestice (1) i serije Sysmex UA (TOA Medical Electronics, Kobe, Japan) na načelu protočne citometrije (2). Automatski analizator iq 200 za mikroskopiju Mirjana Sikirica, dipl. ing., Zavod za kliničku kemiju, Klinička bolnica Merkur, Zagreb, I. Zajca 19; Tel/fax: 01/ ; mirjana.sikirica@hi.htnet.hr mokraće je nova generacija IRIS-ove tehnologije koja koristi prepoznavanje elemenata mokraće primjenom najsuvremenije informatičke tehnologije temeljene na umjetnim neuronskim mrežama (3,4). U tu svrhu izvršili smo analitičku procjenu mikroskopskog analizatora iq 200 u odnosu na standardiziranu mikroskopsku morfološku analizu mokraćnog sedimenta (5,6). Uzorci MATERIJAL I METODE Analizirali smo 350 uzoraka mokraće koja je bila dostavljena u laboratorij Zavoda za kliničku kemiju Kliničke bolnice Merkur. Vrijeme u kojem je učinjena analiza kretalo se najviše do 4 sata. Nisu se koristila nikakva sredstva za zaštitu mokraće. Za analizu na mikroskopskopskom ana- BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4,

4 Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće M. Sikirica i sur. lizatoru iq 200 bilo je potrebno minimalno 3 ml nativne, necentrifugirane mokraće. Načelo mjerenja Mikroskopski analizator IRIS iq 200 IRIS iq 200 je potpuno automatizirani mikroskopski analizator koji za analizu koristi necentrifugiranu i neobojenu mokraću. Sastoji se od mikroskopskog modula u kojem se nalazi mikroskop, digitalne kamere CCD (charge-coupled device) rezolucije 0,68 µm i protočne stanice. Digitalna kamera snima 500 polja veličine 884x680 µm po svakom uzorku mokraće pri čemu se čestice s pomoću hidrodinamičkog učinka drže u protočnoj stanici u fokusu mikroskopa. Jedini reagens koji instrument koristi je otopina iq Lamina, čija je glavna uloga stvaranje laminarnog toka koji obuhvaća svaki aspirirani uzorak i postavlja sve čestice u uzorku u optimalan položaj za analizu. Analizator s pomoću digitalne kamere pohranjuje slikovne zapise i programom Auto Particle Recognition (APR) prepoznaje čestice čija je veličina > 3 µm te ih svrstava u 12 kategorija (slika1). Prepoznavanje čestica u programu APR zasniva se na uspoređivanju četiri svojstva i to veličine, kontrasta, oblika i strukture prema već učitanim slikama takvih čestica po zadanim kriterijima na umjetnoj neuronskoj mreži nastaloj na modelu biološke neuronske mreže. Da bi se čestica našla u svojoj skupini, sigurnost prepoznavanja čestice mora biti veća od 90%. Prisutnost čestica čija veličina je < 3 µm analizator bilježi kao ukupne male čestice i ispisuje ih na zaslonu kao broj čestica/µl. Taj podatak je vrlo značajan jer s pomoću njega možemo prepoznati kakvoću uzorka budući da stajanjem taj broj raste što ukazuje na stari, a time i neprikladan uzorak za analizu. Tijekom automatskog mikroskopiranja nema utjecaja interferirajućih supstancija, moguće kontaminacije uzoraka, ph, relativne volumne mase, temperature ili svjetla. Kontrola kvalitete rada analizatora provodi se putem kalibracije kojom se osigurava mjerenje volumena čestica u protočnoj stanici na razini 2 µl. Negativna kontrola (koncentracija 0-20 čestica/µl) i pozitivna kontrola (koncentracija čestica/µl, ovisno o broju lota kontrolnog uzorka) provodi se dnevno, pri čemu se rad analizatora automatski zaustavlja ako su izmjerene koncentracije čestica u kontrolnim uzorcima izvan dozvoljenog raspona. Dnevno se obvezatno provodi i kontrola oštrine središnjeg dijela protočne stanice (fokus) na koji je usmjeren mikroskop povezan s digitalnom kamerom. Pregled osnovnih karakteristika IRIS iq 200 prikazan je u tablici 1. S l i k a 1. Analitička procjena mikroskopskog analizatora IRIS iq 200 Analitička procjena mikroskopskog analizatora IRIS iq 200 izvršena je prema skraćenom ECCLS-ovom protokolu, a obuhvatila je: ispitivanje nepreciznosti iz dana u dan, nepreciznosti u seriji, linearnosti primjenom suspenzije fiksiranih eritrocita u različitim koncentracijskim područjima, usporedno ispitivanje te ispitivanje dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti (7). Nepreciznost Načelo mjerenja automatiziranog mikroskopskog analizatora IRIS iq 200 F i g u r e 1. Measurement principle on IRIS iq 200 automated microscopic analyzer Nepreciznost u seriji određivana je u deset mjerenja suspenzije fiksiranih eritrocita u potpuno čistoj otopini kao pozitivna kontrola (1000 čestica/µl; kat. br lot. O33-04), negativna kontrola (0 čestica/µl; kat. br lot. O33-04) priređena od proizvođača i srednjega koncentracijskog područja priređenog miješa- 84 BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4, 2004.

