PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM IZOENZIMA U DIJELU PRIRODNIH POPULACIJA BOSNE I HERCEGOVINE I HRVATSKE*

IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 3-4, CXXVII (2003). 135-151 UDK 630* 165 PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM IZOENZIMA U DIJELU PRIRODNIH POPULACIJA BOSNE I HERCEGOVINE I HRVATSKE* ESTIMATE OF THE GENETIC VARIABILITY OF SILVER FIR (Abies alba Mill.) BY ANALYSIS OF ISOENZYMES IN THE PART OF NATURAL POPULATIONS OF BOSNIA AND HERZEGOVINA AND CROATIA Dalibor BALLIAN 1 SAŽETAK: Istraživana je molekularnogenetička varijabilnosti nekih populacija obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini ( Vranića, Meka brda, Gorski kotar - adultna, Gorski kotar - juvenilna, Crni vrh, Čabulja, Orjen). Varijabilnost se istraživala na molekularnoj razini, uz pomoć izoenzima. Dobivena varijabilnost značajna je za daljnje radove na oplemenjivanju obične jele, odnosno u procesu obnove jelovih šuma (pošumljivanje i sjetva sjemena) te za osnivanje banaka i arhiva gena metodama in situ i ex situ. Pomoću izoenzimske analize istraživana je genetička unutarpopulacijska varijabilnost i genetička varijabilnost između populacija, a iz rezultata je vidljivo da su prisutne razlike između istraživanih populacija, posebice između malih izoliranih i velikih populacija. Ključne r ij eči: Abies alba Mill., varijabilnost, izoenzimi Obična je jela {Abies alba Mill.) jedna od najznačajnijih vrsta šumskog drveća s gospodarskog i ekološkog stajališta u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini. U Hrvatskoj su šume obične jele izložene propadanju već niz godina zbog štetnog djelovanja onečišćenja iz atmosfere i pedosfere, posebice u Gorskom kotaru (Tikvić i sur., 1995; Seletković i Tik vi ć, 1996). Za razliku od Hrvatske, zdravstveno se stanje u jelovim šumama Bosne i Hercegovine pogoršava zbog neodgovarajućega gospodarenja, a oštećenja zbog onečišćenja atmosfere mogla su se prije rata uočiti ponegdje uz hrvatsko-bosansku granicu, točnije u Bosanskoj krajini (planina Plješivica) i u mikropodručjima uz velike zagađivače okoliša (termoelektrane, kemijsku industriju, željezare, autoceste, itd.), ali do tada propadanje nije poprimilo veće razmjere. * Doktorska disertacija, skraćeni dio izoenzimskih istraživanja za Šumarski list 1 Dalibor Ballian, Šumarski fakultet u Sarajevu, Zagrebačka 20, 71 000 Sarajevo, BiH 1. UVOD Zbog toga je potrebno proučiti zdrave, neoštećene sastojine jele, razmnožiti ih i osnovati banke i arhive gena s plus stablima, koje bi se osnovale metodama in situ i ex situ, posebice na staništima koja za sada nisu pod utjecajem onečišćenja, a koja ni u budućnosti ne bi bila izložena onečišćenjima (Larsen i Fridrich, 1988; Ulrich, 1989; Larsen i Mekić, 1991; Ducci, 1991). Cilj ovog istraživanja je utvrđivanje molekularnogenetičke varijabilnosti nekih populacija obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini. Osim velikih populacija kao što su one Gorskog kotara, Vraniće i Mekih brda, težište istraživanja bio i na malim populacijama iz submediteranskog područja (Biokova i Orjena), kako bi se ustanovilo kakva je njihova veza s populacijama iz središnjeg dijela prirodnog rasprostiranja u Bosni i Hercegovini i Hrvatskoj, a također jedne uvjetno rečeno panonske populacije (Crni vrh). Uz to utvrdila bi se i djelomična razlika između adultne propadajuće populacije obične jele iz Gorskog kotara i njezine juvenilne generacije koja pokazuje vitalnost. 135

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3-4, CXXVII (2003), 135-151 Ovim istraživanjem učinjen je pokušaj određivanja povezanosti naših populacija i populacija iz srednje i južne Europe, odnosno zemljopisne (klinalne) varijabilnosti u smjeru sjever-jug, stoje registrirano u središnjoj i južnoj Europi. Krajnja je svrha utvrditi postoji li značajna varijabilnost između populacija, što bi bilo važno za gospodarenje u šumama obične jele i u uzgojnim radovima. Obična je jela u posljednjih 13 000 godina bila izložena stalnom dinamičnom kretanju, tj. seobi iz svojih pribježišta na jugu Europe, prema središnjoj, zapadnoj i istočnoj Europi. Te su seobe uzrokovane u velikim klimatskim promjenama, koje su jedan od najvažnijih čimbenika seoba šumskog drveća. Nakon velike glacijacije, koja je trajala oko 100 000 godina, a maksimum dosegla prije 15 000 godina, sve populacije šumskog drveća krenule su u širenje. (Magdefrau i Tijekom studenoga 2000. godine selekcionirana su stabla obične jele na području Hrvatske, u Gorskom kotaru (Šumarija Vrbovsko, Skrad, Fužine, Gerovo) i na Biokovu, te u Bosni i Hercegovini na području Vraniće, Čabulje, Orjena, Mekih brda i Crnog vrha (tablica 1 i karta 1). Pri odabiru populacija vodilo se računa da se odaberu podjednako velike i sa znanstvenog stajališta zanimljive male populacije. Vodilo se računa i o tome da populacije budu iz kontrastnih ekoloških uvjeta, i da po mogućnosti pripadaju različitim fitocenozama i geološkim podlogama. Od populacija Gorskog kotara, za jednu populaciju izabrana su adultna stabla koja su u fazi sušenja, za drugu populaciju uzeta su mlada stabla i pomladak, odnosno juvenilni stadij koji pokazuje vitalnost, a biljke koje su uzete u uzorak rastu u neposrednoj blizini adultnih stabala prve populacije. 1.1. Dinamika populacija obične jele 2. MATERIJAL I METODE RADA 2.1. Izbor i opis terenskih objekata Ehrendorfer, 1997; Sitte i sur., 1998). Najbolji prikaz dinamike seobe obične jele dobiven je pomoću analize polena i zasad uspješno pokazuje na smjerove kretanja obične jele u Europi (Huntley i Birks, 1983). Te su tvrdnje na molekularnoj razini istraživali Bergmann (1991b), Konnert i Bergmann (1995), Longauer (1994) za šire područje Europe, a Hiissendorfer za Švicarsku (1996). Karta 1. Raspored istraživanih populacija Prilikom sabiranja uzoraka za izoenzimska istraživanja vodilo se računa da udaljenost između stabala bude najmanje 50 m, kako bi se isključila mogućnost 136 2.2. Izbor stabala srodstva. Veliku populaciju čini 100 stabala, a malu 50 stabala, s tim što istraživanja nisu uspješno provedena na svim uzorcima.

