Sveučilište u Zagrebu. Prirodoslovno-matematički fakultet. Biološki odsjek. Zvonimir Šamija

Transcription

1 Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Zvonimir Šamija RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA Diplomski rad U Zagrebu, 2014.

2 Ovaj rad je izrađen u Kliničkoj jedinici za tipizaciju tkiva, Kliničkog zavoda za transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju, Kliničkog bolničkog centra Zagreb, pod vodstvom prof. dr. sc. Zorane Grubić. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistar eksperimentalne biologije

3 Zahvaljujem se, prije svega, svojoj mentorici prof. dr. sc. Zorani Grubić na nesebičnoj pomoći pri oblikovanju ideje ovog diplomskog rada, za izradu kojeg sam motivaciju dobio upravo zahvaljujući njezinom znanstvenom i obrazovnom djelovanju. Posebno joj se zahvaljujem na ukazanom povjerenju, velikom strpljenju i stručnim savjetima kojima me je vodila kroz izradu ovog diplomskog rada. Također, želio bih se zahvaliti svim djelatnicima Kliničke jedinice za tipizaciju tkiva KBC-a Zagreb na ugodnoj radnoj atmosferi, nesebičnoj pomoći i susretljivosti, a posebno mag. biol. mol. Mariji Maskalan na strpljenju i pomoći u rješavanju svih problema i zapreka s kojima sam se susreo tijekom istraživanja. Posebno se zahvaljujem svojoj obitelj na bezuvjetnoj podršci tijekom proteklih godina i naravno, veliko hvala svim prijateljima koji su bili uz mene tijekom moga studija, a zbog kojih će mi to razdoblje ostati u nezaboravnom sjećanju.

4 Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Biološki odsjek Diplomski rad RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA Zvonimir Šamija Rooseveltov trg 6, Zagreb, Hrvatska U ovom radu analizirana je raspodjela alela i haplotipova HLA kod bolesnika uključenih u program nesrodne transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) u Hrvatskoj, s ciljem određivanja vjerojatnosti pronalaska HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. Unutar skupine od 150 nesrodnih bolesnika, određena je raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 te haplotipova HLA-A-B-DRB1, odnosno HLA-A-B-C-DRB1-DQB1. Aleli HLA određeni su metodama lančane reakcije polimerazom upotrebom specifičnih DNA početnica i oligonukleotidnih proba za alele HLA (metode: PCR-SSP i PCR-SSO). Haplotipovi HLA bolesnika određeni su segregacijskom analizom na temelju podataka o tipizaciji HLA članova uže obitelji. Usporedbom učestalosti alela HLA između ispitivane skupine bolesnika i zdrave kontrole nisu utvrđene statistički značajne razlike. Najčešći aleli bili su: HLA-A*02:01 (27,7%), B*51:01 (13,0%), C*07:01 (20,3%), DRB1*03:01 (15,3%) i DQB1*03:01 (23,3%). Od 227 različitih haplotipova HLA-A-B-DRB1, njih 197 pojavilo se samo jednom, a najzastupljeniji je bio: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%). Analiza haplotipova HLA koja je uključila 5 lokusa potvrdila je najveću učestalost haplotipa: HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01- DQB1*02:01 što je u skladu s prethodnim istraživanjima. Neuobičajene kombinacije alela HLA- B-C uočene kod 15 bolesnika i neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1 uočene kod 4 bolesnika te prisustvo rijetkih alela (A*29:01, B*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15 i DRB1*11:28) pokazali su se kao otežavajući čimbenici u pronalasku HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. (43 stranice, 14 slika, 15 tablica, 22 literarna navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: HLA, transplantacija krvotvornih matičnih stanica, nesrodni darivatelj Voditelj: Dr. sc. Zorana Grubić, izv. prof., KBC Zagreb Ocjenitelji: Dr. sc. Nada Oršolić, prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu Dr. sc. Silvija Černi, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu Dr. sc. Inga Marjanović, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu Rad prihvaćen:

5 BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology Graduation Thesis HLA ALLELE POLYMORPHISMS AMONG PATIENTS IN HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION PROGRAM Zvonimir Šamija Rooseveltov trg, Zagreb, Croatia The aim of the present study was to analyze the distribution of HLA alleles and haplotypes among patients (N=150) in hematopoietic stem cell transplantation program (HSCT) in Croatia, in order to determine the probability of finding an HLA matched unrelated donor. The distribution of HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 alleles and HLA-A-B-DRB1/HLA-A-B-C- DRB1-DQB1 haplotypes was investigated. HLA alleles were tested by Polymerase Chain Reaction with specific primers or probes (PCR-SSP and PCR-SSO). HLA haplotypes were determined by segregation analysis. Comparison of patients included in this study and healthy controls regarding the HLA allele distribution did not reveal any statistically significant difference. The most common alleles detected in our patient group were: HLA-A*02:01 (27.7%), B*51:01 (13.0%), C*07:01 (20.3%), DRB1*03:01 (15.3%) and DQB1*03:01 (23.3%). Out of 227 different detected HLA-A-B-DRB1 haplotypes, 197 were observed only once and the most frequent one was HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7.3%). Five loci haplotype analysis confirmed the highest frequency of HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01- DQB1*02:01 haplotype, which is in concordance with the previous studies. Unusual HLA-B-C combinations detected in 15 patients together with unusual HLA-DRB1-DQB1 combinations detected in four patients and the presence of rare alleles (A*29:01, A*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15, DRB1*11:28) were shown to be limiting factors in finding an HLA matched unrelated donor. (43 pages, 14 figures, 15 tables, 22 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: HLA, hematopoietic stem cell transplatation, unrelated donor Supervisor: Dr. Zorana Grubić, Assoc. Prof., University Hospital Centre Zagreb Reviewers: Dr. Nada Oršolić, Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Dr. Silvija Černi, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Dr. Inga Marjanović, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Thesis accepted:

6 Sadržaj 1.0. Uvod Glavni sustav tkivne podudarnosti Organizacija sustava HLA Obilježja sustava HLA Raspodjela alela HLA u svijetu Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA Antigen-predočne molekule HLA razreda I Antigen-predočne molekule HLA razreda II Transplantacija krvotvornih matičnih stanica Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica Ciljevi istraživanja Materijali i metode Ispitanici Izolacija DNA Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB Statistička analiza rezultata Rezultati Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u programu nesrodne TKMS Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike u programu nesrodne TKMS Rasprava Zaključak Literatura... 41