5 M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće T a b l i c a 1. Osnovne karakteristike automatiziranog mikroskopskog analizatora IRIS iq 200 T a b l e 1. Main characteristics of IRIS iq 200 automated microscopic analyzer DETEKCIJA ELEMENATA MOKRAĆE 12 elemenata mokraće - PROGRAM APR - eritrociti - leukociti - nakupine leukocita - stanice pločastog epitela - male okrugle stanice - hijalini cilindri - nehijalini cilindri - bakterije - gljivice - sluz - sperma - kristali - artefakti METODA ANALIZE IDENTIFIKACIJA ELEMENATA MOKRAĆE OBRADA UZORAKA VOLUMEN UZORKA OBRADA PODATAKA KONTROLA KVALITETE RADA KOMUNIKACIJSKI SISTEM digitalna analiza slike u protočnoj stanici suvremenom informatičkom tehnologijom temeljenoj na umjetnoj neuronskoj mreži (Auto Particle Recognition - APR) identifikacija preko automatskog čitača 10 stalaka za uzorke kontiniurano mjerenje do 55 uzoraka minimalni volumen 3,0 ml necentrifugirane mokraće aspiracijski volumen 0,9 ml pohranjuje do rezultata uzoraka automatski ispis rezultata analiza automatsko označavanje patoloških rezultata i rezultata izvan granica linearnosti iskazivanje rezultata u µl ili po vidnom polju 2 kontrolna uzorka i kontrola optičkog sustava izračun i grafički prikaz (grafovi Levey Jennings) aritmetičke sredine (x), standardne devijacije (SD) i munimalne i maksimalne vrijednosti podatci o kontroli mogu se vidjeti na zaslonu i/ili ispisati na pisaču kalibracija volumena čestica kalibracija oštrine središnjeg dijela protočne stanice dvosmjerna komunikacija sa središnjim kompjutorom mogućnost umreženja u laboratorijski informacijski sustav CERTIFIKATI EN ISO 13485:2000; ISO 13485:1996 certificiran prema FDA EDMA klasifikacija prema 98/79/EEC direktivi KOMPONENTE ANALIZATORA mikroskopski modul računalo monitor pisač (uvjetno) njem jednakih dijelova pozitivne i negativne kontrole (1:2) s teoretskom koncentracijom 500 čestica/µl. Dobiveni rezultati iskazani su kao koeficijent varijacije (KV%) za svako područje. Stabilnost analizatora iz dana u dan (nepreciznost iz dana u dan) izvodila se tijekom 10 dana s pozitivnom kontrolom (1000 čestica/µl) i negativnom kontrolom (0 čestica/µl). Linearnost Linearnost je određena suspenzijom fiksiranih eritrocita u otopini potpuno slobodnoj od prisutnosti drugih čestica kao pozitivna kontrola (1000 čestica/μl) i negativna kontrola koja ne sadrži nikakve čestice (0 čestica/μl), priređena od proizvođača. Procjena linearnosti je provedena u pet koncentracijskih područja 0, 250, 500, 750, 1000 čestica/μl pripremanih na sljedeći način: negativna kontrola spremna za uporabu (kat. br lot ), broj čestica=0/μl; koncentracija 1 (15 ml negativne kontrole i 5 ml pozitivne kontrole), broj čestica=250/μl; koncentracija 2 (10 ml negativne kontrole i 10 ml pozitivne kontrole), broj čestica=500/μl; koncentracija 3 (5 ml negativne kontrole i 15 ml pozitivne kontrole) broj čestica=750/μl; pozitivna kontrola spremna za uporabu (kat. br lot ), broj čestica iznosi 1000/μL. BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4,

