Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet Preddiplomski studij Biotehnologija

Transcription

1 Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet Preddiplomski studij Biotehnologija Mirna Tadić 6786/BT PROCJENA ZLOUPORABE OPOJNIH DROGA NA TEMELJU ANALIZE OTPADNIH VODA ZAVRŠNI RAD Modul: Tehnologija vode Mentor: Izv. prof. dr. sc. Marin Matošić Zagreb, 2014.

2 DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet Preddiplomski studij Biotehnologija Zavod za prehrambeno-tehnološko inženjerstvo Laboratorij za tehnologiju vode Završni rad PROCJENA ZLOUPORABE OPOJNIH DROGA NA TEMELJU ANALIZE OTPADNIH VODA Mirna Tadić, 6786/BT Sažetak: Analiza otpadnih voda je znanstvena disciplina koja se brzo razvija i pokazuje golem potencijal za praćenje populacijskih trendova u konzumaciji opojnih droga u realnom vremenu. Iako se analiza otpadnih voda donedavno koristila za praćenje utjecaja otpadnih voda iz kućanstava na okoliš, danas se koristi i za procjenu konzumacije opojnih droga u različitim gradovima. Analize se provode u uzorcima komunalne otpadne vode što omogućuje znanstvenicima procjenu količine konzumacije droga u zajednici mjerenjem razina opojnih droga i njihovih metabolita izlučenih u urinu. Cilj ovog rada je prezentirati metodu koja postaje sve važnija u procjeni zlouporabe opojnih droga te najnovije rezultate i trendove na tom području. Ključne riječi: epidemiologija otpadnih voda, opojne droge, LC-MS/MS, urinarni metaboliti, konzumacija Rad sadrži: 23 stranice, 16 slika, 15 literaturnih navoda Jezik izvornika: hrvatski Rad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjižnica Prehrambenobiotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb Mentor: Izv. prof. dr. sc. Marin Matošić Pomoć pri izradi: Dr. sc. Senka Terzić, znanstveni savjetnik na Institutu Ruđer Bošković Rad predan: rujna 2014.

3 BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Faculty of Food Technology and Biotechnology Undergraduate studies Biotechnology Department of Food Engineering Laboratory for Water Technology Final work ASSESSMENT OF ILLICIT DRUG USE BASED ON WASTEWATER ANALYSIS Mirna Tadić, 6786/BT Abstract: Wastewater analysis is a rapidly developing scientific discipline with the huge potential for monitoring real-time population-level trends in illicit drug use. Until recently used to monitor the environment impact of liquid household waste, the method today is also used to estimate illicit drug consumption in different cities. Analyses are being done on municipal sewage samples which allows scientists to estimate the quantity of drugs consumed in a community by measuring the levels of illicit drugs and their metabolites excreted in urine. The aim of this paper is to present this new method that's becoming very important in the assessment of illicit drug use and the newest results and trends in that area. Keywords: sewage epidemiology, illicit drugs, LC-MS/MS, urinary metabolites, consumption Thesis contains: 23 pages, 16 figures, 15 references Original in: Croatian Final work in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb Mentor: PhD Marin Matošić, Associate Professor Technical support and assisstance: PhD Senka Terzić, Scientific Adviser at Rudjer Boskovic Institute Thesis delivered: September 2014

4 SADRŽAJ 1. UVOD PROCJENA ZLOUPORABE OPOJNIH DROGA Epidemiologija otpadnih voda Uzimanje uzoraka i analiza urinarnih biomarkera Uzimanje uzoraka Odabir urinarnih biomarkera Analiza urinarnih biomarkera Proračun i procjena količine konzumirane droge Rezultati dosadašnjih istraživanja godina Najvažniji rezultati godina Najvažniji rezultati s osvrtom na situaciju u Zagrebu godina Najvažniji rezultati s osvrtom na situaciju u Zagrebu Budući izazovi Izvori nesigurnosti Zakonska i etička pitanja Novi projekti ZAKLJUČAK 21 POPIS LITERATURE. 22