7 1.0. Uvod 1.1. Glavni sustav tkivne podudarnosti Geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (engl. Mayor Histocompatibility Complex - MHC) kod ljudi se nalaze na kratkom kraku kromosoma 6 u regiji 6p21.3 (Slika 1). Više od 200 dosad otkrivenih gena tog sustava obuhvaća kromosomsku regiju od približno 4000 kilobaza. Ta je regija najistraživaniji dio ljudskog genoma zbog činjenice da se unutar nje nalaze geni HLA (engl. Human Leukocyte Antigens) koji imaju značajnu ulogu u transplantaciji tkiva i organa, a također se smatraju ključnima i u nastanku pojedinih bolesti autoimune etiologije. Ključna funkcija gena HLA očituje se, kako u imunološkoj reakciji tako i u transplantacijskom kliničkom procesu, kroz funkciju njihovih najvažnijih produkata molekula HLA. One su glavni dio antigen-predočnog kompleksa na površini stanica, predočuju vlastite i strane peptidne dijelove citotoksičnim i pomoćničkim T-limfocitima. Upravo razlikovanje vlastitih od stranih peptida, koji se predočuju u sklopu molekula HLA, ključan je čimbenik u ishodu postupka transplantacije tkiva i organa [1] Organizacija sustava HLA Sustav HLA dijeli se u 3 genske regije (regija HLA razreda I, razreda II i razreda III). Regija HLA razreda I smještena je telomerno i sastoji se od dvije skupine gena klasičnih i neklasičnih. Skupinu klasičnih gena HLA razreda I čine geni HLA-A, -B i -C, čiji su produkti - molekule HLA, izraženi na gotovo svim stanicama u tijelu, s pojedinim iznimkama. Geni HLA- E, -F i -G dio su skupine neklasičnih gena HLA razreda I koja se od prve skupine u osnovi razlikuje zbog znatno slabijeg polimorfizma, drugačije tkivne rasprostranjenosti njihovih molekula i specifične funkcije. U ovu se skupinu ubrajaju i neki pseudogeni iako ih dio autora izdvaja kao zasebnu podskupinu gena HLA razreda I [1]. Regija HLA razreda II smještena je bliže centromeri i podijeljena je u 6 genskih podregija: HLA-DM, -DN, -DO, -DP, -DQ i -DR. Podregije HLA-DP, -DQ i -DR kodiraju molekule HLA razreda II koje se izražavaju na membrani stanica (antigen-predočne molekule HLA razreda II), dok preostale tri podregije (HLA-DM, -DN i -DO) kodiraju molekule koje nisu prisutne na staničnoj membrani i posredno su uključene u proces funkcionalnog formiranja antigen-predočnih molekula HLA razreda II. Molekule kodirane genskim podregijama HLA- 1

8 DM, -DN i -DO poglavito su važne u procesu vezanja peptidnih ulomaka s drugim molekulama HLA i prisutne su uglavnom u citoplazmi stanica, ali ne i na njihovoj površini. Molekule HLA razreda II (HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR) izražene su samo na membrani specijaliziranih antigen-predočnih stanica (makrofagi, dendritičke stanice, B-limfociti), ali i na pojedinim stanicama koje takvu funkciju mogu imati povremeno, poput nekih endotelnih stanica. Unutar regije HLA razreda II nalaze se i geni koji su ključni za konačni ustroj molekula HLA razreda I poput TAP1 i TAP2 (engl. Transporters Associated with antigen Processing) proteinskih pumpi za prijenos antigenskih dijelova iz citosola u endoplazmatski retikulum, kao i skupina gena za enzimske dijelove proteasoma koji cijepa velike proteinske antigene na manje peptidne dijelove [2]. Unutar regije HLA razreda III (tzv. centralna regija), koja se nalazi između regije HLA razreda I i II, smješteni su geni čiji produkti nisu direktno uključeni u procese imunološkog prepoznavanja i aktivacije stanica specifične imunosti, ali su važni jer posredno sudjeluju u imunološkoj reakciji. Geni unutar HLA razreda III kodiraju neke sastavnice komplementa (C2, C4A, C4B), proteine toplinskog šoka (engl. Heat Shock Proteins - HSP), enzim 21-hidroksilazu te neke važne citokine poput TNF-α i TNF-β (engl. Tumor Necrosis Factors) [3]. Unutar ove regije nema niti jedan gen HLA. Slika 1. Smještaj regije HLA na kraćem kraku kromosoma 6. (Preuzeto iz [4]) 2

9 Obilježja sustava HLA Nekoliko je osnovnih obilježja koja sustav HLA čine specifičnim i značajno određuju njegovu osobitost. Kad je riječ o nasljeđivanju gena HLA treba naglasiti kako ono prati Mendelove zakone nasljeđivanja, odnosno segregacije (Slika 2). Nasljeđivanje kombinacije alela HLA, točnije haplotipova HLA, klasičan je primjer Mendelovskog načina nasljeđivanja. Po jedan haplotip HLA nasljeđuje se od svakog roditelja pri čemu se oba izražavaju kodominantno na staničnoj membrani, što je posljedica kodominacije na razini gena [2]. Sljedeća osobitost sustava HLA odnosi se na mogućnost rekombinacije gena HLA i stvaranja novih haplotipova. Riječ je o procesu križnog spajanja ili crossing over-a (c.o.). Genetička zakonitost koja definira učestalost genetičke rekombinacije kroz proces c.o.-a temelji se na međusobnoj udaljenosti pojedinih gena. Naime, vjerojatnost c.o.-a je veća što su geni međusobno više udaljeni i obratno. Ista zakonitost uočena je i unutar regije HLA gdje vjerojatnost c.o.-a nije stalna i ovisi o međusobnoj udaljenosti gena HLA. Primjerice, pojava c.o.-a nikad nije uočena između gena HLA-DQB1 i -DRB1, dok je učestalost rekombinacije najveća između gena HLA-B i -DRB1. U načelu, stopa rekombinacije između gena HLA iznosi oko 1%, dakle vrlo je mala i ne pridonosi (barem ne u značajnijoj mjeri) genetičkoj varijabilnosti ovog genskog sustava [1]. Slika 2. Prikaz nasljeđivanja gena/haplotipova HLA u obitelji. 3

10 Možda najznačajnije obilježje sustava HLA, koje se snažno odražava na ulogu molekula HLA u imunološkoj reakciji, a izuzetno je važno u postupku kliničke transplantacije, svakako je velika genska raznolikost. Naime, sustav HLA najpolimorfniji je genski sustav kod čovjeka što je posljedica nekoliko genetskih mehanizama koji uključuju gensku konverziju, točkaste mutacije i već spomenutu rekombinaciju [2]. Do danas je utvrđeno više od alela HLA razreda I i II. Značajno veću raznolikost pokazuju aleli HLA razreda I s najpolimorfnijim lokusom HLA-B (Tablica 1). Razlike među alelima HLA većinom su prisutne u egzonima koji kodiraju α1 i α2 podjedinice α-lanca molekule HLA razreda I (egzoni 2 i 3) i u egzonu koji kodira α1 i β1 podjedinice molekule HLA razreda II (egzon 2). Spomenute podjedinice formiraju pukotine molekula HLA unutar kojih se vežu prerađeni peptidni dijelovi [5]. Tablica 1. Broj do sada otkrivenih alela HLA Lokus Broj alela HLA-A 2946 HLA-B 3693 HLA-C 2466 HLA-DPB1 472 HLA-DQB1 712 HLA-DRB 1684 (Prilagođeno prema [18]) Potrebno je naglasiti da se svakim danom otkrivaju novi aleli HLA te da njihov broj sigurno nije konačan (Slika 3). Kao što možemo vidjeti iz Slike 3, od travnja (ukupan broj alela HLA razreda I i II bio je oko 9550) do svibnja godine, otkriveno je oko 2500 novih alela. Osim polimorfizma, poligenija je još jedno obilježje koje uvjetuje antigensku razliku među jedinkama. To se svojstvo odnosi na činjenicu da se unutar jednog haplotipa HLA nalazi više gena HLA slične strukture i funkcije što osigurava (uz velik polimorfizam) veći broj različitih kombinacija molekula HLA unutar jedinke, a time i veću mogućnost predočavanja 4