6 Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće M. Sikirica i sur. Usporedna ispitivanja Uzorci primljeni za kvalitativnu rutinsku analizu mokraće analizirani su na mikroskopskom analizatoru IRIS iq 200, a zatim su centrifugirani i priređeni standardiziranim postupkom za manualnu mikroskopiju. Ispitivanja smo izvodili na 350 uzoraka za najčešće nađene klinički relevantne elemente sedimenta mokraće: leukocite, eritrocite, male epitelne stanice, cilindre i stanice pločastog epitela. Rezultati manualne mikroskopske analize iskazani su na μl da bi se mogli usporediti s automatskom mikroskopskom analizom, pri čemu su rezultati manualnom mikroskopijom smatrani referentnima (x) u usporedbi s automatskom mikroskopskom analizom (y). Određivanje dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti Dijagnostička osjetljivost i specifičnost izračunana je za klinički relevantne elemente sedimenta mokraće (eritrocite, leukocite, stanice pločastog epitela, male epitelne stanice i cilindre) prema gornjoj granici referentnog intervala koja je služila za razlikovanje normalnih od patoloških nalaza. Standardizirana metoda mikroskopske analize sedimenta mokraće Analiza sedimenta mokraće je rađena prema preporukama Europske grupe za analizu mokraće, standardiziranom metodom koju je Hrvatska komora medicinskih biokemičara prihvatila kao preporučenu metodu I (8). Nakon analize mokraće na analizatoru iq 200, svaki uzorak mokraće je preliven u standardizirane plastične epruvete i obrađen prema uvjetima: volumen mokraće za centrifugiranje - 10 ml vrijeme centrifugiranja - 5 minuta brzina centrifugiranja mokraće - RCF 400 x g volumen sedimenta mokraće ml volumen sedimenta mokraće za mikroskopiranje - 13 µl supravitalno bojenje - Toluidine blue O pokrovnica - 18x18 mm Pretraživano je 20 vidnih polja velikoga (x400) i malog povećanja (x100) i srednja vrijednost nađenog broja čestica preračunana je u μl pri čemu 0,18 μl originalnog volumena mokraće odgovara volumenu jednoga vidnog polja velikoga povećanja prema ranije definiranim uvjetima (5). Faktor konverzije za izražavanje broja stanica po vidnom polju na broj stanica po μl je tada 5,6. U tom slučaju n čestica / vidnom polju velikog povećanja odgovara: broj čestica / 0,18 μl = 5, 6 x broj čestica x 10 6 /L Statističke metode Za određivanje nepreciznosti izračunana je veličina aritmetičke sredine (x), standardne devijacije (SD) i koeficijenta varijacije (KV%). Usporedna ispitivanja iskazana su linearnom regresijskom analizom u programu Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, SAD), a dijagnostička osjetljivost i specifičnost izračunane su s pomoću statističkog programa MedCalc (MedCalc software, Mariakerke, Belgija). Nepreciznost REZULTATI Nepreciznost u seriji i nepreciznost iz dana u dan tijekom 10 dana određena primjenom suspenzije fiksiranih eritrocita prikazana je u tablici 2. Linearnost Ispitivanja 5 koncentracijskih područja dobivenih različitim razrjeđenjima pozitivne i negativne kontrole pokazuju za koncentraciju 1 (250 čestica/µl) 100% vrijednosti od teoretskih, za koncentraciju 2 (500 čestica/µl) 98% od teoretskih vrijednosti, a za koncentraciju 3 (750 T a b l i c a 2. Nepreciznost u seriji i nepreciznost iz dana u dan za mikroskopski analizator IRIS iq 200 T a b l e 2. Within run and between day imprecision for IRIS iq 200 automated microscopic analyzer Deklarirane vrijednosti (broj čestica eritrocita/µl Nepreciznost u seriji (n = 10 uzoraka) Nepreciznost iz dana u dan (n = 10 dana) Raspon X SD KV% Raspon X SD KV% ,3 2,9 36, ,6 2,5 28, ,3 13,6 2, ,4 14,2 2, ,8 17,8 1, ,2 15,1 1,5 86 BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4, 2004.