5 1 1. UVOD U radu se prikazuje nastanak analize otpadnih voda kao nove znanstvene discipline koja omogućuje praćenje trendova u korištenju opojnih droga. Također, upućuje se na njene pozitivne i negativne aspekte kao i golem razvojni potencijal. U radu je dat i poseban osvrt na rezultate mjerenja analize otpadnih voda u Zagrebu te drugim velikim gradovima Europe. Zasad se ta mjerenja najčešće odnose na količine kokaina, heroina, amfetamina, metamfetamina, ecstasyja i kanabisa. Isto tako, istaknuta je potreba za stvaranjem redovitog i stalnog sustava praćenja količine droga u otpadnim vodama kako bi se na vrijeme mogle uočiti promjene u trendovima zlouporabe te izraditi odgovarajuće strategije za suočavanje s navedenim problemom.

6 2 2. PROCJENA ZLOUPORABE OPOJNIH DROGA 2.1. Epidemiologija otpadnih voda Potrošnja droga u nekoj zajednici (Terzić, 2010) prati se pomoću sociološkoepidemioloških podataka i policijskih podataka. Nedostaci sociološko-epidemioloških podataka su: 1. vremenski razmak (slika bi trebala odražavati trenutno stanje) 2. nedovoljno česti upitnici koji nisu uvijek standardizirani 3. pitanje objektivnosti Nedostaci policijskih podataka su: 1. postoje varijacije u zapljeni po godinama 2. upitna je efikasnost policije (količina zapljene ne mora nužno reflektirati pravo stanje) Zbog tih nedostataka razvila se ideja o inovativnom pristupu analizi otpadnih voda kod koje je moguće: 1. postići objektivnost 2. pratiti promjene u realnom vremenu 3. imati pouzdani uvid u trendove potrošnje droga Droge prolaze kroz krvotok konzumenata, izlučuju se iz organizma putem urina (i fekalija) nepromijenjene ili u obliku jednog ili više metabolita i potom dospijevaju u kanalizaciju gdje se sakupljaju na uređaj za obradu otpadnih voda. Uzorci se obično uzimaju na ulazu u uređaj za obradu otpadnih voda kao satno proporcionalni kompozitni uzorci. Kod prikupljanja uzoraka važno je postaviti pitanje gdje i kako se uzimaju jer o tome ovisi kvaliteta dobivenih informacija. Osim svladavanja različitih tehničkih problema poput dobivanja raznih dozvola, zahtjevna je i organizacija uzorkovanja i transporta uzoraka. Ukoliko se odvija redoviti monitoring, potrebno je prikupiti uzorke svaki drugi tjedan dva puta tjedno (radni dan i vikend). Prilikom pripreme uzoraka, ali i kod instrumentalne analize koriste se state of the art analitičke tehnike. Razvoj prve analitičke metode odvio se godine kada je napravljena prva studija. Metoda se temelji na mjerenju razgradnih produkata ilegalnih supstanci koje se izlučuju u urinu konzumenata i prenose kanalizacijskim sustavom u pogone za zbrinjavanje otpadnih voda. Kad se uzmu u obzir farmaceutska proizvodnja, metabolički procesi i utjecaj okolnosti na ispuštene proizvode, količina droga i njihovih metabolita (koji su ušli u sustav) mogu biti pokazatelji količine konzumiranja.