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3-4, CXXV1I (2003). 135-151 Istraživalo se 9 enzimskih sustava s ukupno 16 gen lokusa, odnosno 42 alela. Postupci maceracije, priprave gela, elektroforeze i bojenja gela bili su prilagođeni primijenjenim enzimskim sustavima (Vallejos, 2.3. Izoenzimi Tablica 2. Enzimski sustavi, E.C. referentni broj, broj lokusa i broj alela 1983; Cheliak i Pitel, 1984; Wendel i Weeden, 1989; Konnert, 1992, 1995, 1999; Thormann i Stephan, 1993; Hiissendorfer i sur., 1995,) (tablica 2). 2.4. Metoda priprave macerata Za maceraciju se rabi PVC ploča s polukuglastim udubljenjima u koja se stavi talka na vrhu manje laboratorijske žlice, i 60 ul ekstrakcijskog pufera (tablica 3) te 4 do 6 svježa pupova. Postupak maceracije izvodi se pomoću staklenog tučka (staklene mješalice). Nakon što se pupovi dobro izmaceriraju, u macerat se stavi po pet komadića filtarpapira da upiju macerat, a za- Tablica 3. Ekstrakcijski puferza pupove (Konnert, 1995) tim se papirići pohrane u male kasete i do uporabe smjeste u ledenicu na -70 C. Gel se pripravlja prema enzimskim sustavima iskorištenim u istraživanju receptima priloženima u tablici 4. Poslije priprave, odnosno kuhanja, gel se izlijeva u šablone određenih dimenzija, prema komorama za Tablica 4. Recepti za gel 2.5. Priprava gela elektoforezu. Pri pripravi treba voditi i računa o gel puferu koji se stavlja u gel, a karakterističan je za svaki gel sustav (tablica 4 ). 2.6. Elektroforeza Pošto se pripravi gel i na njega u pripravljene ureze postave filtarpapiri, gel se stavi u komore. Prije postavljanja gela u komore stavi se elektrodni purer. Pošto se pripravi komora s gelom, pusti se jednosmjerna struja Tablica 5. Recepti za elektrodni pufer i gel pufer čija jačina (A) i napon (V) karakteriziraju svaki gel sustav. Trajanje elektroforeze karakteristično je za svaki enzimski sustav. 137

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3 4, CXXV1I (2003). 135-151 Nakon završetka postupka gel se izreže na onoliko dijelova koliko je potrebno da se učini analiza enzimskih sustava od jednog gel sustava. Reže se posebno konstruiranim rezačima, odnosno specijalnom žicom. Nakon stoje gel izrezan, boji se histološkim bojama prema receptu danome u radu Konnert (1995), za svaki enzimski sustav posebno. 2.7. Očitavanje gelova i statistička obrada podataka Poslije bojenja provodi se analiza zimograma, identificiraju se aleli za svaki gen lokus (Cheliak i Pitel, 1984; Wendel i Weeden, 1989; Konnert, 1992, 1995, 1999) provodi se fotografiranje i eventualno, sušenje gela. Za identifikaciju rabi se ustaljena nomenklatura, tako da brojke 11, 22, 33, 44 označavaju homozigote, a brojke 12, 13, 14, 23, 24, 34 označavaju heterozigote. Podaci se unesu u pripremljeni formular, a kasnije se veličine unesu u računalni program Excel. Zatim se podaci slažu u računalnom programu D-basis, zatim prebace u statistički program SAS (Statistical Analysis Sistem) gdje se obrade. Statističkim programom obrađeni su sljedeći parametri: 1. genetička unutar populacijska varijabilnost stvarna srednja heterizigotnost teoretska heterozigotnost genetička raznolikost diferenciranje unutar populacije 2. genetička varijabilnost između populacija genetička udaljenost genetičko diferenciranje između populacija 3. REZULTATI ISTRAŽIVANJA I DISKUSIJA 3.1. Genetička varijabilnost enzimskih sustava Prema Hiissendorferu i sur. (1995), gen lokus Pgi-A karakteriziraju dva alela, koja se diferenciraju u zoni brze segregacije. U ovom istraživanju nije dobivena visoka polimorfnost, jer gen lokus nije registriran u dvije populacije. Tako se u populaciji Gorskog kotara A i Gorskog kotara J taj gen lokus ponaša kao monomorfan. Inače alel Al ima srednju vrijednost za istraživane populacije 0,0460, a najveću vrijednost u populaciji Vraniće (tablica 6). Slično se ponaša i alel A 2, s tim što je srednja veličina 0,9539. Alel A, u istraživanjima Konnert ibergmanna (1995) nađen je samo u južnim područjima rasprostiranja jele, kao što su južni Karpati i Dinaridi, stoje čini se karakteristično samo za ta područja. U ovom istraživanju nije registriran u populacijama Gorskog kotara, ali je prije registriran na Papuku. Tablica 6. Relativne frekvencije alela za analizirane lokuse (n-broj analiziranih stabala) 138

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski list br. 3-4. CXXV11 (2003). 135-151 dručju Sredozemlja i Sjeverne Amerike. Konnert i Bergmann (1995) u svom istraživanju nalaze veće frekvencije allela BI i B2 samo u Bugarskoj, Gen lokus Pgm-a predstavlja brzu zonu migracije na gelu i može se pojaviti u dvije varijante. Ako se eks- trakcija provodi iz endosperma imamo samo jednostru- ke vrpce na zimogramu. U tom su istraživanju iskori- Gen lokus Pgi-B pokazuje polimorfizam samo u populaciji Vraniće i Orjena, a u drugim je populacijama monomorfan (tablica 6). M. Konnert (1996) nije dobila varijabilnost za taj gen lokus u području južne Njemačke, pa se rezultati dobiveni u ovom istraživanju upućuju na to da je taj gen lokus karakterističan za južne provenijencije i za vrste koje se nalaze u po- 139