7 M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće čestica/µl) 99% teoretskih vrijednosti. Dobivene vrijednosti za nerazrijeđenu pozitivnu kontrolu iznose 100% od deklariranih. Prema dobivenim vrijednostima potvrđena je deklarirana granica linearnosti za suspenziju eritrocita do 1000 čestica/µl. Usporedna ispitivanja Usporedna ispitivanja izvršena su na 350 uzoraka mokraće. Analizom leukocita isključeno je 39 uzoraka u kojima su nađene nakupine leukocita jer utječu na točnost brojenja kod manualne mikroskopije. ERITROCITI LEUKOCITI eritrociti /ul - iq* eritrociti /ul-mikroskopski leukociti/ul-iq leukociti/ul-mikroskopski CILINDRI STANICE PLOÈA STOG EPITELA cilindri/ ul - IQ stanice ploèastog epitela /ul- IQ cilindri /ul -mikroskopski stanice ploèastog epitela /ul-mikroskopski MALE EPITELNE STANICE Male epitelne stanic e/ul - IQ Male epitelne stanice/ul - mikroskopski S l i k a 2. Usporedna ispitivanja klinički relevantnih elemenata sedimenata sedimenta mokraće na automatskom mikroskopskom analizatoru iq 200 u odnosu na mikroskopsku analizu sedimenta mokraće F i g u r e 2. Comparison of clinically relevant elements of sediment determined by iq 200 automatic microscopic analyzer in relation with manual microscopy of the sediment BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4,

8 Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće M. Sikirica i sur. T a b l i c a 3. Analiza linearne regresije za mikroskopski analizator IRIS iq 200 (metoda y) u usporedbi s manualnom mikroskopskom analizom (metoda x) T a b l e 3. Regression analysis of IRIS iq 200 automated microscopic analyzer (method y) compared to manual microscopy (method x) Broj uzoraka Nagib pravca Odsječak r Eritrociti 328 0,691 2,70 0,973 Leukociti 311 0,840 1,42 0,976 Stanice pločastog epitela 318 1,107 4,13 0,936 Male epitelne stanice 124 1,147 0,99 0,703 Cilindri 103 0,936 0,69 0,845 Prisutnost eritrocita nađena je u 328 uzoraka, malih epitelnih stanica u 124, cilindara u 103, a stanica pločastog epitela u 318 od 350 analiziranih uzoraka. Dobiveni rezultati prikazani su u tablici 3 i na slici 2. Dijagnostička osjetljivost i specifičnost Izračunana dijagnostička osjetljivost i specifičnost prema gornjim granicama referentnih intervala za ispitivane klinički relevantne elemente sedimenta mokraće prikazana je u tablici 4. T a b l i c a 4. Osjetljivost i specifičnost za mikroskopski analizator IRIS iq 200 T a b l e 4. Sensitivity and specificity for IRIS iq 200 automated microscopic analyzer Osjetljivost Specifičnost Eritrociti 91% 94% Leukociti 91% 94% Stanice pločastog epitela 97% 89% Male epitelne stanice 89% 85% Cilindri 89% 84% Nepreciznost RASPRAVA Rezultati dobiveni određivanjem nepreciznosti pokazuju da porastom koncentracije čestica/ μl dolazi do smanjenja koeficijenta varijacije i za nepreciznost u seriji i iz dana u dan. Deklarirane vrijednosti za negativnu kontrolu su 0 čestica/μl uz dozvoljeno odstupanje od 20 čestica/μl, što se odražava visokim KV% za navedeno područje. Za područja s deklariranim vrijednostima 500 i 1000 čestica/μl dobiven je vrlo nizak KV% u rasponu od 1,5 2,8%. Linearnost Dobiveni rezultati potvrđuju deklariranu linearnost do 1000 čestica/μl. Vrijednosti za sva koncentracijska područja kretala su se između % od teoretskih vrijednosti, dok je vrijednost za koncentraciju 1 koja predstavlja negativnu kontrolu u kojoj je deklarirana vrijednost 0 čestica/µl bila u prihvatljivim granicama ( 0 20 čestica/μl). U uzorcima kod kojih postoji broj čestica veći od granice linearnosti, osobito ako je prisutan veći broj, različitih čestica lako može doći do njihovih preklapanja unutar slike (500 slika po uzorku), što dovodi do pogrešnog