7 Uzimanje uzoraka i analiza urinarnih biomarkera Uzimanje uzoraka Kompozitni uzorci netretirane otpadne vode se prikupljaju na (centralnom) uređaju za pročišćavanje otpadnih voda kroz određeni vremenski period. Kompozitni uzorak je mješavina pojedinačnih uzoraka otpadne vode ili pročišćene otpadne vode, uzetih u određenom vremenskom intervalu. Frekvencija hvatanja pojedinačnih uzoraka od kojih se priprema kompozitni uzorak zavisi od protoka otpadnih i pročišćenih otpadnih voda. Kompozitni uzorak je proporcionalan vremenu i protoku. Uzorci se prikupljaju ručno ili pomoću automatskog uređaja Odabir urinarnih biomarkera Droge se nakon konzumacije izlučuju iz organizma nepromijenjene ili u obliku jednog ili više metabolita te dospijevaju u komunalne otpadne vode. Većina dosadašnjih istraživanja uključivala je analizu odabranih biomarkera kokaina, heroina, amfetamina, metamfetamina, ecstasyja i kanabisa. Za procjenu potrošnje kokaina kao urinarni biomarker koristi se njegov glavni metabolit benzoilekognin (Slika 1). Slika 1: Metabolizam i urinarna ekskrecija kokaina (Castiglioni, 2011)

8 4 Za procjenu potrošnje heroina se kao urinarni biomarker koristi njegov glavni, ali ne i ekskluzivni metabolit morfij, dok se kao provjera koristi 6-acetilmorfij (mali, ali ekskluzivni metabolit, Slika 2) Slika 2: Metabolizam i urinarna ekskrecija heroina (Castiglioni, 2011) Prilikom procjene potrošnje kanabisa kao urinarni biomarker koristi se 11-nor-9- karboksi-δ9-tetrahidrokanabinol (THC-COOH) glavni metabolit kanabisa (Slika 4). Slika 3: Metabolizam i urinarna ekskrecija THC-a (Castiglioni, 2011)

9 5 Za procjenu potrošnje ecstasyja kao urinarni biomarker koristi se nepromijenjena (parentalna) droga ecstasy (Slika 4). Slika 4: Metabolizam i urinarna ekskrecija ecstasyja (Castiglioni, 2011) Analiza urinarnih biomarkera Kvantitativna analiza odabranih urinarnih biomarkera provodi se pomoću tandemske spektrometrije masa (LC-MS/MS). LC-MS/MS (Cindrić, 2009) predstavlja (dodatnu) mogućnost analize iona u vremenu ili prostoru, s ciljem da se unaprijedi separacija ili izazove dodatna fragmentacija pomoću koje možemo kvalitetnije odrediti strukturu analiziranog iona. Spektrometre masa s analizatorom MS/MS možemo podijeliti u tri skupine: spektrometri masa s jednim analizatorom, kod kojih je teorijski moguća analiza do MS n (FTMS ili stupica iona), spektrometri masa s više analizatora (trostruki kvadrupol, skraćenica QQQ, engl. triple quadrupol, slika 5), analiza moguća do MS 2, te spektrometri masa s dva analizatora, između kojih se nalazi kolizijska ćelija (tzv. hibridni spektrometri masa, npr. Q-TOF), kod kojih je moguća analiza do MS 2. U većini dosadašnjih istraživanja prilikom analize korišten je trostruki kvadrupol.

10 6 Slika 5: Shematski prikaz trostrukog kvadrupola (Cindrić, 2009) 2.3. Proračun i procjena količine konzumirane droge Modificirana formula (Baker, 2013): Količina droge [g/dan] = koncentacija urinarnog biomarkera [ng/dan] x volumni protok [m3/dan] x 100/(100 + stabilnost urinarnog biomarkera [%]) x 100/(100 - sorpcija [%]) x 1/1000 Konzumacija droge [mg/dan/1000 st.] = 1000 x količina droge [g/dan] x 1/ekskrecija glavnog metabolita [%] x molarna masa parentalne droge/molarna masa glavnog metabolita x 1000/populacija ostali izvori glavnog metabolita