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski list br. 3-4. CXXVI1 (2003), 135-151 šteni pupovi, tako da su vrpce dvostruke. Tako ovaj gen lokus kontroliraju dva alela. U ovom je istraživanju za gen lokus Pgm-A registrirana je varijabilnost samo u populacije Mekih brda, koja je dosta južno u odnosu prema drugim istraživanim populacijama. InačejezaalelA, dobivena veličina 0,0069, a za alel A 2 veličina 0,09931 (tablica 6). Konnert (1996) u svom istraživanju gen lokus Pgm-A nije registrirala u populacijama južne Njemačke. Na zimogramu gen lokus Pgm-B označava zonu spore segregacije, koja se ponaša kao i ona lokusa Pgm-A. Gen lokus Pgm-B pokazuje monomernu strukturu. Pgm-B gen lokus u ovom istraživanju pokazuje veliki polimorfizam u svim istraživanim populacijama. Srednja veličina za alel B, iznosi 0,0687, a za alel B2 iznosi 0,9313. Istraživanje pokazuje da se vrijednosti smanjuju od sjeverozapada prema jugoistoku (tablica 6). Konnert ibergmann (1995) alel B, registriraju s većom frekvencijom u području Tatra, Karpata, Dinarida i južne Italije (Kalabrije). Kod gen lokusa Idh-B imamo sporu migracijsku zonu na gelu, koja se intenzivnije boji nego brza zona, i posjeduje pet varijanti jednostrukih vrpci. U ovom su radu iskorištene samo dvije varijante. Srednja veličina za alel Idh-B3 u ovom istraživanju iznosila je 0,6098, a vrijednosti za populacije iznosile su od 0,3696 za populaciju Gorskog kotara A do 0,7500 za populaciju Vraniće (tablica 6). Ako pak ove rezultate usporedimo s rezultatima Longauera (1994) te Brusa ilongauera (1995), vidjet ćemo da alel pokazuje klinalnu varijabilnost, te da se vrijednosti povećavaju od sjeverozapada prema jugoistoku i jugu. Veličina na Karpatima iznosi 0,71 (Moller, 1986), a na jugu Italije, u Kalabriji, iznosi 0,78 (prema Breitenbach-Dorfer i sur., 1992). Breitenbach-Dorfer i sur. (1997) prikazali su rezultate za Austriju i Bavarsku i vrijednosti su iznosile od 0,44 na zapadu do 0,235 na istoku. U radu iz 1993 i 1995 (b) godine M. Konnert je dobila za alel B 3 veće vrijednosti na sjeveru, a za alel B 2 na jugu. U istraživanjima provedenim 1995 (a) dobila je vrijednost od 0,21 do 0,55, a u istraživanjima 1996. iskorištava alele B 2 i B,, s tim što je dobila veće vrijednost alela B 2 na jugu, a za alel B 3 na sjeveru. Moller (1986) za alel B, navodi da se vrijednosti od sjevera prema jugu smanjuju, a za alel B 2 povećavaju, što pokazuje izrazitu klinalnu varijabilnost ta dva alela. Za alel Idh-B 4 dobivena je veličina 0,3902, i on se ponaša suprotno alelu Idh-B 3. Enzimski sustav Mnr je tetramerik (Hiissendorfer i sur., 1995) s dva gen lokusa, s tim što lokus A ima jedan alel, a lokus B tri alela. U ovom istraživanju promatrani su aleli B, i B 3. Gen lokus Mnr-B pokazuje polimorfnost u svim populacijama, izuzevši populaciju Orjena gdje je monomorfan. Inače je srednja veličina alela B, 0,0536, a alela B 2 0,9463 (tablica 6). Općenito može se primijetiti da se vrijednosti za alel BI povećavaju od sjeverozapada prema jugoistoku. Inače, čini se daje karakteristika naših populacija da su predstavljene alelom B, i B 3. M. Konnert (1995a i 1995b) u svom istraživanju registrirala je zastupljenost alela B, u južnoj Njemačkoj, s vrijednošću od 0,00 do 0,19. Prema istraživanjima koja su proveli Konnert i Bergman (1995), alel B, zabilježen je u višim frekvencijama u južnim populacijama (Bugarska, južni Karpati, Makedonija) i u populacijama južne Njemačke, istočne Francuske i zapadne Austrije. Visoke frekvencije alela B 2 registrirane su samo u populacijama južne Italije. U istraživanju M. Konnert (1993,1996) na području Bavarske registrirana je mala varijabilnost toga gen lokusa, ali za alele B, i B 2. U Sloveniji Brus i Longauer (1995) registriraju relativno visoke vrijednost za alel B, u sedam populacija, alongauer (1994) za isti lokus u istočnoj Poljskoj i Ukrajini registrira monomorfizan. Prema istraživanjima Breitenbach-Dorfer i sur., (1997) taj gen lokus pokazuje monomorfizam u više populacija srednje Austrije. Zimogram tog gen lokusa Sdh-A na gelu predočen je samo jednom zonom. Usto u većini populacija obične jele taj gen lokus ne pokazuje varijabilnost. Od istraživanih populacija samo u populacijama Gorskog kotara A, Gorskog kotara J i Biokova nije registriran polimorfizam. Srednja veličina za alel A, iznosi 0,0123, za alel A, iznosi 0,9785 a za A 3 iznosi 0,0091 (tablica 6). Lokus Lap-A pokazuje veliku polimorfnost (tablica 5). Na lokusu Lap-A zanimljiv je alel Lap-A 3, sa srednjom vrijednošću 0,0211, koja je prilično malena u odnosu prema rezultatima dobivenim u Sloveniji (Brus i Longauer 1995). U Češkoj je Longauer (1994) dobio mnogo veću vrijednost, 0,08, u populaciji južnih Karpata registrirana je veličina 0,002, a u Bugarskoj 0,018. Majnartovvicz (1981) u Poljskoj nije registrirao taj alel. U populacijama zapadne Europe taj alel prema istraživanjima Breitenbach-Dorfer i sur. (1992), Breitenbach i Pinsker (1990) te Konnert (1993) doseže visoke vrijednosti, posebice na zapadu Austrije, gdje mu je vrijednost 0,34. Inače alel Lap-A, nije registriran u malim izoliranim populacijama (Biokovo, Meka brda, Orjen i Crni vrh), a u populaciji Gorskog kotara J, registrirana je viša vrijednost, 0,0739, s obzirom na to daje ta populacija dosta zapadno. Iz dobivenih rezultata vidljivo je da postoji klinalna varijabilnost alela Lap-A3 jer se vrijednosti povećavaju od jugoistoka prema sjeverozapadu. U ovom istraživanju srednja veličina alela Lap-A, iznosi 0,0872 (tablica 5).Također je primijećena klinalna varijabilnost, tako da se od sjeverozapada prema jugo- 140

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski list br. 3-4. CXXVII (2003), 135-151 istoku povećava udio alela Lap-A,. Inače u maloj izoliranoj populaciji Crnog vrha evidentirana je veličina 0,2700, što upućuje na to daje u toj populaciji fiksirana visoka vrijednost alela Lap-A,. U populacijama Slovenije Brus ilongauer (1995) dobili su vrijednost od 0,028 do 0,081. Alel Lap-A, nije registriran u populacijama zapadne Europe. Longauer (1994) u svom istraživanju otkriva klinalnu varijabilnost tog alela, čija se vrijednost povećava od sjeverozapada prema jugoistoku. U svom istraživanju Konnert (1993) navodi samo dva alela, A, i A 2, ali sa prilično velikom zastupljenošću. R u e t z i sur. (1996) navode u svom istraživanju čak četiri alela za gen lokus Lap-A, s veličinama za Lap-A, od 0,01 ldo 0,045, Lap-A 2 od 0,212 do 0,316, Lap-A, od 0,318 do 0,462 i Lap-A 4 od 0,263 do 0,342. Gen lokus Lap-B karakterizira visoka polimorfnost i četiri alela. Registrirali sugabehm i M. Konnert (1999) u svom istraživanju vezanome za konzervaciju genetičkih resursa. Alel Lap-B, ima vrijednost 0,0104 u populaciji Orjena do 0,0859 u populaciji Vraniće, a srednja vrijednost za istraživane populacije iznosi 0,0399. Iz toga je vidljivo da za taj alel postoji klinalna varijabilnost i da se vrijednosti smanjuju od sjeverozapada ka jugoistoku. Situacija je s alelom Lap-B 2 takva da smo dobili srednju vrijednost od 0,5169. U literaturi su vrlo oskudni podaci za istraživanja s enzimskim sustavom Fest, pa se dobiveni rezultati ne mogu komparirati. Inače, šest populacija pokazalo se monomorfnima, a varijabilnost je registrirana samo u populacija Gorskog kotara A i Gorskog kotara J. Iz toga proizlazi da je taj gen lokus vjerojatno vezan za populacije iz južne Italije i srednje Europe. Za taj gen lokus Fest-B, kao i za prijašnji, teško je pronaći podatke u literaturi pa je vrlo teška komparacija. Fest-B gen lokus ne pokazuje nikakvo variranje i potpuno je monomorfan. Zimogram gen lokusa Got-A na gelu prikazanje s tri jednostruke vrpce. U ovom istraživanju samo populacije Gorskog kotara A i Gorskog kotara J pokazuju monomorfnost, što je slučaj i s više populacija u Sloveniji (Brus ilongauer, 1995). Srednja veličina za alel A, iznosi 0,0445, za alel A 2 iznosi 0,9437, a za alel A, iznosi 0,0116 (tablica 6). U svojim istraživanjima Longauer (1994) navodi podatak da gen lokus Got-A ne pokazuje nikakvu klinalnu varijabilnost, nego se monomorfizam pojavljuje i u sjevernih i u južnih populacija. Isto je tako vrlo slaba frekvencija alela A koji je registriran samo u južnim Karpatima, a u ovom istraživanju samo u populaciji Biokova nema alela A,. Istraživanja u Bavarskoj koja je provela M. Konnert (1996) pokazuju malu varijabilnost toga gen lokusa, a u istraživanjima iz 1993. ista autorica navodi pojavu monomerika u sjevernim populacijama, te malu varijabilnost u južnima, ali su registrirana samo dva alela, A, i A 2, što su pronašli i M. Breitenbach-Dorfer i sur. (1997). Kao i gen lokus Got-A, i taj je gen lokus Got-B na gelu prikazan s tri jednostruke vrpce. Inače, u istraživanju dvije populacije pokazuju monomernu strukturu, i to Biokova i Čabulje, a u drugih izostaje pojavljivanje alela A,, tako da se on pojavljuje samo u populacijama Mekih brda i Orjena. Srednja veličina u ovom istraživanju dobivena za alel B, iznosi 0,0021, za alel B 2 iznosi 0,9900 a za B 3 iznosi 0,0077 (tablica 6). Prema istraživanjima Konnert i Bergmanna (1995), veći udio alela B, registriranje u Tatrama, južnim Karpatima i u Bugarskoj. Alel B, više je vezan za srednju i zapadnu Europu, a registriran je i na Pirenejima. U istraživanjima provedenim u Sloveniji (Brus i Longauer, 1995) nisu registrirali alel B,, a Longauer (1994) ga je registrirao samo u Poljskoj i u Ukrajini. M. Breitenbach-Dorfer i sur. (1996) u Austriji su registrirali samo dva alela, kao i Konnert (1993) u Njemačkoj. Iz toga proizlazi daje svojstvo pojavljivanja alela B, usko povezano s južnim provenijencijama. Gen lokus Got-C pokazuje izraziti polimorfizam. Zimogram na gelu prikazuje tri dvostruke strukture vrpci, koje predočavaju alele na gen lokusu. U ovom su istraživanju dobivene sljedeće vrijednosti za alele: za alel C, učestalost iznosi 0,1533, za alel C 2 iznosi 0,8149, a za alel C 3 0,0317 (tablica 6). Prema ovim istraživanjima, i prema Molleru (1986), frekvencija alela C, povećava se od zapada prema istoku i jugu. Podaci koje navodi Longauer (1994) također potvrđuju to stajalište, a u svom radu Konnert ibergmann (1995) navode postojanu klimu za taj gen lokus. Konnert (1993) u istraživanjima provedenim u Bavarskoj za alel C, navodi vrijednost 0,15 u južnih provenijencija i 0,09 u sjevernih. I Breitenbach- Dorfer i sur. (1997) u svom radu također potvrđuju te rezultate, tako da se vidi klinalna varijabilnost od zapada prema istoku Austrije. Konnert (1995b) dobila je sličan rezultat za srednju, istočnu i južnu Europu. Alel 6-Pgdh-A, u istraživanim je populacijama Hrvatske i Bosne i Hercegovine imao srednju učestalost 0,0032 (tablica 6). Registriran je samo u dvije populacije, Gorskog kotara A i Orjena, a u ostalim populacijama nije nađen. Zanimljivo je pojavljivanje alela Al u malo izoliranoj populaciji Orjena s veličinom 0,0208, što upućuje na prijašnju vezu te populacije s glavnom zonom rasprostiranja obične jele u Dinaridima. M. Konnert u svom radu iz 1995. navodi frekvenciju za alel A, od 0,11 do 0,56. Za alel 6-Pgdh-A, situacija je sasvim drukčija. Tako je u ovom istraživanju dobivena srednja vrijednost 0,5601. Inače, taj alel pokazuje kli- 141