11 različitih antigena izvršnim stanicama imunološkog sustava. Ovo se obilježje, kao i velik polimorfizam, smatra evolucijskom prilagodbom koja osigurava uspješniju borbu protiv mikroorganizama s velikim broj različitih antigena [2]. Slika 3. Broj novootkrivenih alela HLA razreda I i II od do godine. (Prilagođeno prema [6]). S obzirom na velik broja alela HLA u svijetu i veći broj gena HLA koji čine jedan fenotip, potencijalan broj mogućih fenotipova na razini populacije reda je veličine Međutim, stvaran broj fenotipova HLA, kako u svijetu tako i na razini pojedine populacije, znatno je manji, prvenstveno zbog još jednog važnog obilježja sustava HLA neravnoteže udruživanja (engl. linkage disequilibrium - LD) [7]. Riječ je o fenomenu učestalijeg povezivanja pojedinih alela HLA u specifične kombinacije, odnosno češće pojave pojedinih alela HLA u haplotipovima HLA, nego što je to za očekivati na temelju pojedinačnih frekvencija tih alela. Nekoliko je mogućih objašnjenja ovog fenomena poput djelovanja selekcijskih sila ili genetički uvjetovanih mehanizama koji potiču specifična udruživanja alela HLA u zajednički haplotip, a 5

12 koji su rezultat male udaljenosti među pojedinim lokusima HLA. Međutim, niti jedno od objašnjenja do sada nije dalo potpuni odgovor [3]. Najsnažnija neravnoteža udruživanja uočena je između bliskih lokusa HLA (npr. HLA-B-C, HLA-DRB1-DQB1 ili HLA-DQA1-DQB1). Međutim, postoje i cijeli haplotipovi koji pokazuju jaku neravnotežu udruživanja. Jedan od najboljih primjera za to je haplotip: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 odnosno HLA- A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01, s vrlo visokom učestalošću u brojnim populacijama u svijetu [8] Raspodjela alela HLA u svijetu Populacijska istraživanja, čiji je cilj utvrditi i analizirati učestalost odnosno raspodjelu alela HLA među različitim populacijama u svijetu, provode se kontinuirano još od početka ih godina. Na temelju rezultata niza istraživanja na području populacijske genetike, a koja uključuju analizu raspodjele alela HLA, napravljena je sljedeća podjela alela HLA: a) aleli HLA s relativno visokom učestalošću u svim populacijama b) aleli HLA uočeni u većini populacija, ali ih u nekima uopće nema ili su rijetko prisutni c) aleli HLA specifični samo za pojedine populacije Prema istraživanju provedenom godine najčešći alel HLA-A među europskom populacijom je HLA-A*02:01, inače vrlo čest i u ostalim svjetskim populacijama, primjerice u SAD-u ili Južnoj Americi (Slika 4). Ostali aleli HLA-A česti među europskom populacijom su: HLA-A*01:01, A*03:01, A*24:02. Raspodjela alela HLA-A*01:01 i A*03:01 pokazuje regionalne razlike s obzirom da su češći među nekim populacijama sjeverne Europe nego među populacijama na području jugoistočne Europe. Obrnuti je slučaj s alelom HLA-A*24:02 koji je češći na području jugoistočne Europe u odnosu na ostale europske regije. Prema istom istraživanju najčešće skupine alela na lokusu HLA-B bile su B*35 (najčešći alel B*35:01) i B*51 (najčešći alel B*51:01), inače relativno česti i u većini populacija u svijetu (Slika 5). Raspodjela alela B*35:01 i B*51:01 također pokazuje regionalne razlike. Naime, uočena je veća učestalost tih alela na području jugoistočne Europe, nego u populacijama zapadne i sjeverne Europe. Alel HLA-C*07 najčešći je alel lokusa HLA-C u Europi, ali i u mnogim svjetskim populacijama, s 6

13 manjom učestalošću na jugoistoku Europe u odnosu na ostale europske regije. Na lokusu HLA- DRB1 u Europi je najčešća skupina alela DRB1*11, odnosno aleli DRB1*11:01 i DRB1*11:04 koji također pokazuju razlike u učestalosti od sjevera do juga Europe, odnosno pad učestalosti od istoka prema zapadu Europe (Slika 6). Najčešća skupina alela lokusa HLA-DQB1, DQB1*03 prisutna je u većini populacija u svijetu s vrlo visokom učestalošću i za razliku od nekih navedenih primjera ne pokazuje izraženije regionalne razlike u učestalosti na području Europe [8]. Slika 4. Raspodjela alela HLA-A*02:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]). 7

14 Slika 5. Raspodjela alela HLA-B*51:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]). Slika 6. Raspodjela alela HLA-DRB1*11:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]). 8

15 Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA Kao što je već navedeno, dvije su skupine, odnosno dva razreda molekula HLA čija je glavna funkcija predočavanje vlastitih i stranih peptidnih dijelova izvršnim molekulama imunološkog sustava te pokretanje imunološke reakcije s ciljem eliminacije stranog antigena. Osnovne razlike između molekula HLA razreda I i II sadržane su u tipu antigena kojeg predočuju, tipu stanica kojima predočuju antigen i njihovoj tkivnoj zastupljenosti Antigen-predočne molekule HLA razreda I Molekule HLA razreda I građene su od dva polipeptidna lanca od kojih je teški α-lanac kodiran genima HLA razreda I (HLA-A, -B, -C), a drugi lanac, tzv. β 2 -mikroglobulin kodiran je genom na kromosomu 15. Molekula HLA razreda I građena je od četiri osnovna dijela: vanjski dio koji veže peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski dio (Slika 7). Stabilnu strukturu na membrani stanice molekula HLA razreda I ima u obliku heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog peptidnog ulomka. Molekule HLA razreda I u pukotinu mogu vezati peptide veličine 8-11 aminokiselina. Pukotina je najvažniji dio molekule izgrađen od 180 aminokiselina stereokemijski podijeljenih u dva dijela: α 1 i α 2. Upravo je polimorfizam gena HLA, odnosno brojni alelni oblici, odgovoran za različitost stereokemijske površine vezne pukotine, čime se osigurava vezanje velikog broja potencijalnih antigena. Dio oko vezne pukotine, zajedno sa stranim antigenom, prepoznaje receptor T-limfocita. Treći dio α- lanca visoko je očuvan i služi kao vezno mjesto za molekulu CD8 citotoksičnih T-limfocita. Iz navedenog je jasno da molekule HLA razreda I (HLA-A, -B i C) predočuju antigene CD8+ citotoksičnim T-limfocitima i to mehanizmom tzv. spregnutog prepoznavanja gdje se receptori T-limfocita moraju određenim afinitetom vezati kako za antigenski ulomak, tako i za dijelove molekule HLA. Molekule HLA razreda I nalaze se na gotovo svim stanicama s jezgrom i predočuju prerađene citosolne ili endogene antigene poput virusnih peptida, peptidnih dijelova drugih unutarstaničnih patogena, razgradnih dijelova mutiranih tumorskih proteina i sl. [2]. 9