prepoznavanja, a time i stavljanja promatrane čestice u krivu kategoriju. Da bi se to izbjeglo, nužno je takve uzorke razrijediti originalnim diluentom kako bi se postigli uvjeti za pravilno klasificiranje (<1000 čestica/ μl). Usporedna ispitivanja Eritrociti Rezultati ukazuju na dobra slaganja između metoda. Veći broj uzoraka s brojem eritrocita < 5 Erc/µL dobivenih na analizatoru u odnosu na mikroskopsku analizu sedimenta je vjerojatno posljedica mogućih oštećenja eritrocita centrifugiranjem, liziranjem u mokraći niske relativne volumne mase ili nedovoljnim resuspendiranjem sedimenta. Kristale kalcijeva oksalata, osobito kada se pojavljuju kao sitniji kristali kalcijeva oksalata-monohidrata, analizator može zamijeniti s eritrocitima i svrstati ih u kategoriju eritrocita. Prisutnost gljivica analizator također može staviti u kategoriju eritrocita, posebice ako se radi o koncentriranoj mokraći. Kod jako razrijeđene mokraće kao i kod razorenih eritrocita (mokraćni kamenac) kada se eritrociti pojavljuju kao nježne sjene ili oštećene stanice, analizator ih ne može kategorizirati. Zato svaki uzorak koji sadrži eritrocite treba dobro pregledati na zaslonu u kategoriji eritrocita, ali i artefakata jer analizator stanice koje ne prepoznaje šalje u kategoriju artefakta. Prepoznavanje eritrocita na osnovnoj razini je dobro i na zaslonu analizatora vide se dobre slike izomorfnih eritrocita, no detaljniju morfologiju nije moguće razaznati pa je potrebno provjeriti standardnom mikroskopskom analizom, što je sukladno rezultatima ranijih ispitivanja (9,10). 88 BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4, 2004.

9 M. Sikirica i sur. Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće Leukociti - Kod leukocita su usporednim ispitivanjem dobivena dobra slaganja između metoda prema dobivenim rezultatima. Nađen je, kao i kod eritrocita, veći broj uzoraka s leukocitima <5Lkc/µL brojenih na analizatoru dok ih se mikroskopskom analizom sedimenta nije našlo. To se može objasniti, kao i kod eritrocita, oštećenjem kod centrifugiranja, osobito kod razrijeđene ili alkalne mokraće (ph>8.0). Slike leukocita nazaslonu analizatora su dobre dok daljnja podjela (granulociti, limfociti, eozinofili, monociti, makrofagi) zahtijeva klasičnu mikroskopsku obradu (9,10). Male epitelne stanice Rezultati usporednih ispitivanja za male epitelne stanice pokazuju nešto lošija slaganja između metoda. To proizlazi iz preklapanja sličnih struktura, kao npr. makrofaga, leukocita, ili neprepoznavanja epitelnih stanica koje nisu okrugle kao npr. cilindrični oblici stanica prijelaznog epitela. Svaki uzorak u kojem se nađu male epitelne stanice trebao bi se dobro pregledati na zaslonu i provjeriti standardnom mikroskopskom analizom (9,10). Stanice pločastog epitela Dobiveni rezultati također pokazuju dobra slaganja između metoda. Iako je prepoznavanje stanica pločastog epitela dobro, mogućnost krivog prepoznavanje postoji kada se u sedimentu pojavljuju velike stanice prijelaznog epitela ( kišobran stanice). Kao i za svaki element sedimenta mokraće, tako i za stanice pločastog epitela treba prvo dobro pregledati dobivene slike na zaslonu. Slike pretraženih uzoraka dobivene na analizatoru su dobre i u dijelu identifikacije stanica pločastog epitela analizator je u mogućnosti zamijeniti manualni mikroskopski pregled sedimenta (9,10). Cilindri - Usporednim određivanjem za cilindre dobiveno je dobro slaganje između metoda. Analizator cilindre prepoznaje kao hijaline i nehijaline cilindre, što je dovoljno na osnovnoj razini mikroskopske podjele, ali slika za nehijaline cilindre na zaslonu nije dovoljno informativna da bi se moglo nađene cilindre prepoznati i staviti u pripadajuću