11 Rezultati dosadašnjih istraživanja godina U Zagrebu je 21. prosinca godine predstavljen projekt pod nazivom Visokospecifično određivanje zabranjenih opojnih tvari u komunalnoj otpadnoj vodi kao osnova za procjenu trendova u zlouporabi droga na području grada Zagreba (IRB, 2009). Nositelj studije bio je Laboratorij za analitiku i biogeokemiju organskih spojeva Zavoda za istraživanje mora i okoliša Instituta Ruđer Bošković. U sklopu projekta provedeno je sustavno praćenje kokaina, heroina, amfetamina, ecstasyja i kanabisa te metadona i kodeina u neobrađenoj otpadnoj vodi Zagreba. Uzorci otpadne vode prikupljeni su na centralnom uređaju za pročišćavanje otpadnih voda od 09. veljače do 03. rujna godine Najvažniji rezultati (Terzić, 2010): 1. U Zagrebu se godišnje potroši 1000 kg kanabisa, 87 kg heroina i 47 kg kokaina odnosno preračunato na dnevnu potrošnju na 1000 stanovnika, dnevno 3690 mg kanabisa, 305 mg heroina i 166 mg kokaina (Slike 6-8). 2. Amfetaminske droge pokazuju znatno nižu potrošnju (Slika 6). 3. Heroin i kanabis u Zagrebu se konzumiraju redovito i nema razlika u odnosu na dane u tjednu (Slika 6). 4. Stimulativne droge, kokain i amfetamin pokazuju jasan trend povećanja potrošnje tijekom vikenda (Slika 7): kokain za 1,7 puta, a amfetamini za 2,7 puta. Radnim danom dnevno se potroši na 1000 stanovnika mg kokaina, nedjeljama mg. Ecstasyja se pak radnim danima luči ispod 2 mg, a nedjeljama od 2-8 mg na 1000 stanovnika. 5. Usporedba potrošnje droga s drugim europskim gradovima upućuje na mnoge sličnosti, ali i znatne regionalne razlike u intenzitetu potrošnje određenih droga povećanu stopu potrošnje heroina u Zagrebu, dok je stopa potrošnje znatno skupljeg kokaina nešto niža nego u zapadno-europskim gradovima (npr. u Londonu se dnevno troši 7600 mg kanabisa, 206 mg heroina i 690 mg kokaina; u Luganu 6536 mg kanabisa, 97 mg heroina i 622 mg kokaina; u Milanu 3040 mg kanabisa, 70 mg heroina i 909 mg kokaina, Slika 9).

12 8 Slika 6: Prosječna ekskrecija ilegalnih droga i terapeutskih opijata u Zagrebu vikendom i radnim danom (Terzić, 2010) Slika 7: Različita ekskrecija stimulativnih droga u Zagrebu vikendom i radnim danom (Terzić, 2010)

13 9

14 10 Slika 9: Procjena količine konzumirane droge u Milanu, Luganu i Londonu (Zuccato, 2008) godina Primjenom inovativnog pristupa, koji se zasniva na analizi komunalnih otpadnih voda, po prvi put je napravljena izravna usporedba potrošnje droga u 19 europskih gradova. Rezultate tog istraživanja objavio je 26. srpnja godine ugledni znanstveni časopis Science of the Total Environment. Inicijatori istraživanja bili su Norveški institut za istraživanje voda (NIVA) iz Osla i Institut Mario Negri iz Milana, a u njemu je, uz zagrebački Institut Ruđer Bošković, sudjelovalo još 13 znanstvenih institucija iz 11 europskih zemalja (IRB, 2012). Istraživanje je uključivalo analizu odabranih urinarnih biomarkera kokaina, amfetamina, ecstasyja, metamfetamina i kanabisa u neobrađenoj komunalnoj otpadnoj vodi te izračun njihovog dnevnog unosa u kanalizacijski sustav tijekom sedam uzastopnih dana. Usuglašena metodologija uzorkovanja, analize i obrade rezultata omogućila je izravnu usporedbu gradova različite veličine kao što su npr. Zagreb, Barcelona i London Najvažniji rezultati (Thomas, 2012) s osvrtom na situaciju u Zagrebu: 1. Stopa potrošnje svih istraživanih droga u Zagrebu relativno je niska u usporedbi s većinom zapadno-europskih gradova, posebno u odnosu na Antwerpen, Barcelonu, Amsterdam, Eindhoven i Utrecht (Slike 10-11). 2. Ukupna dnevna potrošnja kokaina u Europi procijenjena je na 356 kg, što prema procjeni Ureda Ujedinjenih naroda za droge i kriminalitet (UNODC) predstavlja % ukupne svjetske potrošnje. Stopa potrošnje kokaina znatno je viša u zapadnoj nego