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3-4, CXXV1I (2003), 135-151 nalnu varijabilnost koja se smanjuje od jugoistoka prema sjeverozapadu, tako da u populaciji Gorskog kotara A iznosi 0,1209. U istraživanjima Konnert (1993, 1996), Longauera (1994) i Brusa i Longauera (1995) nisu ustanovljena tri alela, nego dva, a u ovom istraživanju imamo tri alela. Prema istraživanjima Longauera (1994) i K o n n e r t o v e (1995b), u Europi je ustanovljena izrazita klinalna varijabilnost tog gen lokusa. Vrijednosti se od sjeverozapada prema jugoistoku smanjuju, tako da u Češkoj iznosi 0,583, a u Bugarskoj 0,270. Prema Hiissendorferu i sur. (1995) taj gen lokus u promatranoj migracijskoj zoni na gelu ima četiri trostruke vrpce, stoje ustanovljeno i u ovom istraživanju. Gen lokus 6-Pgdh-B predočava sporu migracijsku zonu izoenzimskog sustava 6-Pgdh. Prema Hiissendorferu i sur. (1995), taj gen lokus ima u sporoj zoni tri jednostruke vrpce. Alel je u ovom istraživanju imao srednju vrijednost 0,0028, stoje prilično mala veličina, a alel 6-Pgdh-B 3 ima srednju vrijednost 0,0916. Inače, alel 6-Pgdh-B, ustanovljenje u populacijama Biokova Gorskog kotara J i Mekih brda, a je alel 6-Pgdh-B, u svim istraživanim populacijama (tablica 6). M. Konnert ibergmann (1995) u svom istraživanju 48 provenijencija, u populaciji iz Bosne (vjerojatno s područja Olova) i Hrvatske (Papuk), registrirali su alel B 3. U istraživanjima koja su proveli Longauer (1994) te Brus ilongauer (1995) ustanovljena su samo dva alela za ovaj gen lokus, koja pokazuju klinalnu varijabilnost, s tim što se vrijednost alela 6-Pgdh-B, povećava od jugoistoka prema sjeverozapadu, a alela 6-Pgdh-B, smanjuje. Za razliku od njih Breitenbach-Dorfer i sur. (1997) u svom istraživanju nalaze tri alela za gen lolus 6-Pgdh-B. Ipak, za taj alel u Europi nije otkrivena znatnija klinalna varijabilnost, nego je karakterističan za svaku populaciju posebno. Pojava enzimskog sustava 6-Pgdh u obične jele kontrolira se s dva lokusa koja je obradila Schroeder (1989). Zato je podjela izoenzimskih varijanti na zimogramu gela kod diploidnog materijala vrlo teška. Radi ocjene genetičke raznolikosti najprije se u svim populacijama izračunava srednji broj alela po lokusu (A/L) te utvrđuju se razlike medu populacijama. To je svojstvo istraživao Hamrick (1989) u različitih biljnih organizama i ustanovio da prosječna veličina za biljni svijet iznosi oko 1,7, za dvosupnice 1,46 (za 74 vrste), a za četinjače 2,29 (za 20 vrsta). Prema Gregoriusu (1980,1983) na to svojstvo utječe i broj individua koje su uzete slučajnim izborom. Tako se prema tom autoru točno ocjenjuju samo aleli s frekvencijom većom od 5,6 % i pri prihvaćenoj vjerojatnosti od 5 %. Iz toga proizlazi da bi za postizanje veće točnosti trebalo povećavati radni uzorak. 3.2. Raznolikost alela U ovom istraživanju dobivena je vrijednost od 1,81 do 2,25 (tablica 7, slika 1). Najveću vrijednost ima populacija Vraniće u središnjoj Bosni, a najmanji broj alela po lokusu nalazimo u populaciji Biokova, koja je mala i poprilično izolirana u odnosu prema drugima populacijama. U istraživanjima u Sloveniji Brus i Longauer (1995) dobili su vrijednosti za prosječan broj alela od 1,8 do 2,0. Konnert (1995a) za područje južne Njemačke navodi podatke za broj alela po lokusu od 1,62 do 1,84. Ista autorica (Konnert, 1995b) navodi podatke za niz europskih populacija, s tim stoje iz njezi- Crni vrh Orjen Meka brda Gorski kotar J Gorski kotar A Vranića Čabulja Biokovo 142 Slika 1. Prosječan broj alela u populaciji