16 Antigen-predočne molekule HLA razreda II Molekule HLA razreda II građene su od dva polipeptidna lanca α i β od kojih su oba kodirana genima HLA. Teški α-lanac kodiraju A geni HLA razreda II (npr. α-lanac molekule HLA-DP kodira gen DPA1), dok laki β-lanac kodiraju B geni (npr. β-lanac molekule HLA-DP kodira gen HLA-DPB1). Polimorfizmu molekula HLA razreda II znatno više pridonose geni koji kodiraju β-lanac zbog većeg broja alela, poglavito najpolimorfniji gen HLA razreda II - HLA- DRB1. Molekule ovog razreda također se sastoje od četiri osnovna dijela: vanjski dio koji veže peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski dio (Slika 7). Kao i u slučaju molekula HLA razreda I, molekule HLA razreda II stabilnu strukturu na membrani stanice imaju u obliku heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog peptidnog ulomka. Veznu pukotinu čine dijelovi lanaca α 1 i β 1, s naglaskom da su u slučaju ovih molekula krajevi pukotine otvoreni (za razliku od molekula HLA razreda I) pa se vezani peptidni dijelovi mogu nalaziti i dijelom izvan pukotine, što u konačnici omogućuje vezanje većih peptida građenih od aminokiselina. Dio β-lanca, točnije β2 domenu molekule HLA razreda II prepoznaje molekula CD4 pomagačkih T-limfocita. Dakle, u slučaju molekula HLA razreda II antigeni se predočuju CD4+ pomagačkim T-limfocitima jednakim mehanizmom spregnutog prepoznavanja. Molekule HLA razreda II predočuju vezikularne ili egzogene antigene mnogih izvanstaničnih patogena i to nakon procesa fagocitoze. Nalaze se isključivo na fagocitnim odnosno antigen-predočnim stanicama poput makrofaga, dendritičkih stanica, B-limfocita te nekih endotelnih i epitelnih stanica [2]. 10

17 Slika 7. Shematski prikaz građe molekula HLA razreda I i razreda II. (Prilagođeno prema [3]) Transplantacija krvotvornih matičnih stanica Postupak transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) uobičajena je metoda liječenja mnogih malignih bolesti, ali i niza genetskih poremećaja koji rezultiraju patofiziološkim promjenama u funkciji krvotvornog tkiva. Kod bolesnika sa zloćudnim tumorima krvotvornog sustava (leukemije i limfomi), TKMS je metoda liječenja koja bolesnicima pruža dobre mogućnosti za izlječenje i u konačnici preživljenje [9]. Tri su oblika TKMS obzirom na genetički odnos primatelja i darivatelja: autologna, singenična i alogenična transplantacija. Autolognom transplantacijom bolesnik prima vlastite matične stanice koje su se prikupile prije postupka liječenja maligne bolesti te su time ostale neoštećene uslijed primjene agresivnih metoda liječenja poput kemoterapije. Također, ovaj oblik transplantacije podrazumijeva i korištenje matičnih stanica iz umbilikalne krvi, ukoliko je pacijentu ista i pohranjena. Singenična transplantacija podrazumijeva TKMS od genetički identične jedinke, dakle jednojajčanog blizanca. Ovim se oblikom transplantacije u potpunosti mogu izbjeći neželjeni učinci transplantacije koji su posljedica razlika u genetičkoj strukturi primatelja i darivatelja. 11

18 Treći oblik TKMS je alogena ili alogenična transplantacija gdje bolesnik prima krvotvorne matične stanice (KMS) od HLA podudarnog darivatelja. Podudarnost HLA između primatelja i potencijalnog darivatelja jedan je od ključnih čimbenika za uspješan ishod transplantacije. Približno 30% bolesnika pronalazi genotipski ili fenotipski HLA podudarnog darivatelja unutar obitelji (Slika 8a i 8b). U ostalih 70% slučajeva, kada unutar obitelji nema genotipski HLA, odnosno fenotipski HLA identičnog darivatelja, pristupa se pronalaženju fenotipski HLA podudarnog nesrodnog darivatelja kroz postupak pretraživanja nacionalnog ili svjetskog registra dobrovoljnih darivatelja KMS [7]. Prva alogenična TKMS u Hrvatskoj izvedena je godine (od srodnog darivatelja), a prva alogenična TKMS od HLA podudarnog nesrodnog darivatelja izvedena je godine u KBC-u Zagreb. OTAC MAJKA A*03 A*24 A*29 A*30 B*35 B*57 B*44 B*53 DRB1*04 DRB1*11 DRB1*10 DRB1*13 A*29 B*44 A*03 B*35. A*29 B*44 A*03 B*35 A*30 B*53 A*03 B*35 DRB1*10 DRB1*04 DRB1*10 DRB1*04 DRB1*13 DRB1*04 BOLESNICA BRAT SESTRA Slika 8a. Obitelj u kojoj bolesnica ima genotipski HLA identičnog brata. 12

19 OTAC MAJKA A*24 A*23 A*01 A*23 B*35 B*44 B*08 B*44 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*03 DRB1*07 A*01 B*08 A*23 B*44. A*01 B*08 A*24 B*35 A*23 B*44 A*24 B*35 DRB1*03 DRB1*07 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*04 BOLESNIK SESTRA SESTRA Slika 8b. Obitelj u kojoj bolesnik ima fenotipski HLA identičnog darivatelja (majka). U postupku određivanja podudarnosti HLA između bolesnika i darivatelja, kriteriji Europske skupine za TKMS (engl. European Bone Marrow Transplantation EMBT) i Američkog nacionalnog programa darivatelja KMS (engl. National Marrow Donor Program NMDP) zahtijevaju tipizaciju gena HLA-A, -B, -C i -DRB1 (podudarnost 8/8) odnosno gena HLA-A, -B, -C, -DRB1 i DQB1 (podudarnost 10/10) na visokoj rezoluciji [9]. Naime, pojam visoka rezolucija podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 4 znamenke (npr. HLA-A*02:01, B*07:02). S druge strane, pojam niska rezolucija podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 2 znamenke čime se određuje samo skupina alela (npr. HLA-A*02, B*07). Alogenična TKMS se kao terapijska metoda primjenjuje zbog djelovanja transplantata protiv tumora (engl. Graft versus Leukemia Effect - GvL) gdje imunokompetentne stanice presatka prepoznaju tumorske antigene zloćudnih stanica u sklopu molekula HLA razreda I čime se aktivira imunološka reakcija citolize zloćudnih stanica posredovana 13