kategoriju. Prisutnost hijalinih cilindara treba provjeriti na zaslonu jer u uzorcima koji sadrže sluzne niti može doći do krive kategorizacije. Temeljem prisutnosti nehijalinih cilindara treba se učiniti manualna mikroskopska analiza sedimenta kako bi se utvrdilo o kojim se cilindrima radi (9,10). Kod analize bakterija i gljivica analizator dobro prepoznaje te strukture premda je potrebno provjeriti slike na zaslonu zbog moguće zamjene za amorfne soli, dok je kod analize kristala potrebno vršiti subklasifikaciju jer neke kristale ne prepoznaje i stavlja ih u kategoriju neklasificiranih kristala. Dijagnostička osjetljivost i specifičnost Rezultati za dijagnostičku osjetljivost i specifičnost izraženi su prema gornjoj granici referentnih intervala određenih preporučenom, standardiziranom metodom za mikroskopsku analizu sedimenta mokraće (5,8,11,12). Dobiven visok stupanj dijagnostičke osjetljivosti (89-97%) i specifičnosti (84-94%) za ispitivane klinički relevantne elemente sedimenta mokraće, uz visok stupanj korelacije dobiven usporednim ispitivanjima, ukazuje da su rezultati dobiveni automatskom mikroskopskom analizom sukladni rezultatima dobivenima standardiziranom metodom za mikroskopsku analizu sedimenta mokraće, te da bi se automatska mikroskopska analiza mogla koristiti kao rutinska metoda za analizu mokraćnog sedimenta. ZAKLJUČAK Manualna mikroskopska analiza sedimenta mokraće još uvijek je najviše korištena metoda za pretraživanje kako staničnih elemenata tako i ostalih čestica sedimenta mokraće. Iako pruža bitne podatke kliničaru, nažalost ima i određenih nadostataka kao što je nedovoljna preciznost i subjektivna procjena mikroskopičara. Primjena automatizacije u analizi mokraće omogućava upravo u tom dijelu značajni napredak u odnosu na klasičnu metodu jer osigurava visoki stupanj standardizacije analitičkog postupka ali i objektivizira pretraživanje jer je izbjegnuta subjektivna procjena koja ovisi o iskustvu i vještini osobe koja promatra. Kako je kvalitativna analiza mokraće integralni dio laboratorijskih pretraga, osobito u dijagnostici i praćenju bolesti bubrega i infekcija mokraćnog sustava, mogućnost brze analize nativne necentrifugurane mokraće u bilo kojem trenutku uz detaljan ispis nalaza predstavlja veliku pomoć kliničaru u daljnjoj dijagnostičkoj strategiji. Rezultati provedene analitičke procjene mikroskopskog analizatora IRIS iq 200 ukazuju da bi se automatska metoda za mikroskopsku analizu sedimenta mokraće mogla koristiti kao rutinska metoda na osnovnoj razini jer analizator dobro prepoznaje elemente mokraće, ali i pruža mogućnost korigiranja nalaza provjerom prikazanih slika na zaslonu. Provjerom prikazanih slika smanjuje se pogreška, a povećava kvaliteta rada i pouzdanost nalaza. Subklasifikacija elemenata sedimenta mokraća za sada je gruba procjena i zahtijeva daljnju analizu. BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4,

10 Analitička procjena automatskog mikroskopskog analizatora IRIS iq u kvalitativnoj analizi mokraće M. Sikirica i sur. ANALYTICAL EVALUATION OF iq 200 AUTOMATIC MICROSCOPIC ANALYSER IN QUALITATIVE URINALYSIS ABSTRACT - Objective: Analytical evaluation of iq 200 automated urine microscopy analyzer and comparison with manual microscopy of supravitally stained specimens. Methods: Evaluation of iq 200 microscopy analyser (IRIS International Remote Imaging Systems,Inc.) carried out by comparison vs. manual microscopy supravitally stained specimens according to the European Urinalysis Guidelines (ELM- European Laboratory Medicine; European Urinalysis Group) recommendations. Results: Results obtained for 350 samples with regard to the most common clinically relevant elements of