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3 4, CXXVII (2003), 135-151 nih podataka vidljivo postojanje klinalne varijabilnosti po pitanju alela/lokusu (A/L), tako da su vrijednosti od 1,66 u sjeverozapadnim područjima rasprostiranja obične jele do 2,30 u jugoistočnim dijelovima rasprostiranja (Bugarska). Za jednu populaciju iz Bosne isti navode veličinu od 2,08, što odgovara nekoj poziciji u središnjoj Bosni (vjerojatno Gornja Stupčanica, Olovo, materijal iz IUFRO pokusa). Paule i sur. (2002) u svom su radu dobili za Karpate alelne vrijednosti od 2,0 do 2,2. Postotak polimorfnih lokusa iznosi od 62,50 % u populaciji Biokova do 81,25 % u populaciji Vraniće i Mekih brda. To su razmjerno velike vrijednosti, što upućuje na veliku polimorfnost istraživanih populacija. Brus ilongauer (1995) u svom su istraživanju dobili vrijednost od 62,50 % do 81,30 %, stoje praktično ista širina variranja kao u ovom istraživanju. M. Konnert (1995a) u svom istraživanju navodi vrijednosti od 46 % za populacije sjeverne Bavarske do 69 % za populacije južnog Schwarzwalda i Alpa. Prema tome, ovo je istraživanje pokazalo da se naše populacije uklapaju u prethodna istraživanja. Također, ovi rezultati upućuju na veću varijabilnost broja alela kod južnih provenijencija, što je jedan od znakova daje obična jela preživjela posljednje ledeno doba u južnim dijelovima Europe, i da je na svojim seobama prema sjeveru izgubila dio alela. Na to upozoravaju Konnert i Bergmann (1995) u svom istraživanju sa 48 provenijencija obične jele iz Europe. Osim toga, Konnert (1995b) upozorava da na visoku varijabilnost u Bugarskoj utječe i hibridizacija obične jele s grčkom jelom. 3.3. Raznolikost genotipova Uz srednji broj alela po lokusu služi za prikazivanje raznolikosti unutar populacija, kao i između populacija i srednji broj genotipova po lokusu (G/L). U usporedbi s alelskom raznolikošću, mora se obratiti pozornost na to daje broj i količina mogućih genotipova (Gm) veći, a time i broj mogućih klasa, nego kod alela. To ima smisla ako su posrijedi rijetki genotipovi (aleli). S obzirom na to daje broj realiziranih genotipova u jednoj populaciji stvarno veći od broja alela, to pri ocjeni genotipske raznolikosti u odnosu prema alelnoj raznoli- Crni vrh Orjen Meka brda Gorski kotar J Gorski kotar A Vranića Čabulja Biokovo Slika 2. Prosječan broj genotipova u populaciji Tablica 7. Prosječan broj alela u lokusu, postotak polimorfnih lokusa, stvarna heterozigotnost (H sl ) i teoretska heterozigotnost (H lc ) 143

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3-4, CXXVII (2003), 135-151 kosti ima više pogrešaka (Gregorius, 1980, 1983; Hattemer i sur., 1982). U ovom istraživanju vrijednosti su iznosile od 2,25 kod populacije Biokova do 3,12 u populacije Vraniće (tablica 7, slika 2). Ti su rezultati sukladni rezultatima za srednji broj alela po lokusu. 3.4. Heterozigotna raznolikost Vrlo je važno mjerilo genetičke raznolikosti u populaciji heterozigotnost, koja zapravo označava broj heterozigota u populaciji. Prema Borojević (1985), heterozigotnost populacije izračuna se tako da se najprije odredi frekvencija heterozigotnih individua na svakom lokusu, a zatim se izračuna prosjek za sve lokuse. Najveću srednju heterozigotnost gen lokusa pokazuje lokus Lap-B, koja iznosi 0,5069 (tablica 7, slika 3), a najveća je heterozigotnost tog lokusa u populacije Gorskog kotara A i iznosi 0,6111. Slijedi gen lokus Idh-B sa srednjom veličinom 0,4399, a najveća je heterozigotnost tog lokusa u populaciji Biokova i iznosi 0,5306. Gen lokus 6-Pgdh-A na trećemu je mjestu, sa srednjom veličinom 0,4127, a najveća je heterozigotnost u populacije Orjena i iznosi 0,5625. Najmanju heterozigotnost pokazuje gen lokus Pgm-A, sa srednjom veličinom 0,0017, ali je problem stoje gen lokus registriran u populaciji Mekih brda i s malom heterozigotnošću, od 0,0139. Teoretske heterozigotnosti ponašaju se sukladno stvarnima, s tim što su u nekim gen lokusima veće od stvarnih, i obrnuto (tablica 7, slika 3). Prisutne razlike pokazuju odstupanje stvarnog stanja od stanja ravnoteže. Slika 3. Stvarna (H sl ) i teoretska (H te ) heterozigotnost u istraživanim populacijama U ovom istraživanju dobivene su srednje vrijednosti za heterozigotnost od 0,1281 u populaciji Mekih brda, koja je i prilično južno a ipak daje malu veličinu, do 0,1726 u populaciji Vraniće. To su inače prilično male vrijednosti prema onim koje navodi Longauer (1994) u svom istraživanju za južne provenijencije, a koje iznose od 0,188 u Karpatima do 0,2040 u Bugarskoj. U Njemačkoj Konnert (1993) i Henkel i sur. (1997) navode vrijednost heterozigotnosti za južne provenijencije 0,259, a za sjeverne 0,2060, stoje prilično velika heterozigotnost. Gannini i sur. (1994) u svom su istraživanju dobli dosta nisku heterozigotnost, a najveća je bila u adultnih stabala i iznosila je 0,142. Breitenbach- D o r f e r i sur. (1997) navode vrij ednosti za heterozigotnost zapadnih populacija od 0,474, sjevernih od 0,313, a istočnih 0,403. Više istraživača (Hamrick, 1989; Ledig, 1986; Bergmann i sur., 1990) u svojim je radovima ustanovilo da veličina heterozigotnosti izravno utječe na propadanje obične jele u Europi. Tako Larsen (1986) postavlja hipotezu da mala varijabilnost u obične jele uzrokuje njezino propadanje. To se temelji na istraživanjima u zapadnoj Europi, gdje obična jela ima prilično nisku varijabilnost u odnosu prema južnim i istočnim provenijencijama, koje su prilično stabilne i nisu u fazi propadanja. U tim je istočnim populacijama (Ukrajina, Rumunjska) Longauer (1994) ustanovio visoku heterozigotnost. Ipak, glavni su uzrok propadanja obične jele, prema Larsenu (1986), Bergma- 144