20 citotoksičnim T-limfocitima. Djelotvorni učinak TKMS na bolest značajno je umanjen neželjenim učincima, prvenstveno reakcijom presatka protiv primatelja (engl. Graft versus Host Disease - GvHD) gdje imunokompetentne stanice iz presatka prepoznaju antigene primatelja, slično kao u efektu GvL. Međutim, u ovom slučaju reakcija nije ograničena isključivo na zloćudne stanice. Pojava GvDH znatno je manja u slučaju transplantacije od srodnog darivatelja. Značajno je manja i u slučaju HLA podudarnosti 10/10 između primatelja i darivatelja. Terapijski uspjeh dugog preživljenja nakon TKMS može se postići u približno 40% bolesnika koji se liječe ovom terapijskom metodom. Važno je spomenuti da se uspješnost TKMS u liječenju malignih i drugih bolesti znatno povećala unaprjeđenjem postupka određivanja podudarnosti HLA (tipizacija na visokoj rezoluciji), ali i povećanjem broja darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru što značajno povećava vjerojatnost pronalaska HLA podudarnog nesrodnog darivatelja [9] Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica Hrvatski registar dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica (engl. Croatian Bone Marrow Donor Registry CBMDR) nacionalni je hrvatski registar za liječenje alogeničnom transplantacijom od nesrodnih darivatelja KMS. Njegova je osnovna zadaća organizacija i provođenje procesa pretraživanja i pronalaženja HLA podudarnog nesrodnog darivatelja kako u našem registru tako i u međunarodnim registrima dobrovoljnih darivatelja KMS [10]. Hrvatski registar osnovan je godine i sve do imao je vrlo skroman broj upisanih dobrovoljnih darivatelja. Naglo širenje započelo je godine podizanjem javne svijesti o važnosti postojanja registra s dovoljno velikim brojem darivatelja. Registar je godine brojao približno 9000 dobrovoljnih darivatelja KMS, a danas ima gotovo upisanih darivatelja (Slika 9) kojima su određeni geni HLA-A, -B i -DRB1. Naš registar je dio Svjetskog registra dobrovoljnih darivatelja (engl. Bone Marrow Donors Worldwide BMDW). 14

21 Slika 9. Rast broja dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica u hrvatskom registru. Svjetski registar dobrovoljnih darivatelja KMS (BMDW) osnovan je godine u nizozemskom gradu Leidenu. U početku je uključivao osam nacionalnih registara s oko dobrovoljnih darivatelja. Broj nacionalnih registara i banaka krvi iz pupkovine uključenih u BMDW rastao je iz godine u godinu (Slika 10). Danas BMDW broji preko 24 milijuna dobrovoljnih darivatelja s uključena 74 registra iz 53 zemlje te 49 banaka krvi iz pupkovine iz 33 zemlje. Najveći udio u broju dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u imaju europske zemlje i SAD (Slika 11). S druge strane, udio dobrovoljnih darivatelja iz azijskih zemalja, unatoč velikom broju stanovnika, iznosi samo 14%. Broj dobrovoljnih darivatelja KMS u nacionalnim registrima europskih zemalja uključenim u rad BMDW-a prikazan je na Slici 12. Treba spomenuti da se Njemačka ističe kao zemlja s najvećim brojem dobrovoljnih darivatelja u Europi, odnosno ona je jedina europska zemlja koja ima više od milijun dobrovoljnih darivatelja [20]. 15

22 Slika 10. Broj nacionalnih registara dobrovoljnih darivatelja uključenih u rad BMDW-a (engl. Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]). Slika 11. Udio broja dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u (engl. Bone Marrow Donors Worldwide) po kontinentima. (Preuzeto s [20]). 16

23 Slika 12. Broj darivatelja u europskim zemljama čiji su nacionalni registri uključeni u BMDW (engl. Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]). 17

24 2.0. Ciljevi istraživanja 1. Analizirati raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 među bolesnicima u programu TKMS s nesrodnog darivatelja u Hrvatskoj. 2. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -DRB1 među bolesnicima u programu TKMS s nesrodnog darivatelja. 3. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u programu TKMS s nesrodnog darivatelja. 4. Utvrditi prisutnost neuobičajenih haplotipova HLA među bolesnicima 5. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u CBMDR-u. 6. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u BMDW-u. 7. Za bolesnike u programu TKMS iz Hrvatske odrediti rizične alele HLA za pronalaženje HLA podudarnog darivatelja 10/10. 18

25 3.0. Materijali i metode 3.1. Ispitanici Ovo istraživanje obuhvatilo je 150 bolesnika koji su se liječili na Zavodu za hematologiju, Klinike za internu medicinu, Kliničkog bolničkog centra Zagreb. Svim ispitanicima je iz uzorka periferne krvi izolirana DNA te se odgovarajućim metodama pristupilo postupku tipizacije tkiva, odnosno određivanju alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB Izolacija DNA Izolacija DNA iz uzorka periferne krvi izvedena je upotrebom komercijalnog seta za izolaciju (MagNA Pure LC DNA; Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany) prema uputama koje je naveo proizvođač Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 Aleli navedenih lokusa HLA određivali su se metodama PCR-SSO (engl. Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotides) i PCR-SSP (engl. Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers). Metoda PCR-SSO manje je specifična i koristi se za postupke tipizacije tkiva na tzv. niskoj ili srednjoj rezoluciji. Temelji se na klasičnom umnožavanju specifičnog dijela DNA pomoću biotinom obilježenih početnica. Umnožena DNA se zatim hibridizira upotrebom mikrosfera na koje su vezane DNA probe specifične za određene oligonukleotidne sljedove. DNA probe označene su fluorokromom streptavidin-fikoeritrin (engl. Streptavidin-Phycoerythrin - SAPE). Kromogena interakcija boje SAPE i biotina događa se samo u slučaju specifičnog vezanja određene DNA probe za komplementaran slijed nukleotida na amplifikonima što se očitava kao pozitivna reakcija pomoću Luminex tehnologije (The Luminex, LABScan 100). S obzirom da se svaka mikrosfera sa specifičnim DNA probama može razlikovati od ostalih (zahvaljujući endogenim bojama), uređaj može s visokom točnošću odrediti koja se DNA proba vezala odnosno o kojem se alelnom obliku gena HLA radi. Rezultati ovog postupka analiziraju se u programu Quicktype For Lifecodes (Slika 13). 19

26 Slika 13. Rezultati analize postupka hibridizacije DNA (metoda PCR-SSO). A) Proba CON je kontrolna i mora biti pozitivna za sve uzorke. B) Mikrosfera 06 pokazuje pozitivnu reakciju na uzorku C1. C) Na uzorku C1 mikrosfera 01 negativna. Sljedeća metoda određivanja alela HLA znatno je osjetljivija i koristi se za postupke tipizacije tkiva na visokoj rezoluciji. Radi se o metodi PCR-SSP koja se temelji na umnožavanju specifičnog slijeda DNA upotrebom početnica specifičnih za jedan ili više alela HLA. Početnice se vežu samo za one sljedove DNA kojima su u potpunosti komplementarne, stoga nastali amplifikoni predstavljaju specifično umnožene alele pojedinog lokusa HLA. Nakon PCR reakcije, uzorci umnožene DNA nanose se na agarozni gel u kombinaciji s bojom te se primjenjuje tehnika elektroforetskog razdvajanja DNA na temelju veličine njezinih fragmenata (Slika 14). 20