15 11 u sjevernoj i istočnoj Europi. Potrošnja kokaina u Zagrebu znatno je niža nego u većini gradova uključenih u istraživanje (Slike 10-11). 3. Iako je stopa potrošnje amfetamina u Zagrebu višestruko porasla u odnosu na godinu, još uvijek je izrazito niska u odnosu na gradove koje karakterizira visoka potrošnja te stimulativne droge. Primjerice u Amsterdamu je potrošnja amfetamina 25 puta veća nego u Zagrebu (Slika 11). 4. Potrošnja metamfetamina neravnomjerno je raspoređena, a prednjače gradovi sjeverne Europe: Oslo, Helsinki i Turku. Potrošnja metamfetamina u tim je gradovima tridesetak puta veća nego u većini ostalih gradova, uključujući i Zagreb (Slika 11). 5. Najveća potrošnja kanabisa zabilježena je u nizozemskim i španjolskim gradovima, dok je u Zagrebu slična onoj u Milanu (Slike 10-11). Slika 10: Dnevne varijacije u konzumaciji kokaina i ecstasyja (Thomas, 2012)

16 12

17 godina 27. svibnja godine u uglednom časopisu Addiction objavljeni su rezultati dosad najvećeg europskog istraživanja zlouporabe ilegalnih droga na temelju analize otpadnih voda (Ort, 2014). Glavni cilj istraživanja bio je načiniti procjenu regionalnih razlika i vremenske promjenjivosti potrošnje ilegalnih droga u velikim europskim gradovima (IRB, 2014). Istraživanje je uključivalo analizu odabranih urinarnih biomarkera kokaina, amfetamina, MDMA-a (ecstasyja), metamfetamina i kanabisa u neobrađenoj komunalnoj otpadnoj vodi 41 europskog grada, uključujući i Zagreb, a uzorkovanje je provedeno tijekom dvaju sedmodnevnih razdoblja u travnju i ožujku godine. Uzorkovanje u travnju obuhvatilo je 23 grada u 11 zemalja, uzorkovanje u ožujku grada u 21 zemlji Najvažniji rezultati (Ort, 2014) s osvrtom na situaciju u Zagrebu: 1. Uočena je izrazita regionalna raznolikost intenziteta potrošnje pojedinih tipova droga (Slike 12-16). 2. Prosječna stopa potrošnje svih pet istraživanih droga u Zagrebu niža je od ukupne prosječne stope potrošnje svih gradova uključenih u istraživanje (Slike 12-16). 3. Stopa potrošnje kokaina izrazito je viša u zapadnoj nego u sjevernoj i istočnoj Europi (Slika 12). Potrošnja kokaina u Zagrebu znatno je niža nego u zapadno-europskim gradovima, ali pokazuje trend porasta u odnosu na godinu. 4. U pojedinim su gradovima uočene značajne međugodišnje varijacije u potrošnji pojedinih droga, dok ta varijabilnost nije dokazana na razini ukupne prosječne stope potrošnje svih gradova. U Zagrebu je uočen statistički značajan porast stope potrošnje MDMA-a (Slika 15) i kanabisa (Slika 16) u u odnosu na godinu. 5. Potrošnja metamfetamina neravnomjerno je raspoređena, a prednjače gradovi istočne Njemačke, sjeverne Europe, Slovačke i Češke (Slika 14). Potrošnja metamfetamina u tim gradovima višestruko je viša nego u većini ostalih gradova. Potrošnja metamfetamina u Zagrebu za sada je vrlo niska.

