15. savetovanje veterinara Srbije 5. RASPROSTRANJENOST FUMONIZINA I METODE NJIHOVOG ODREÐIVANJA. Sandra Ðilas, Biljana Abramovic, Z.

Transcription

1 5. RASPROSTRANJENOST FUMONIZINA I METODE NJIHOVOG ODREÐIVANJA Sandra Ðilas, Biljana Abramovic, Z. Mašic* Kralak sadržaj: Fumonizini su mikotoksini koji kontaminiraju žitarice širom sveta. Najviše su prisutni u kukuruzu i proizvodima od kukuruza u kolicinama koje mogu da ugroze zdravlje ljudi i životinja. Obzirom na veliku geografsku rasprostranjenost fumonizina, znacajno je raspolagati sa podacima o njihovoj prisutnosti u našoj zemlji i ukazati na potencijalnu opasnost od fiimonizin-toksikoza. LI torn ciljuje neophodno uvesti i razviti pogodne metode za njihovo odredivanje kako u kukuruzu i proizvodima od kukuruza, toko i u razlicitim biološkim uzorcima. Preliminarni rezultati ukazuju da je sadržaj fumonizina kod nas ispodpreporucene maksimalno dozvoljene kolicine. Kljucne reci: fumonizini, rasprostranjenost, metode odredivanja. Uvod Fumonizini su grupa jedinjenja svrstana u fusarijumske mikotoksine. Danas je poznato petnaestak razlicitih fumonizina koji su grupisani u cetiri serije: A, B, C i P. Najrasprostranjeniji i direktno povezani sa patogenim efektima su fumonizini B serije, tako da je pažnja posvecena uglavnom samo njihovom odredivanju, kao i pracenju rasprostranjenosti. Fumonizini su veoma cesti kontaminenti kukuruza i proizvoda od kukuruza (1). Pored toga što izazivaju mikotoksikoze kod razlicitih vrsta životinja (2, 3), zabeleženo je prisustvo fumonizina B, (FB,) i njegovih metabolickih produkata (hidrolizata fumonizina) u mleku, mesu i jajima životinja hranjenih kontaminiranom hranom, kao i u urinu i izmetu. Male kolicine toksina se zadržavaju u bubrezima i jetri. Medutim, malo se zna o njihovom metabolizmu, kao i o osobinama i kretanju fumonizina u životnoj sredini. U ovom radu je dat pregled geografske rasprostranjenosti, kao i nivoi fumonizina u hranivima širom sveta na osnovu dostupnih podataka. Uporedene su nadene koncentracije fumonizina, kao i preporucene maksimalno dozvoljene kolicine od strane razlicitih zdravstvenih organizacija. Cilj ovog rada je da informiše o prisutnosti ovih toksina, a imajuci u vidu njihovu toksicnost i da se ukaže na znacaj njihovog odredivanja. t Rasprostranjenost u prirodi Prisustvo fumonizina u sirovom kukuruzu zavisi od klimatskih uslova kao Sto su: temperatura, vlažnost, suša, kišni period pred žetvu i u toku žetve (4). Na sadržaj fumonizina uticu i uslovi skladištenja, a optimalna vlažnost u toku skladištenja koja izaziva rast plesni koje produkuju fumonizin, kao i produkciju toksina je 18-23% (5). Isto tako, sadržaj fumonizina je povecan u kukuruzu koji su oštetili insekti. Hibridne vrste kukuruza * Sandra Ðilas, istraživac pripravnik, prof, dr Zoran Mašic, naucni savetnik, Naucni institut za veterinarstvo "Novi Sad", Novi Sad: prof, dr Biljana Abramovic, Departman za hemiju, Prirodnomatematicki fakultet, Novi Sad. 110