27 Slika 14. Prikaz rezultata tipizacije HLA metodom PCR-SSP. Uzorci 1, 3, 5, 7 i 8 predstavljaju pozitivne reakcije sa specifično umnoženim PCR produktom dok su reakcije 2, 4 i 6 negativne (vidljiva je samo kontrolna DNA) Statistička analiza rezultata Učestalosti alela i haplotipova HLA među našim bolesnicima određene su metodom izravnog brojanja. Razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA između naše skupine bolesnika i zdrave populacije kao i razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA u odnosu na druge populacije u Europi utvrđene su upotrebom χ 2 testa. Razina statističke značajnosti, odnosno P vrijednost ispravljena je za svaki lokus HLA s obzirom na broj uočenih alela pojedinog lokusa HLA. Podaci o učestalosti haplotipova među bijelcima europskog porijekla utvrđeni su pomoću programa HaploStats [21]. 21

28 4.0. Rezultati 4.1. Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u programu nesrodne TKMS Učestalost alela lokusa HLA-A kod 150 bolesnika uključenih u istraživanje prikazana je u Tablici 2. Ukupan broj otkrivenih alela HLA-A bio je 24. Najčešći aleli HLA-A kod navedenih ispitanika bili su: A*02:01, A*01:01, A*24:02, A*03:01, A*11:01 i A*26:01. Devet alela: A*02:05, A*03:02, A*24:03, A*24:07, A*29:01, A*30:01, A*30:04, A*66:01, A*69:01 i A*80:01 pojavili su se samo jednom među našim bolesnicima. Tablica 2. Učestalost alela HLA-A među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150) Alel HLA-A* n % Alel HLA-A* n % 01: , : , : , :01 1 0, :02 2 0, :02 3 0, :05 1 0, :01 1 0, : , :04 1 0, :02 1 0, :01 6 0, : , : , :01 9 0, :01 5 0, : , :01 1 0, :03 1 0, : , :07 1 0, :01 1 0, : , :01 1 0,0033 n - broj uočenih alela HLA; % - učestalost alela 22

29 Analiza raspodjele alela HLA-B unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici 3. S obzirom da je gen HLA-B najpolimorfniji gen HLA, 35 otkrivenih alela je u skladu s očekivanjima. Najčešći alel ovog lokusa bio je B*51:01 s učestalošću od 13,0%, a još su samo dva alela (B*18:01 i B*08:01) bila zastupljena s učestalošću većom od 10,0%. Aleli HLA-B s najmanjom zastupljenošću bili su: B*07:04, B*07:05, B*14:01, B*41:01, B*45:01, B*50:01 i B*53:01. Tablica 3. Učestalost alela HLA-B kod bolesnika u programu nesrodne TKMS (N=150) Alel HLA-B* n % Alel HLA-B* n % 07: , :02 6 0, :04 1 0, :01 1 0, :05 1 0, :02 4 0, : , : , :02 6 0, :03 6 0, :01 1 0, :05 3 0, :02 6 0, :27 5 0, :01 6 0, :01 1 0, : , :01 8 0, :02 9 0, :01 1 0, : , : , : , :01 8 0, :02 2 0, :01 1 0, : , :01 3 0, :08 3 0, :01 3 0, :01 9 0, : , :01 8 0, :01 3 0, :01 2 0,0067 n - broj uočenih alela; % - učestalost alela 23

30 U Tablici 4 prikazana je učestalost alela HLA-C među nesrodnim bolesnicima uključenim u ovo istraživanje. Ukupno je pronađen 21 različiti alel HLA-C, od kojih je najveću učestalost pokazao alel C*07:01 (20,3%), slijedio ga je alel C*04:01 (14,7%) te aleli C*02:02 (9,7%), C*12:03 (9,3%) i C*07:02 (8,0%). Najmanje zastupljeni aleli HLA-C bili su C*07:18, C*16:02 i C*17:01 s učestalošću od svega 0,3%. Tablica 4. Učestalost alela HLA-C među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150) Alel HLA-C* n % 01: , : , :02 2 0, :03 7 0, :04 2 0, : , : , : , : , : , :04 5 0, :18 1 0, :02 7 0, :02 9 0, : , : , : , :01 2 0, :02 1 0, :01 1 0, :03 4 0,0133 n - broj uočenih alela; % - učestalost alela 24

31 Analiza raspodjele alela HLA-DRB1 unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici 5. U ovom je istraživanju utvrđeno 30 različitih alela HLA-DRB1. Tri alela: DRB1*03:01 (15,3%), DRB1*01:01 (11,7%) i DRB1*11:04 (10,7%) bila su najčešća, dok su preostali otkriveni aleli DRB1 bili zastupljeni s učestalošću manjom od 10,0%. Najraznovrsniji gen DRB1 u ovom istraživanju bio je DRB1*04 sa sedam različitih alela (DRB1*04:01, DRB1*04:02, DRB1*04:03, DRB1*04:04, DRB1*04:07, DRB1*04:08 i DRB1*04:15). Najmanje zastupljeni aleli HLA-DRB1 bili su: DRB1*01:03, DRB1*04:03, DRB1*04:07, DRB1*04:15, DRB1*11:02, DRB1*11:03, DRB1*11:15, DRB1*11:28 i DRB1*16:02. Tablica 5. Učestalost alela HLA-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150) Alel HLA-DRB1* n % Alel HLA-DRB1* n % 01: , :02 1 0, :02 2 0, :03 1 0, :03 1 0, : , : , :15 1 0, :01 5 0, :28 1 0, :02 3 0, :01 4 0, :03 3 0, : , :04 5 0, : , :07 1 0, :03 5 0, :08 2 0, :01 3 0, :15 1 0, :54 4 0, : , : , :01 4 0, :02 7 0, :01 4 0, : , : , :02 1 0,0033 n broj uočenih alela; % - učestalost alela 25

32 Učestalost alela lokusa HLA-DQB1 kod 150 tipiziranih bolesnika uključenih u istraživanje prikazane su u Tablici 6. Ukupno 16 različitih alela HLA-DQB1 lokusa otkriveno je unutar ove skupine bolesnika. Najučestalijih 5 alela DQB1 bili su: DQB1*03:01 (23,3%), DQB1*02:01 (15,3%), DQB1*05:01 (14,0%), DQB1*05:02 (9,0%) i DQB1*06:02 (8,3%). Najmanje zastupljeni aleli bili su DQB1*03:04 i DQB1*03:19, s učestalošću od svega 0,3%, dok je alel DQB1*06:09 bio prisutan dvaput. Tablica 6. Učestalost alela HLA-DQB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150) Alel HLA-DQB1* n % 02: , : , : , : , : , :04 1 0, :19 1 0, :02 3 0, : , : , :03 7 0, :01 7 0, : , : , :04 8 0, :09 2 0,0067 n broj uočenih alela; % - učestalost alela 26