18 14

19 15

20 16

21 17

22 18

23 Budući izazovi Izvori nesigurnosti Iako procjena zlouporabe opojnih droga na temelju analize otpadnih voda djeluje zanimljivo, takav pristup je povezan s velikim brojem nesigurnosti. Postoje različiti faktori (dob, spol, tjelesna masa, rad bubrega i jetre, međusobno djelovanje različitih droga, povijest uporabe droga, genetska varijabilnost) koji mogu imati važan, ali trenutno slabo razumljiv utjecaj na rezultate i njihovo značenje (EMCDDA, 2008). Pored toga, izvori nesigurnosti (Castiglioni, 2013) prisutni su i unutar same metode, a odnose se na: uzorkovanje netretirane otpadne vode, stabilnost urinarnih biomarkera u otpadnoj vodi, pouzdanost analitičkih mjerenja, proračun (procjenu količine konzumirane droge) i procjenu veličine populacije. Spomenuti problemi su zanimljivi pa je potrebno dalje istraživati kako bi se omogućilo bolje razumijevanje korisnosti ovog pristupa i bolja interpretacija rezultata Zakonska i etička pitanja Sa stajališta etičnosti i zakona (EMCDDA, 2008) pojavljuju se mnoge poteškoće vezane uz novi pristup ako se dobiveni rezultati koriste za izvan znanstvene svrhe. Općenito je potrebno da standardni postupci istraživanja osiguraju garanciju anonimnosti pa bi isti etički standardi trebali biti uporabljeni i kod uzimanja uzoraka iz otpadnih voda. Presudna razlika je ta što se uzorak otpadne vode može prikupiti bez suglasnosti korisnika. Stoga je potrebno jasnije odrediti postojeće zakonske odredbe koje se odnose na postupak prikupljanja uzoraka.

24 Novi projekti Pokretanje redovitog i sustavnog praćenja koncentracija droga u otpadnim vodama na nacionalnoj i europskoj razini imalo bi izuzetnu važnost za pravodobno uočavanje eventualnih promjena u trendovima zlouporabe droga u realnom vremenu (IRB, 2012). Takav pristup stvorio bi dodatnu osnovu za donošenje planova prevencije te za praćenje učinkovitosti već postojećih preventivnih ili represivnih mjera vezanih uz ovu problematiku. Na tom tragu je sredinom srpnja ove godine najavljen projekt znanstvenika s Instituta Ruđer Bošković: Analiza komunalnih otpadnih voda - inovativni pristup za praćenje trendova u zlouporabi droga u sklopu kojeg će biti proveden jednogodišnji monitoring urinarnih biomarkera droga na centralnom uređaju za pročišćavanje otpadnih voda (IRB, 2014). Na temelju tog monitoringa bit će napravljena procjena potrošnje nekoliko najvažnijih tipova droga, a dobiveni rezultati usporedit će se s onima od prošlih godina kao i s postojećim epidemiološkim i policijskim podacima.

25 21 3. ZAKLJUČAK Konvencionalne metode koje su do sada upotrebljavane kao podloga za donošenje nacionalne politike o prevenciji droga uključuju podatke o zapljenama, broju liječenih ovisnika te nacionalne upitnike o navikama u potrošnji droga. Za razliku od podataka dobivenih anketama, koji podliježu subjektivnosti ispitanika, mjerenja u otpadnim vodama predstavljaju objektivna, izravno usporediva kemijska mjerenja. Posebnu prednost novom pristupu daje usuglašena metodologija uzorkovanja, analize i obrade rezultata što omogućava izravnu usporedbu stope potrošnje droga u zemljama i gradovima različite veličine (IRB, 2014). Do sada objavljene studije predstavljaju značajan korak u daljnjoj afirmaciji analize otpadnih voda kao komplementarnog izvora podataka za proučavanje problema zloupotrebe i ovisnosti o drogama. Također, važno je spomenuti da je Republika Hrvatska od samih početaka uključena u navedene studije kroz djelatnost Instituta Ruđer Bošković.