2 Zbornik referata i kratkih sadržaja su manje osetljive na fusarijumske infekcije, te je niza i produkcija toksina. KoJicina fumonizina u preradenom kukuruzu zavisi od nacina prerade, odnosno da li je kukuruz obraden suvim ili vlaznim mlevenjem (6). I pored toga što postoje podaci o veoma velikoj rasprostranjenosti fumonizina u znacajnim koncentracijama u kukuruzu i kukuruznim proizvodima širom sveta (1), zakonski propisi u cilju zabrane upotrebe kukuruza kontaminiranog ovim mikotoksinima jos nisu doneti. Na osnovu ispitivanja štetnosti po zdravlje životinja, date su samo preporuke svetskih zdravstvenih organizacija u cilju ogranicenja upotrebe kontaminiranog kukuruza u ishrani ljudi (Tabela 1) i razlicitih vrsta životinja. Prema predlozima Swiss Federal Office of Public Health, maksimalno dozvoljena kolicina FB i FB 2 u suvim kukuruznim proizvodima iznosi 1 mg/kg (7). French Council of Public Hygiene?reporucuje da maksimalno dozvoljeno prisustvo ukupnih fumonizina u žitaricama bude do 5 mg/kg (8). American Assotiation of Veterinary Laboratory Diagnosticians preporucuje da krmne smeše za životinje maksimalno mogu da sadrže sledece kolicine FB : 5 mg/kp za konje, 10 mg/kg za svinje i 50 mg/kg za živinu i goveda. Ove preporuke (Tabela? i su neoficijelno prihvacene i od strane US Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine (9). Istraživanja su pokazala da je manje od 1 mg FB)/kg telesne mase dnevno dovoljno da izazove toksicni efekat kod razlicitih vrsta životinja, dok je za Ijude preporuceno da dnevni unos FB t mora bid manji od lug/kg telesne mase (10). Tabela 1. Preporucene maksimalne dozvoljene kolicine fumonizina u kukuruzu za liudsku ishranu (11)

3 Podaci prikazani u tabeli 3 su samo deo sveobuhvatnih svetskih istraživanja u cilju monitoringa kontaminacije fumonizinima (1). Oni se stalno dopunjuju, te je ovo samo presek trenutno dostupnih podataka. Uzorci u kojima je potvdeno prisustvo fumonizina su: kukuruzno brašno, griz, palenta, kukuruzne pahuljice, kukuruz šecerac, konzervirani i smrznut kukuruz, ekstrudirani kukuruz, hleb, biskvit, cips, testo, skrob, decija hrana, pire, knedle, kukuruz kokicar, tortilje, supa i dr. U tabeli 3 su sumirani podaci ispitivanja ukupno 5211 uzoraka, od kojih je 60% bilo pozitivno na prisustvo FB. Najviše je bilo kontaminiranih uzoraka u Okeaniji 82% od 82 uzorka i u Africi 77% od 383 uzorka. Zatim slede: Južna Amerika sa 85% pozitivnih uzoraka od 266 ispitanih, Severna Amerika sa 63% od 1662, Evropa sa 53% od 1918 i Azija sa 52% od 900 ispitanih uzoraka. Prisustvo i kolicina FB ( je razlicita u razlicitim proizvodima. Najviše je kontaminiranih uzoraka kukuruza za ishranu životinja (82% od 1112 uzoraka) što je potvrdeno i pojavom leukoencefalomalacije kod konja, pulmonalnog edema kod svinja i drugih mikotoksikoza. Zatim slede mleveni kukuruzni proizvodi, kao što su: brašno, griz, palenta i gluten (73% od 517 uzoraka) (Tabela 4), endosperm (52% od 2525 uzoraka) (Tabela 5) i ostali proizvodi od kukuruza (40% od 892 uzorka).

4 Zbornik referata I kr at kilt sadržaja Tabela 3. Kontaminacija kukuruza i proizvoda od kukuruza razlicitog geografskog porekla ftimonizinima (1)