D. Ballian: PROCJKNA GENET1ČKH VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE {Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski list hr. 3-4. CXXV11 (2003). 135-151 nnu i sur. (1990) tesilvertownu idoustu (1995) velike klimatske promjene, koje u središnjoj Europi uvjetuju jaki selekcijski pritisak, zatim industrijska zagađenja, prisutni genetički drift kojemu su bile izložene pribježišne populacije prije nego što su se selile na sjever te njihove različitosti koje su nastale na seobenom putu. Osim toga, na heterozigotnost populacija uvelike utječe i tip gospodarenja običnom jelom u određenim područjima, tijekom vremena, stoje usmjeravalo raznolikost u ovom ili onom smjeru. Ova se pak istraživanja teško mogu usporediti s navedenima i moramo ih uzeti s rezervom, jer su iskorišteni različiti enzimski sustavi, a da bi bili usporedivi, trebalo bi unificirati istraživanja s enzimskim sustavima. Isto je tako bilo koje svojstvo vrlo teško vezati uz propadanje obične jele, jer većina istraživanih populacija pripada malim izoliranim populacijama, osim populacija Vraniće, Gorskog kotara A i Gorskog kotara J. Populacije Gorskog kotara su inače u zoni s velikim propadanjem obične jele, a populacija Vraniće ubraja se u populacije koje nisu u fazi propadanja i pokazuje veliku vitalnost. Tako je između tih populacija registrirana razlika u heterozigotnosti od oko 2 %. Henkel i sur. (1997) navode u svom istraživanju vrijednost heterozigotnosti od 0,125 do 0,212, što su prilično visoke vrijednosti za heterozigotnost u području Njemačke. Teoretska heterozigotnost pokazuje nam veličinu heterozigotnosti koja bi trebala biti ako je populacija u stanju ravnoteže (ekvilibrija) prema Hardy Weinbergovu zakonu. Najveću teoretsku heterozigotnost pokazuje populacija Vraniće, sa 0,1846, što je pak veća vrijednost od stvarne heterozigotnosti. Manju pak vrijednost od stvarne pokazuju populacije Gorskog kotara A, Gorskog kotara J i Čabulje, što će pokazati i fiksacijski indeks. Najveća je razlika između stvarne i teoretske heterozigotnosti u populacije Mekih brda (tablica 7), za koju je ustanovljeno i jače odstupanje od Hardy Weinbergove ravnoteže, a karakteristika je te južne populacije vrlo mala heterozigotnost. To je svojstvo kompleksno s obzirom na to da ga grade alelna i genotipska vrijednost, odnosno najbolji je pokazatelj multilokusna raznolikost (v gen ) i gene pool raznolikost (v p ).Tako multilokusna raznolikost (vgen) pokazuje da populacija Vraniće s veličinom 42,59, daje veliku raznolikost u odnosu prema populaciji Biokova s veličinom 18,17, što potvrđuje veliki polimorfizam odnosno veliku raznolikost u populaciji Vraniće. Druge populacije zauzimaju intermedijalne položaje (tablica 8). Multilokusna raznolikost, prema Konnert (1993) za Bavarsku iznosi od 6,91 do 49,87, a u istraživanju 1996 (b) godine vrijednosti su iznosile od 14 do 34. Za Baden VVurttemberg Konnert (1993b) daje vrijednosti od 16,5 do 17,08. Ista autorica u radu iz 1995. navodi vrijednosti za Bavarsku i Baden Wurttemberg od 7,0 do 54. Navedene vrijednosti dobivene za populacije iz južne Njemačke odnose se prema rezultatima ovog istraživanja tako da se dijelom vrijednosti preklapaju, a dijelom su veće vrijednosti. U svom istraživanju M. Konnert (1995b) daje manje vrijednosti multilokusne raznolikosti, pa tako 3.5. Raznolikost Tablica 8. Prikaz različitosti i veličine diferencijacije 3.6. Genetička diferencijacija između populacija Na temelju dobivenih rezultata vidljivo je da među populacijama postoji varijabilnost što potvrđuju rezultati dobiveni % 2 testom. Dobivena varijabilnost izravno utječe na genetičku diferencijaciju među populacijama. Testiranjem gen lokusa j; testom dobivena je međupopulacijska, statistički značajna razlika za sve gen navodi vrijednosti za V gm od 7,4 u Hrvatskoj i 9,7 u Bosni do 54 u južnom Schwarzwaldu, s izuzetkom Bugarske gdje se zbog vjerojatnog utjecaja hibridizacije s Grčkom jelom dobivaju visoke vrijednosti (49,85). Vrijednosti gene pool raznolikosti dobivene su kao harmonijska sredina, a ponašaju se istovjetno kao i multilokusna raznolikost. Vrijednosti iznose od 1,16 u populaciji Biokova do 1,22 u populacije Vraniće. lokuse na razini od 1 % (tabela 9), što pokazuje da postoje statistički značajne razlike između populacija, tj. između istih gen lokusa, a ovisno o populaciji. Inače genetička odstupanja obično variraju u veličini od nula (ako nema alelnih promjena) do beskonačnoga, jer se mogu pojaviti slučajevi s veličinom većom 145

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3 4, CXXVII (2003). 135-151 od jedan, i to ako lokus ponovi više puta svoju kom- tativna mjera genetičkih promjena, odnosno alelnih pletnu alelnu strukturu i ako je evolucija vremenski supstitucija po lokusu (Boroj evic, 1985). trajala dulje. Iz toga proizlazi daje odstupanje kvanti- 3.7. Genotipska odstupanja između populacija Dobivena genetička odstupanja između populacija Gotovo se posve slično ponaša i populacija Gorskog (tablica 10) najveća su između populacija Gorskog ko- kotar J, s tim što ova populacija pokazuje relativno mataraa sjedne strane, i ostalih populacija s druge strane, lo genetičko odstupanje spram populacije Mekih brda. a relativno je malo odstupanje s Gorskim kotarom J. Najveća su genotipska odstupanja između populacija Gorskog kotara A i Vraniće, veličine 0,1863, a zatim udaljenost populacija Gorskog kotara A i Crnog vrha, sa 0.1849. Najmanja vrijednost genetičkog odstupanja iznosi 0,0503, a registrirana je između populacija Vraniće i Čabulje. Iz dobivenih genotipskih odstupanja u ovom istraživanju vidljivo je da su odstupanja relativno velika u usporedbi s onima koje su dobili Brusi Longauer (1995) za Sloveniju, Konnert za Bavarsku (1993) i Baden VVurttemberg (1993b), te Ruetz i sur. (1996) za južnu Njemačku. Razlog tomu treba tražiti u većim udaljenostima između populacija koje su istraživane u ovom radu te u manjoj varijabilnosti između populacija u Sloveniji i Njemačkoj. Mnoge čimbenike koji utječu na genetička odstupanja nismo mogli obuhvatiti, posebice okolišne čimbenike koji djeluju selektivno, pa ostaje neriješeno pitanje testiranja dobivenih rezultata. Alelna odstupanja dobivena između populacija najveća su između populacija Gorskog kotara A i Crnog vrha veličine 0,1255, zatim slijedi populacija Vraniće s veličinom odstupanja 0,1212, te populacije Biokova i Gorskog kotara A sa 0,1184, pa Čabulje i Gorskog kotara A sa 0,1158. to se moglo i očekivati jer su populacije male i izolirane, s relativno malim protokom gena, a populacija Gorskog kotara A pripada velikim populacijama s velikim protokom gena. Relativno su mala odstupanja između populacija Gorskog kotara A i Gorskog kotara J, što se moglo i pretpostaviti. Najmanja vrijednost alelnog odstupanja od 0.0316 registrirana je između populacija Vraniće i Čabulje. Prema rezultatima Konnert i Bergman na 146 3.8. Alelna odstupanja između populacija (1995), taj se rezultat i mogao očekivati s obzirom na to da se populacije Gorskog kotara A i Gorskog kotara J nalaze u introgresivnoj zoni između balkanskih i apeninskih pribježišta, odnosno u zoni hibridizacije jele iz tih dvaju pribježišta. Stoga te populacije i pokazuju veće vrijednosti genetičkog odstupanja u usporedbi s populacijama koje, prema tim autorima, dolaze u čistoj zoni balkanskog pribježišta. Osim toga, može se primijetiti da i između ostalih populacija postoji povećana vrijednost genetičkih odstupanja s obzirom na to da su većinom posrijedi male i izolirane populacije koje su, vjerojatno, opterećene genetičkim driftom.

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski liši br. 3-4, CXXVII (2003). 135-151 3.9. Gene pool diferencijacija Najveću srednju gene pool diferencijaciju unutar populacije (Dj) pokazuje populacija Gorskog kotara A, sa 9,88 %, a najmanju populacija Crnog vrha sa 3,49 %. Srednja je vrijednost Dj 5,34 % i označava međupopulacijsku diferencijaciju (slika 4). Konnert (1993) u svom istraživanju dobila je vrijednosti diferencijacije između gen lokusa od 2,7 % do 13,2 %, a u istraživanju 1995(b) godine vrijednosti su iznosile od 3 % do 7,6 %, dakle nešto su niže nego u ovom istraživanju. Pri istraživanju genetičke varijabilnosti obične jele u Bavarskoj srednja vrijednost Crni vrh Orjen Meka brda Gorski kotar J Gorski kotar A Vranića Čabulja Biokovo Slika 4. Gene pool diferencijacija u populacijama obične jele Konnert (1996b) dobila je srednje vrijednosti genetičke diferencijacije od 3,0 % do 6,4 %, ovisno o populaciji. Ruetz i sur. (1996) u svom su radu dobili veličine od 2,5 % do 5,4 % kad su ispitivali sadni materijal obične jele. Rezultat dobiven u ovom istraživanju pokazuje da od totalnoga genetičkog diverziteta 5,34 % možemo pripisati diferencijaciji između populacija, a ostalih 94,66 % alelnom variranju između jedinki u populaciji. 3.10. Genetička odstupanja (D) prema Gregoriusu (1974) Računanjem genetičkog odstupanja prema Gregoriusu (1974) dobiju se veće vrijednosti (tablica 12) nego prema N e i j u (1978). Najveća su odstupanja između populacije Gorskog kotara A i Crnog vrha s vrijednošću 0,0061, a je najmanja između populacija Orjena i Mekih brda. Vidljivo je da su najveća odstupanja između populacije Gorskog kotara A s jedne strane, i ostalih populacija s druge strane, a slično se ponaša i populacija Gorskog kotara J, s nešto nižim vrijednostima, što se očekivalo prema Lynchu (1994). Konnert (1993b) dobila je za 27 populacija iz Baden Wurttemberga prilično visoke vrijednosti genetičkog odstupanja s prilično velikom statističkom značajnošću (ateriks test), a vrijednosti su iznosile od 147