26 22 POPIS LITERATURE Baker, D. R., Barron, L., Kasprzyk-Hordern, B. (2013) Illicit and pharmaceutical drug consumption estimated via watewater analysis. Part A: Chemical analysis and drug use estimates. Sci. Total Environ. 487, Castiglioni, S., Bijlsma, L., Covaci, A., Emke, E., Hernandez, F., Reid, M., ort, C., Thomas, K. V., van Nuijs, A. L. N., de Voogt, P., Zuccato, E. (2013) Evaluation of uncertainties associated with the determination of community drug use through the measurement of sewage drug biomarkers. Environ. Sci. Technol. 47, Castiglioni, S., Zuccato, E., Fanelli, R. (2011) Illicit drugs in the environment. Occurrence, analysis and fate using mass spectrometry, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ Cindrić, M., Marković, A., Horvatić, A. (2009) Spregnute tehnike tekućinski kromatograf spektrometar masa: osnove metodologije i primjene. Med. 45, EMCDDA (2008) Assessing illicit drugs in sewage Potential and limitations of a new monitoring approach. Pristupljeno 08. kolovoza IRB (2009) Institut Ruđer Bošković. Pristupljeno 10. kolovoza IRB (2012) Institut Ruđer Bošković. Pristupljeno 10. kolovoza IRB (2014) Institut Ruđer Bošković. Pristupljeno 10. kolovoza Ort, C., van Nuijs A. L. N., Berset, J., Bijlsma, L., Castiglioni, S., Covaci, A., de Voogt, P., Emke E., Fatta-Kassinos, D., Griffiths, P., Hernandez, F., Gonzalez-Marino, I., Grabic, R., Kasprzyk-Hordern, B., Mastroianni, N., Meierjohann, A., Neffau, T., Ostman, M., Pico, Y., Racamonde, I., Reid, M., Slobodnik, J., Terzic, S., Thomaidis, N., Thomas, K. V. (2014) Spatial differencies and temporal changes in illicit drug use in Europe quantified by wastewater analysis. Add. 109,

27 23 Reid, M. J., Harman, C., Grung, M., Thomas, K. V. (2011) The current status of community drug testing via the analysis of drugs and drug metabolites in sewage. Nor. Epidemiol. 21, Senta, I., Krizman, I., Ahel, M., Terzic, S. (2013) Assessment of stability of drug biomarkers in municipal wastewater as a factor influencing the estimation of drug consumption using sewage epidemiology. Sci. Total Environ. 487, Senta, I., Krizman, I., Ahel, M., Terzic, S. (2013) Integrated procedure for multiresidue analysis of dissolved and particulate drugs in municipal wastewater by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 405, Terzic, S., Senta, I., Ahel, M. (2010) Illicit drugs in wastewater of the city of Zagreb (Croatia) - estimation of drug abuse in a transition country. Environ. Pollut. 158, Thomas, K. V., Bijlsma, L., Castiglioni, S., Covaci, A., Emke, E., Grabic, R., Hernandez, F., Karolak, S., Kasprzyk-Hordern, B., Lindberg, R., Lopez de Alda, M. J., Meierjohann, A., Ort, C., Pico, Y., Quintana, J. B., Reid, M., Rieckermann, J., Terzic, S., van Nuijs, A. L. N., de Voogt, P. (2012) Comparing illicit drug use in 19 European cities through sewage analysis. Sci. Total Environ. 432, Zuccato, E., Chiabrando, C., Castiglioni, S., Bagnati, R., Fanelli, R. (2008) Estimating community drug abuse by wastewater analysis. Environ. Health Perspect. 116,