33 4.2. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS U Tablici 7 prikazana je raspodjela 30 najčešćih haplotipova HLA-A-B-DRB1 uočenih unutar skupine bolesnika uključenih u program nesrodne TKMS. Ukupan broj utvrđenih haplotipova HLA-A-B-DRB1 bio je 227, dakle 197 haplotipova HLA-A-B-DRB1 pojavilo se samo jednom. Iz Tablice 7 vidljivo je da su samo četiri haplotipa HLA-A-B-DRB1 bila prisutna više od pet puta. Najučestaliji haplotip bio je HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%) kojeg je imalo čak 22 bolesnika. Tablica 7. Prikaz najučestalijih haplotipova HLA-A-B-DRB1 unutar skupine bolesnika u programu TKMS (N=150) HLA-A*-B*-DRB1* n % HLA-A*-B*-DRB1* n % 01:01-08:01-03: , :01-35:01-13:01 2 0, :01-18:01-11:04 8 0, :01-41:02-13:03 2 0, :01-51:01-01:01 7 0, :01-44:02-15:01 2 0, :01-57:01-07:01 6 0, :01-44:03-07:01 2 0, :01-52:01-15:02 4 0, :01-44:27-16:01 2 0, :01-18:01-11:04 4 0, :01-51:01-11:01 2 0, :01-27:05-01:01 3 0, :01-07:02-11:01 2 0, :01-51:01-16:01 3 0, :01-07:02-13:02 2 0, :01-35:01-01:01 3 0, :01-07:02-15:01 2 0, :02-51:01-01:01 3 0, :01-35:01-11:04 2 0, :01-51:01-15:01 2 0, :01-51:01-01:01 2 0, :01-07:02-15:01 2 0, :02-07:02-15:01 2 0, :01-08:01-03:01 2 0, :02-57:01-07:01 2 0, :01-15:01-11:04 2 0, :01-13:02-07:01 2 0, :01-27:02-16:01 2 0, :01-58:01-13:02 2 0,0067 n broj haplotipova; % - učestalost haplotipova 27

34 4.3. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika u program nesrodne TKMS Tablica 8 prikazuje 10 HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 haplotipova uočenih dva ili više puta među našim bolesnicima. Učestalost visoko očuvanog haplotipa HLA-A*01:01-B*08:01- C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01 ostala je nepromijenjena u usporedbi s Tablicom 7 gdje su promatrani haplotipovi HLA-A-B-DRB1. Učestalost ostalih haplotipova HLA promijenila se neznatno, što jasno govori o snažnoj neravnoteži udruživanja između pojedinih alela HLA zbog koje se, čak i u slučaju proširenja promatranog haplotipa HLA s dva dodatna lokusa, učestalost haplotipova HLA ne mijenja značajno. Važno je spomenuti da su haplotipovi 150 bolesnika uključenih u ovo istraživanje utvrđeni na temelju podataka o tipizaciji članova uže obitelji, primjenom Mendelovih zakona nasljeđivanja odnosno segregacije (tzv. segregacijska analiza). Tablica 8. Prikaz deset najučestalijih haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika uključenih u program nesrodne TKMS HLA-A*-B*-C*-DRB1*-DQB1* n % 01:01-08:01-07:01-03:01-02: , :01-18:01-07:01-11:04-03:01 7 0, :01-51:01-14:02-01:01-05:01 5 0, :01-57:01-06:02-07:01-03:03 5 0, :01-52:01-12:02-15:02-06:01 4 0, :01-18:01-07:01-11:04-03:01 4 0, :01-35:01-04:01-01:01-05:01 3 0, :01-27:05-02:02-01:01-05:01 2 0, :01-51:01-14:02-16:01-05:02 2 0, :02-51:01-14:02-01:01-05:01 2 0,0066 n broj uočenih haplotipova; % - učestalost haplotipova 28

35 Tablica 9 prikazuje haplotipove HLA unutar naše skupine bolesnika s neuobičajenim kombinacijama alela HLA-B-C, odnosno HLA-DRB1-DQB1. Kod 15 bolesnika (10%) uočena je neuobičajena kombinacija alela na lokusima HLA-B i -C, od toga kombinacija B*35:03-C*12:03 kod čak tri bolesnika. Neuobičajene kombinacije alela DRB1 i DQB1 uočili smo u haplotipu kod četiri bolesnika (2,7%) Tablica 9. Prikaz neuobičajenih kombinacija alela HLA-B-C i HLA-DRB1-DQB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS Haplotip HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1* 02:01 15:01 02:02 07:01 02:02 01:01 18:01 07:18 03:01 02:01 02:01 18:01 03:02 11:04 03:01 24:02 35:01 14:02 03:01 02:01 11:01 35:03 12:03 04:08 03:04 24:02 35:03 12:03 07:01 03:03 26:01 35:03 12:03 07:01 02:02 26:01 35:08 12:03 04:04 03:01 23:01 44:02 04:01 07:01 02:02 24:02 44:02 04:01 13:01 06:03 02:02 49:01 04:01 03:01 02:01 02:01 51:01 06:02 11:01 03:01 03:01 51:01 12:02 01:01 05:01 03:01 51:01 16:01 11:02 03:19 31:01 51:01 05:01 13:01 06:03 29:01 07:05 15:02 11:04 02:02 03:01 39:01 12:03 12:01 02:02 24:02 49:01 07:01 13:02 06:02 02:01 44:05 02:02 15:01 05:02 neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1 29

36 4.4. Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike u programu nesrodne TKMS U Tablici 10 prikazane su tipizacije HLA-A, -B, -DRB1 bolesnika u programu nesrodne TKMS za koje je pronađeno pet ili više mogućih darivatelja u CBMDR-u. Pri tome se radi o darivateljima koji su s bolesnikom HLA podudarni 6/6 i to na niskoj rezoluciji. Tablica 10. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali pet ili više mogućih darivatelja (HLA podudarnost 6/6). Bolesnik Tipizacija HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n B50 01:01 01:01 08:01 08:01 03:01 03: B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 74 B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03:01 47 B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07:01 31 B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10:01 10 B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11:28 8 B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15:01 8 B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11:04 7 B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13:01 6 B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13:02 6 B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01:01 5 B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11:04 5 B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11:01 5 B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01:01 5 B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12:01 5 B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16:01 5 B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11:04 5 n broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru 30