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) ANALIZOM Šumarski list br. 3-4, CXXVII (2003). 135-151 0,450 do 0,009. U istraživanju s peludi i embrijima iz populacija Bavarske (1996.b) vrijednosti iznose od 0,055 do 0,119. Brus ilongauer (1995) za Sloveniju dobili su prilično niske vrijednosti genetičkog odstupanja, razlog je vjerojatno zemljopisna bliskost istraživanih populacija. Promatra li se srednja genetička raznolikost prema N e i j u (1978) može se zapaziti da je najveća u populacije Vraniće, s vrijednošću 0,185, a najniža u populacije Biokova, s vrijednošću 0,145. Populacije Gorskog kotara A i Gorskog kotara J pokazuju malu unutarpopulacijsku raznolikost. U Henkela i sur. (1997) srednja genetička raznolikost za populacije iznosila je od 1,137-1,297. Iz unutarpopulacijske raznolikosti izračunava se i srednja vrijednost heterozigotnosti (H e ), koja iznosi 0,157, stoje zapravo srednja vrijednost međupopulacijske raznolikosti. Vrijednosti za gen lokuse dane su u tablici 33. U svom radu Konnert (1998) navodi vrijednost heterozigotnosti 0,29 u jelovu i u bukovu staništu. Ukupna raznolikost (H,) istraživanih populacija iznosi 0,169, kao srednja vrijednost diverziteta svih istraživanih gen lokusa, i viša je nego što je navela 1. Analizom 16 izoenzimskih gen lokusa utvrdili smo postojanje statistički značajnih razlika između istraživanih populacija, a utvrđena varijabilnost obične jele klinalnog je karaktera na ovom dijelu rasprostranjenja. 2. Utvrđeno je da gen lokusi Pgi-A, Got-A i Sdh-A, karakterstični za običnu jelu balkanskog pribježišta, a gen lokus Fest-A južno talijansko pribježište, odnosno za srednjoeuropske populacije. Na to upućuju i dobivene genetička odstupanja, koja su najveća između populacija Gorskog kotara (A i J) i ostalih istraživanih populacija obične jele. 3. Između adultne i juvenilne populacije Gorskog kotara (A i J) nisu utvrđene velike razlike, tako da se među tim populacijama praktično ne može govoriti o razlikama, jer su njihova genetička odstupanja vrlo mala. Ipak dobiveni rezultati pokazuju da bi tu trebalo suptilnije prići istraživanjima na molekularnoj razini. 4. Obična jela iz male populacije na Biokovu pokazuje pripadnost vrsti Abies alba, uz malu heterozigotnost, tako da se isključuje pojava bilo kakve nove vrste jele u tom području. 5. Veća vrijednost heterozigotnosti istraživanih populacija spram populacija obične jele iz zapadne Europe pokazuje da istraživane populacije nisu mnogo izgubile od svoga genetičkog potencijala za adaptaciju, jer nisu suviše udaljene od svoga pribježišta. Stoga su te populacije vjerojatno prilično otpornije 148 3.11. Ukupna genetička raznolikost 4. ZAKLJUČCI Konnert (1995b) za Europu, s vrijednošću 0,103. Prema istoj autorici (1998), ukupna raznolikost iznosi od 2,215 do 2,585, ovisnood staništu. Srednja vrijednost gene pool diferencijacije iznosi u ovom istraživanju 5,34 %. Koeficijent genetičke raznolikosti (Gst) istraživanih populacija iznosi 7,34 % prema Neiju. To znači da se razlike medu populacijama mogu objasniti sa 7,34 %, a 92,66 % pripisuje se postojanju individualne alelne varijabilnosti medu populacijama. Konnert (1998) u svom je radu dobila prilično nisku vrijednost genetičke raznolikosti, od 2,51 do 2,71, i to ovisno o tome je li posrijedi jelovo ili bukovo stanište. Breitenbach-Dorfer i sur. (1997) u svom radu navode vrijednost koeficijenta genetičke raznolikosti od 7,3 % za golosjemenjače, a za rod Abies vrijednost od 6,3 %, a autorica je u svom radu dobila vrijednost 7,1 %. od populacija sa zapada, jer posjeduju dovoljno genetičke varijabilnosti. 6. Radi održavanja genskog resursa trebalo bi uspostaviti gušću mrežu banki gena in situ i ex situ, nužnih za održanje genetičke raznolikosti populacija. To znači da bi svaka ekološka niša važna za običnu jelu trebala imati svoju banku gena, s odgovarajućim brojem jedinki, kako bi se očuvala ekološko-fiziološka osobnost populacija. 7. U gospodarenju prirodnim resursima i njihovoj obnovi, prednost uvijek treba dati prirodnoj obnovi, uz stalno praćenje genetičke strukture, kako bi se mogle poduzeti mjere pravodobno za održanje genetičke raznolikosti koja karakterizira svaku populaciju. 8. Buduća istraživanja treba usmjeriti na ostale populacije obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini, te utvrditi optimalan broj jedinki u uzorku. Neprestano treba pratiti gospodarske zahvate na obnovi obične jele te ih usmjeravati na održanje genetičke raznolikosti lokalnih populacija. Uz to trebalo bi provesti čitav niz pokusa s različitim provenijencijama radi istraživanja ekološkofizioloških osobitosti obične jele. 9. Primijenjena metoda daje dobru sliku genetičke strukture populacija, na temelju koje se mogu preporučiti potrebne mjere za održavanje genetičkih resursa u istraživanim populacijama, za razliku od rezultata koji se dobiju morfometrijskim istraživanjima.