5 m u O osim u kukuruzu i proizvodima od kukuruza, fumonizini se mogu naci i u drugim poljoprivrednim i proizvodima za ljudsku ishanu: pirincu (13), šecernoj trsci (14), kao i pivu (15), dok u pšenici, jecmu, raži i ovsu nije potvrdeno njihovo prisustvo (16). Metode odredivanja Odredivanje fumonizina se sastoji iz nekoliko faza: uzorkovanje i priprema uzorka, ekstrakcija, precišcavanje ekstrakta, detekcija i odredivanje. Sve kvantitativne metode odredivanja fiimonizina (izuzev imunohemijske) zahtevaju naknadno precišcavanje sirovog ekstrakta uzorka ekstrakcijom na cvrstoj fazi (SPE - Solid-Phase Extraction). U tu svhu se koriste kolone (kertridži - cartridge) sa razlicitim sorbentima: kolone sa C g reversnom fazom (RP C 8 ) (17,18), kolona sa jakim anjonskim izmenjivacem (SAX - Strong Anion Exchange) (19) ili imunoaflnitetna (IMA - immunoaffinity) kolona (20). Za detekciju i odredivanje fumonizina uglavnom se koriste sledece metode: tankoslojna hromatografija (TLC), tecna hromatografija visoke efikasnosti (HPLC), gasna hromatografija (GC), imunohemijske metode (ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) i fluorimetrija (21). Od navedenih metoda najcešce se koristi metoda tecne hromatografije za analizu fluorescentnih derivata fumonizina. 114

6 Zbornik referata i kratkih sadrzaja TLC je jednostavna, brza i jeftina metoda, ali sa relativno visokom granicom detekcije (100 ng/g za kukuruz i ng/g za proizvode od kukuruza) (22). Reagensi koji se koriste za derivatizaciju fiimonizina nakon razvijanja ploce su: vanilin (23), p- anisaldehid (24) i fluoreskamin (22). Pošto fumonizini ne apsorpbuju elektromagnetno zracenje u vidljivoj i UV oblasti, a takode i ne fluoresciraju, potrebna je hemijska modifikacija kako bi se omogucila, nakon HPLC razdvajanja, detekcija fluorescentnim detektorom. Reagensi koji se koriste za derivatizaciju fumonizina su: fluoreskamin (25), naftalen-2,3-dikarboksialdehid/kalijumcijanid (26, 27), 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol (26), 6-aminohinolil-Nhidroksisukcinimidilkarbamat (28), 9-fluorenilmetil-hloroformat (29) i o-ftaldialdehid/2- merkaptoetanol (OPA) (30). Granica detekcije ili granica odredivanja ovih metoda je u intervalu od 2 do 100 ng/g. Za detekciju nederivatizovanih fumonizina HPLC razdvajanje je praceno nekom od maseno-spektrometrijskih tehnika od kojih je najcešce korišcena elektrosprej-masena spektrometrija (31). GC se koristi uglavnom za analizu hidrolizovanih proizvoda fumonizina naicon njihove odgovarajuce derivatizacije (esterifikacija i acilacija) sa plamenojonizacionim ili masenim detektorom (32). Granica detekcije je manja od 100 ng/g. Fluorimetrijski se brzo i jednostavno, nakon derivatizacije fumonizina, odreduje njihov ukupan sadržaj. Granica detekcije je 250 ng/g. Pored imunoafmitetnih kolona, ELISA je još jedna imunohemijska tehnika za odredivanje fumonizina. Granica odredivanja ELISA metodama je reda velicine ng/g (33), a korelacija sa rezultatima priznatih HPLC metoda je zadovoljavajuca. Istraživanja kod nas U našoj zemlji ne postoje podaci o odredivanju fumonizina, a njihova maksimalno dozvoljena kolicina nije propisana. Medutim, obzirom na uslove našeg klimatskog podrucja i cestu kontaminiranost kukuruza plesnima iz roda Fusarium (34, 35), postoje realni razlozi za sumnju na prisustvo fumonizina u kukuruzu našeg klimatskog podrucja. U cilju dobijanja podataka o kontaminiranosti kukuruza sa našeg podneblja, u laboratoriji za mikotoksikološka ispitivanja Instituta za veterinarstvo «Novi Sad», a u saradnji sa Departmanom za hemiju Prirodno-matematickog fakulteta u Novom Sadu, uvedena je metoda za odredivanje fumonizina tecnom hromatografijom sa fluorescentnom detekcijom, nakon imunoafmitetnog precišcavanja sirovog ekstrakta. Izvršena su preliminarna ispitivanja metode (36) predložene od strane AOAC (30), u cilju odredivanja njene efikasnosti i primenljivosti u našim uslovima. Ispitivanja su pokazala zadovoljavajuce rezultate u pogledu prinosa metode za odredivanje fumonizina ne samo u kukuruzu, vec i u sojinoj sacmi. Rezultati su pokazali prisustvo FB] u ispitanim uzorcima kukuruza i sojine sacme sa našeg tržišta u znatno nižim koncentracijama od predloženih maksimalno propisanih. Utvrdeni sadržaj FB, je iznosio 0,045-0,070 mg/kg u uzorcima kukuruza, odnosno 0,45 mg/kg u sojinoj sacmi. Prisustvo FB 2 nije utvrdeno u ispitanim uzorcima. Svakako, ovo su samo prelimininarni rezultati i na utvrdivanju realnog stanja u pogledu sadrzaja fumonizina kod nas neophodno je ispitati znatno veci broj uzoraka sa razlicitih lokaliteta.