37 Najveći broj HLA podudarnih nesrodnih darivatelja pronađeno je za one bolesnike koji su bili homozigoti ili su barem na jednom kromosomu 6 imali visoko očuvani haplotip HLA-A*01:01- B*08:01-DRB1*03:01. Iz rezultata prikazanih u Tablici 11 vidljivo je da su za 13 bolesnika pronađena 2-4 moguća darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u hrvatskom registru. Tablica 11. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali 2-4 moguća darivatelja (HLA podudarnost 6/6). Bolesnik Tipizacija HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n B17 03:01 02:01 07:02 52:01 13:02 15:02 4 B18 32:01 03:01 07:02 51:01 15:01 01:01 3 B19 24:02 23:01 35:02 49:01 11:01 04:15 3 B20 01:01 02:01 52:01 27:02 15:02 16:01 3 B21 02:01 01:01 44:27 57:01 16:01 07:01 3 B22 03:01 02:01 18:01 07:02 01:01 14:54 2 B23 01:01 02:01 52:01 18:01 15:02 11:04 2 B24 03:01 24:02 35:01 51:01 11:04 01:01 2 B25 01:01 26:01 49:01 38:01 04:04 13:01 2 B26 32:01 03:01 07:02 35:01 04:01 16:01 2 B27 29:02 02:01 44:03 18:01 07:01 11:04 2 B28 25:01 26:01 18:01 38:01 14:01 04:04 2 B29 11:01 24:02 35:01 27:02 01:01 16:01 2 n broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru 31

38 Za ukupno 20 bolesnika pronađen je samo jedan mogući darivatelj HLA podudarnosti 6/6 (niska rezolucija) u hrvatskom registru što je vidljivo iz Tablice 12. Tablica 12. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali jednog mogućeg darivatelja (HLA podudarnost 6/6) Bolesnik Tipizacija HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n B30 02:01 32:01 51:01 35:01 01:01 16:01 1 B31 02:01 24:02 51:01 57:01 16:01 07:01 1 B32 01:01 26:01 08:01 57:01 03:01 11:01 1 B33 33:01 24:02 14:02 44:05 01:02 11:04 1 B34 02:01 11:01 35:01 35:03 13:02 01:03 1 B35 23:01 24:02 44:02 07:02 07:01 15:01 1 B36 01:01 11:01 57:01 35:01 07:01 16:01 1 B37 02:01 26:01 07:02 38:01 04:02 14:54 1 B38 11:01 02:01 18:01 51:01 11:04 13:01 1 B39 02:01 03:01 44:03 39:01 07:01 12:01 1 B40 02:01 26:01 35:08 38:01 16:01 04:02 1 B41 03:01 02:01 07:02 15:01 01:01 07:01 1 B42 02:01 26:01 27:02 38:01 07:01 04:01 1 B43 24:02 23:01 44:02 55:01 13:01 07:01 1 B44 24:02 02:01 40:01 44:03 15:01 07:01 1 B45 01:01 24:02 57:01 51:01 07:01 11:01 1 B46 02:01 03:01 44:05 18:01 15:01 11:04 1 B47 02:01 68:01 07:02 27:02 15:01 16:01 1 B48 01:01 24:02 57:01 35:03 07:01 07:01 1 B49 33:01 24:02 14:02 40:02 01:01 11:01 1 n broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru 32

39 Na temelju podataka prikazanih u Tablicama 10, 11 i 12 vidljivo je da je 50 bolesnika imalo mogućeg darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u CBMDR-u. Preostalih 100 bolesnika nije imalo niti jednog mogućeg darivatelja u našem registru i za njih je trebalo tražiti darivatelja u BMDW-u. S obzirom da BMDW obuhvaća podatke velikog broja registara dobrovoljnih darivatelja, a koji su tipizirani na različitoj rezoluciji, napravili smo dvije različite analize. Naime, pojedini registri tipiziraju svoje darivatelje na niskoj rezoluciji za lokuse HLA-A, -B i -DRB1, dok drugi registri tipizaciju svojih darivatelja rade na srednjoj i visokoj rezoluciji za 4 ili 5 lokusa (HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1). S druge strane, postoji i određeni broj darivatelja tipiziranih serološkim metodama. Rezultati pretraživanja BMDW-a za naše bolesnike prikazani su u Tablici 13. Za ukupno 18 bolesnika pronađeno je deset ili više mogućih darivatelja (HLA podudarnost 10/10) u BMDW-u. 33

40 Tablica 13. Prikaz bolesnika s deset ili više mogućih darivatelja u svjetskom registru (HLA podudarnost 10/10). Bolesnik Tipizacija HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1* n B50 01:01 01:01 08:01 08:01 07:01 07:01 03:01 03:01 02:01 02: B3 01:01 23:01 08:01 44:03 07:01 04:01 03:01 07:01 02:01 02: B2 11:01 01:01 35:01 08:01 04:01 07:01 01:01 03:01 05:01 02: B51 01:01 02:01 08:01 52:01 07:01 12:02 03:01 15:02 02:01 06:01 93 B1 01:01 02:01 08:01 18:01 07:01 07:01 03:01 11:01 02:01 03:01 51 B52 02:01 03:01 07:02 44:02 07:02 05:01 07:01 04:01 02:02 03:01 40 B27 29:02 02:01 44:03 18:01 16:01 07:01 07:01 11:04 02:02 03:01 34 B53 01:01 02:01 08:01 14:01 07:01 08:02 03:01 07:01 02:01 02:02 33 B54 01:01 02:01 08:01 51:01 07:01 01:02 03:01 11:01 02:01 03:01 22 B10 02:01 03:01 35:01 51:01 04:01 14:02 08:01 01:01 04:02 05:01 20 B13 01:01 11:01 08:01 27:05 07:01 02:02 03:01 01:01 02:01 05:01 14 B55 03:01 02:01 07:02 38:01 07:02 12:03 15:01 11:04 06:02 03:01 13 B56 24:02 02:01 51:01 07:02 14:02 07:02 01:01 15:01 05:01 06:02 13 B57 01:01 24:02 57:01 51:01 06:02 15:02 07:01 11:01 03:03 03:01 12 B23 01:01 02:01 52:01 18:01 12:02 07:01 15:02 11:04 06:01 03:01 12 B12 01:01 25:01 08:01 40:02 07:01 02:02 03:01 11:01 02:01 03:01 12 B58 24:02 01:01 18:01 57:01 07:01 06:02 11:04 07:01 03:01 03:03 11 B8 01:01 24:02 08:01 51:01 07:01 14:02 03:01 13:01 02:01 06:03 10 n broj mogućih darivatelja u svjetskom registru 34

41 Usporedba broja nesrodnih darivatelja podudarnih s bolesnikom na 3 lokusa HLA (HLA podudarnost 6/6) u CBMDR-a i BMDW-a prikazana je u Tablici 14. Najveći broj darivatelja pronađenih u oba registra imaju oni bolesnici kod kojih je utvrđeno prisustvo haplotipa: HLA- A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01. Tablica 14. Usporedba broja darivatelja u CBMDR-u HLA podudarnosti 6/6 i broja mogućih darivatelja u BMDW-u Bolesnik Tipizacija HLA-A* HLA-B* HLA-C* n 1 n 2 B50 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11: B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11: B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03: B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07: B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10: B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11: B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15: B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11: B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13: B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13: B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01: B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11: B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11: B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01: B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12: B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16: B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11: n 1 broj darivatelja u hrvatskom registru; n 2 broj mogućih darivatelja u svjetskom registru 35