sediment show linear regression stastistics: for erythrocytes r=0.973, sensitivity 91% and specificity 94%; for leukocytes r=0.976, sensitivity 91% and specificity 94% ; for squamous epithelial cells r=0.936, sensitivity 97% and specificity 89%; for small epithelial cells r=0.703, sensitivity 89% and specificity 85% and for casts r=0.845, sensitivity 89% and specificity 84%.The within-run imprecision was based on ten measurements of suspension of fixed red blood cells as positive control (1000 particles/µl) with CV=1.80%, mean value (500 particles /µl) with CV=2.70%, and negative control (0 particles/µl) with CV=36.0%. Between-day imprecision (analyzer stability) measured during 10 days was performed by suspension of fixed red blood cells as positive control CV=1.50%, mean value (500 particles/µl) with CV=2,80%, and negative control (0 particles/µl) with CV=28,6%. The linearity was estimated with cell suspension in five concentration ranges and it was confirmed on 1000 particles /µl. Conclusion: iq 200 microscopy analyzer offers considerable savings in time and achieves a high degree of standardization. The analyzer is capable to recognize 12 particles at the basic level of differentiation but subclassification of cell types is rough estimation and further analysis is required. Key words: Urinalysis+methods LITERATURA: 11. Diendoerfer FH, Gangwer JR, Laird CW, et al. The Yellow IRIS urinalysis workstation: the first commercial application of automated intelligent microscopy. Clin Chem 1985; 31: Kutter D, An approach to clinical evaluation of the automated urine sediment analyser Sysmex UA Sysmex J Int 1991;1: Butch A. Preliminary expirience in automated urine microscopy with iq 200. Abstract. Abstracts from Industrial Workshop ISW 10. Updating urinalysis: Importance of accurate particle analysis. Clin Chem Lab Med 2003;41:S Kasadan LH, Chapoulad E, Dougherty WH, Haiby SA, Tindel JR. Comparison of the iq 200 automated urine microscopy analyzer automatic particle recognition performance to that of the 939 Udx urine pathology system. Clin Chem Lab Med 2003;41:S Kouri T, Fogazzi G, Gant V, Hallander H, Hofmann W, Guder WG. European urinalysis guidelines. ECLM - European Urinalysis Group. Scand J Clin Lab Invest 2000;60(Suppl 231): Sikirica M, Bobetić-Vranić T, Flegar-Meštrić Z, Kardum- Skelin I, Juretić D. Standardizirana obrada supravitalno obojenog sedimenta mokraće. Biochemia Medica 2002;12(3-4): NCCLS - Protokol za procjenu analizatora u kliničkoj kemiji. ECCLS 1986;3(2) 18. Hrvatska komora medicinskih biokemičara, Povjerenstvo za vanjsku procjenu kakvoće rada Hrvatskog društva medicinskih biokemičara, Zavod za kliničku kemiju KB Merkur : Harmonizacija laboratorijskih nalaza u području opće medicinske biokemije, Zagreb, 2004, www. hkmb. hr 19. Kasadan LH, Chapoulad E, Dougherty WH, Haiby SA, Tindel JR. Comparison of review strategies for a new flow imaging system. Summary: Poster L Presented at CLMA Salt Lake City, Utah - June iq Poster Summaries ( ). 10. Kasadan LH, Chapoulad E, Dougherty WH, Haiby SA, Tindel JR. Comparison of pathological cast analytical performance and flagging of automated urine microscopy analyzers: A new flow imaging system vs. flow cytometry. Summary: Poster L Presented at AACC Philadelphia, PA July iq Poster Summaries ( ). 11. Batinić D. Bolesti mokraćnih i spolnih organa; Dijagnostički postupci u bolestima mokraćnog sustava. U: Mardešić D. Pedijatrija. 6. izd. Zagreb: Školska knjiga, 2000; Seri I, Evans J. Clinical evaluation of renal and urinary tract disease. In: Taeusch WH, Ballard AR. Avery s Diseases of the Newborn. 7 th ed. Philadelphia; W.B. Saunders Co, 1998; BIOCHEMIA MEDICA god. 14, br. 3-4, 2004.