7 Zakljucak Fumonizini su veoma rasprostranjeni u kukuruzu i proizvodima od kukuruza širom sveta u kolicinama koje uticu na zdravlje ljudi i životinja. Da bi se utvrdili nivoi tolerancije fumonizina u kukuruznim proizvodima potrebne su informacije o prirodnom prisustvu i izloženosti ljudi i životinja, kao i toksikološka ispitivanja. Tacno odredivanje fumonizina u kukuruzu i hrani na bazi kukuruza, kao i u biološkom materijalu je osnova za ispitivanje izloženosti ljudi i životinja ovim, verovatno karcinogenim mikotoksinima (klasa 2B karcinogena) (37). Danas su razvijene dovoljno tacne i pouzdane metode za odredivanje fumonizina cije su granice detekcije i odredivanja ispod koncentracija koje štetno uticu na zdravlje životinja i ljudi. Prvi podaci o prisustvu fumonizina u kukuruzu sa našeg tržišta ukazuju na veoma nizak sadržaj FB. Rad je finansiran od strane Ministarstva za nauku, tehnologiju i razvoj, Republike Srbije (Projekat: Razvoj novih i poboljšanje postojecih analitickih metoda i tehnika za pracenje kvaliteta životne sredine. Evidencioni broj projekta: 1622). Literatura /. United Nations Environment Programme, International Labour Organization, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety, (2000): Environmental Health Criteria 219, Fumonisin BI, World Health Organization, Geneva, 20-24, Wilson, T.M., Ross, P.P., Owens, D.L., Rice, L.G., Green, S.A., Jenkins, S.J., Nelson, H.A. (1992): Mycopathologia, 117: ; 3. Harrison, L.R., Colvin, B.M., Greene, J.T., Newman, I.E., Cole, J.R. Jr. (1990): J. Vet. Diagn. Invest., 2: ; 4. Shephard, G.S., Thiel, P.O., Stockenstrom, S., Sydenham, E.W. (1996): J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., 79: ; 5. Bacon, C.W., Nelson, P.E. (1994): J. FoodProt., 57: ; 6. Rennet, G.A., Richard, J.L. (1996): Food technology 50: ; 7. Swiss Federal Office of Public Health (1997): Revision d'ordonnance sur les substances etrangeres et les composants OSEC (RS ). Bern, Swiss Federal Office of Public Health, 2 pp (Circular No. 11); 8. Dragacci, S. (1999): 12 lh Cycle de Formation IRTAC, France; 9. Miller, M.A., Honstead, J.P., Lovell, R.A. (1996): Adv. Exp. Med. Bioi, 392: ; 10. Petersen, A., Thorup, I. (2001): Food Addit. Contam., 18: ; 11. U.S. Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition, Center for Veterinary Medicine (2001): Boletim Tecnico No. 36; 12. U.S. Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition, Center for Veterinary Medicine (2000) Abbas, H.K., Cartwright, R.D., Shier, W.T., Abouzied, MM., Bird, C.B., Rice, L.G., Ross, P.F., Sciumbato, G.L., Meredith, F.I. (1998): Plant Disease, 82: 22-25; 14. Shetty, P.H., Bhat, R. V. (1997): J. Agric. Food Chem., 45: ; 15. Torres, M.R., Sanchis, V., Ramos, A.J. (1998): Int. J. Food Microbiol, 39: ; 16. Meister, U., Symmank, H., Dahlke, H. (1996): Z. Lebensm. Unters. Forsch., 203: ; 17. Rice, L.G., Ross P.F. (1994): J. FoodProt., 57: ,; 18. Stack, M.E. (1998): J. AOAC Int., 81: ; 19. Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Thiel, P.G., Stockenstrom, S., Snijman, P.W., Van Schalkwyk, D.J. (1996): J. AOAC Int., 79: ; 20. Trucksess, M.W., Stack, M.E., Allen, S., Barrion, N. (1995): J. AOAC Int., 78: ; 21. Abramovic, B., Ðilas, S., Goal, F., Mašic, Z. (2001): Safe food II, Eko-konferencija 2002., Novi Sad, ; 22. Rottinghaus, G.E., Coatney, C.E., Minor, 116

8 Zbornlk referata i kratkih sadnaja H.C. (1992): J. Vet. Diagn. Invest., 4: ; 23. Pittet, A., Parisod, V., Schellenberg, M. 1992): J. Agric. Food Chem., 40: ; 24. Planner, R.D., Norred, W.P., Bacon, C.W., Voss, K.A., PeterspnR., ShackelfordD.D., Weisleder, D. (1990): Mycologia, 82:698- ~02; 25. Ross, P.P., Rice, L.G., Planner, R.D., Osweiler, G.D., Wilson, T.M., Owens, D.L.,.Ve/so«, H.A., Richard, J.L. (1991): Mycopathologia, 114: ; 26. Scott, P. M, Lmvrence, G. A.,(1994): J. AOAC Int., 77: ; 27. Bennett, G. A., Richard, J. L ): J. AOAC Int., 77: ; 28. Veldzquez.C., Van Bloemendal, C, Sanchis, V., Canela, R. (1995): J. Agric. Food Chem., 43: ; 29. Holcomb, M, Thompson, H. C. Jr., Hankins, L. J. (1993): J. Agric. Food Chem., 41: ; 30. AOAC Official Method (2001): AOAC INTERNATIONAL; 31. Hartl, M, Herderich, M.,Humpf, H.U. (1999): Eur. Food Res. Technoi, 209: ; 32. Sydenham, E.W., Gelderblom, W.C.A., Thiel, P.O., Marasas, W.F.O. (1990): J. Agric. Food Chem., 38: ; 33. Barna-Vetro, /., Szabo,., Fazekas, B., Solti, L (2000): J. Agric. Food Chem., 48: ; 34. Ðilas, S., Živkov-Baloš, M, Mrden, M., Mihaljev, Ž., Mašic, Z. (2001): Veterinarski zurnal Republike SrpskeJ, 3: ; 35. Mašic Z, Jakic-Dimic, D., Stan icev V., Sinovec Z. (2002): Vetirarski glasnik, 56:41-52; 36. Abramovic, B., Ðilas, S., Goal, F., Mašic, Z. (2003): II Regional Symposium.-"Chemistry and Environment" (primljeno za saopštenje); 37. IARC (1993): 56:

9 OCCURRENCE OF FUMONISINS AND METHODS OF DETERMINATION Sandra Ðilas, Biljana Abramovic, Z. Masic Summary: Fumonisins are mycotoxins that are frequently found as natural contaminants in cereals worldwide. Most often they are present in corn and corn-based products in amounts that can endanger health of humans and animals. Since they are spread all around the world, it is important to know data about their presence in our country and to point out potential danger offumonisin-toxicosis. Therefore, it is necessary to introduce and develop convenient methods for their detection in corn and corn products, and in different biosamples. Preliminary results show that the content offumonisins in our country does not exceed suggested maximally permitted quantities. Key words: fumonisin, occurrence, methods of determination. Prevci