D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Ahies tilha Mili.) ANALIZOM... Šumarski list br. 3 4. CXXV1I (2003). 135-151 5. LITERATURA Bergmann, F., 1991: Causes and Consequences of Species Specific Genetic Variation Patterns in European Forest Trees Species: Examples with Norway Spruce and Silver Fir. In: Miiller- Starck, G., Ziehe, M. (ed.): Genetic Variation in European Population of Forest Trees. J.D. Sauerlander's Verlag, Frankfurt, 67-78. Bergmann, F., H. R. Gregorius, J. B. Larsen, 1990: Levels of genetic variation in European silver fir (Abies alba Mill.) are they related to the species decline. Genetica, 82 (1): 1-10. Borojević, K., 1985: Geni i populacija, Novi Sad, str. 545. Breitenbach, M., VV. Pinsker, 1990: Genetic variation in Abies alba. In: Hattemer, H. H., Fineschi, S., Cannata, F., Malvolti, M. E. (ed): Biochemical markers in the population genetics of forest trees. SPB Academic Publishing Bv, Haag, str. 223. Breitenbach-Dorfer, M, W. Pinsker, R. Hacker, F. Miiller, 1992: Clone identification and clinal allozyme variation in populations of Abies alba from the Estern Alps (Austria). Plant Systematics and Evolution, 181: 109-120. Breitenbach-Dorfer, M., M. Konnert, W. Pinsker, F. Starlinger, T. Geburek, 1997: The contact zone between two migration routes of silver fir, Abies alba (Pinaceae), revealed by allozyme studies. Plant Systematics and Evolution, 206: 259-272. Brus, R., R. Longauer, 1995: Nekatere genetske značilnosti jelke (Abies alba Mill.) v Sloveniji, Zbornik gozdarstva in lesarstva, 46: 45-74. Cheliak, W. M., J. A. Pitel, 1984: Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes from forest tree species. Petawawa National Forestry Institute, Canada, 1-49. D u c c i, F., 1991: Morphological variation in silver fir (Abies alba Mill.) seedings from provenances in central and southern Italy. Annali del 'Instituto Sperimentale per la Selvicoltura, publ. 1994, 22: 53-73. Gregorius, H. R., 1980: The probability of losing an allele when diploid genotypes are sampled, Evolution Theory, 6: 143-162. Gregorius, H. R., 1983: Klonanzahl in Samenplantagen und genetische Vielfalt. Arbeitstagung Forum Genetik Wald Forstwirtschaft, Gottingen,58-62. H a m r i c k, J. L., 1989: Isozymes and the Analysis of Genetic Structure in Plant Population. In: Soltis, D.E., Soltis, PS. (ed.): Isozymes in Plant Biology, London.87-105. Hattemer, H. H.,H. R. Gregorius, M. Ziehe, G. Miriler-Starck, 1982: Klonanzahl forstlicher Samenplantagen und genetische Vielfalt, Allgemcine Forst und Jagdzeitung, 153: 183-191. Henkel, W., M. Konnert, B. Hosius, 1997: Genetische Untersuchungcn an der WeiBtanne (Abies alba Mill.) in Thiiringen mit waldbaulichen Konsequenzen. 8 IUFRO Tannensymposium, Sofia, 37-52. Huntley, B., H. J. B. Birks, 1983: An atlas of past and present pollen maps for Europe 0-13000 years ago, Cambridge University Press, Cambridge,73-90. Hussendorfer,E., M. Konnert, F. Bergmann, 1995: Inheritance and linkage of isozyme variants of silver fir (Abies alba Mill.), Forest Genetics, 2 (1): 29-40. Hussendorfer, E., 1996: Untersuchungen iiber die genetische Variation der WeiBtanne (Abies alba Mill.) unter dem Aspekt der in situ Erhaltung genetischer Ressourcen in der Schweiz, disertacija, Zurich, ETH. Konnert, M., 1992: Genetic studies in damaged silver fir (Abies alba) stands in southwest Germany. Freiburg, Germany Mitteilungen der fortstlichen Versuch und forschungsanstalt Baden Wurttemberg, 167: str. 119. Konnert, M., 1993: Genetic variation of silver fir in Bavaria, Allgemeine Forst und Jagdzeitung, 164 (9-10): 162-169. Konnert, M., 1993a: Die genetische Variation der WeiBtanne (Abies alba Mill.) in Baden - Wiirttemberg. In Wolf, H. (ed): WeiBtannenherkiinfte. Ecomed Verlagsgesellschaft, Landsberg am Lech, S., 79-95. Konnert, M., 1993b: Untersuchungen zum EinfluB genetischer Faktoren auf die Schadigung der WeiBtanne, Forstw. Cbl., 112: 20-26. Konnert, M., 1995: Isoenzymunterschungen bei Fichte (Picea abies (L.) Karst.) und WeiBtanne (Abies alba Mill.) - Anleitung zur Trennmethodik und Auswertung der Zymogramme, Teisendorf. Konnert, M., 1995a: Genetische Variation der WeiBtanne (Abies alba Mill.) in Bayern und Baden - Wiirttemberg. Genetik und Waldbau der WeiBtanne, Kolloquium, Freistaat Sachsen, 36-45. Konnert, M., 1995b: Ergebnisse isoenzymatischer Unterschungen bei der WeiBtanne als Entschei- 149

1). Hallian: l'koui-n A dl -.NI I [('kl \' ARU.Mili.N( )S 11 OBIČNE JELE [Abies alba Mill.) ANALIZOM... Šumarski list hr. 3 4. CXXVI1 12003). 135-151 dungshilfen fur forstliche MaBnahmen. 7 IUFRO Tannensymposium, "Okologie und Waldbau der WeiBtanne", Altensteig, 30-43. Konnert, M., 1996: Beeinflussen Nutzungen einzelner Baume die genetische Struktur von Bestanden?DieWald,23: 1284-1291. Konnert, M., 1996b: Genetische Variation derweibtanne (Abies alba Mill.) in Bayern. Mittelungen der Landesanstalt fur Wald und Forstwirtschaft Gotha, 11:71-81. Konnert, M., 1998: Genetische Vielfalt im Wald- Wie erkennen? wie erhalten? Laufener Seminarbeitrage, 53-60. Konnert, M., 1999: Herkunftsuberprufung mit biochemisch-genetischen Metoden. Der Weihnachtsbaum, 5: 4-9. Konnert, M., Bergmann, F. 1995: The geographical distribution of genetic variation of silver fir (Abies alba, Pinaceae) in relation to a migration history. Plant systematics and Evolution, 196 (1-2): 19-30. Larsen, J. B., 1986: Das Tannensterben: Eine neue Hypothese zur Klarung des Hintergrundes dieser ratselhaften Komplexkrankheit der WeiBtanne (Abies alba Mill), Fortwissenschaflitches Centralblatt, Gottingen, 105 (5): 381-396. Larsen, J. B., J. Fridrich, 1988: Growth reactions of different provenances of silver fir (Abies alba) after SG\ fumigation during the winter, European Journal of Forest Patology, 18(3-4): 190-199. Larsen, J. B., F. Mekić, 1991: The geographic variation in European silver fir (Abies alba) gas exchange and needle cast in relation to needle age, growth rate dry matter partitioning and wood density by 15 different-provenances at age 6, SilvaeGenetica, 40(5-6): 118-198. L e d i g, F. T, 1986: Heterozygosity, heterosis, and Fitnes in Outbreeding Plants. In Soule, M. E. (ed.): Conservation Biology, Sinauer Associates, Sunderland, 77-104. Lynch, M., 1994: Evolutionary Genetics of Daphnia. In: Real, A.L. (ed.): Ecological Genetics. Princeton University Press, Princeton, New Yersey, str. 107-128. Longauer, R., 1994: Genetic differentiation and diversity of European silver fir in Eastern part of its natural range. Published 7-IUFRO Tannensymposiums, Baden - Wurttemberg. Magdefrau, K., F. Ehrendorfer, 1997: Botanika, sustavatika, evolucija i geobotanika. Školska knjiga, Zagreb, str. 443. Mejnartowicz, L., 1981: Polymorphism at the LAP and GOT Loci in Abies alba Mill, populations, Bull. De 1 Acad. Pol. des Sciences Series des Sci. Biol., 27 (12): 1063-1070. Mo Her, K., 1986: Genetische Untersuchungen bei der Tanne mit Hilfe von Enzyme Genmarkern. Allgemeine fortzeitung, 97 (3): 60-61. Paule, L., D. Gomory, R. Longauer, D. Krajmerova, 2002: Patterns of genetic diversity distribution in three main Central European montane tree species: Picea abies Karst., Abies alba Mill, and Fagus sylvatica L., J. FOR. SCL, article in press. Ruetz, W. F., M. Konnert, A. Behm, 1996: Sind Waldschaden auch eine Frage der Herkunft?, Der Wald, 14:2-3. Schroeder, S., 1989: Isoenzyme variation in 16 European provenances of silver fir (Abies alba), Freiburg, Mitteilungen des Vereins fur forstliche Standortskunde und Forstpflanzenziichtung, 34: 77-81. Seletković,Z., l.tikvić, 1996: Oštećenost šumskih ekosustava različitih stanišnih prilika u Republici Hrvatskoj. U: Sever, S. (ed.), Zaštita šuma i pridobivanje drva, Šum. fak. Zagreb i Šum. ins. Jastrebarsko, 81-88. Silvertown, J. W., J. L. Doust, 1995: Introduction to plant population biology, Blackwell Science, Reprinted 1995, str 210. Sitte, P., H. Ziegler, F. Ehrendorfer, A. Bresinsky, 1998: Strasburger Lehrbuch der Botanik, Gustav Fischer, Stuttgart-Jena-Lubeck- Ulm. str. 1007. Tikvić, I., Z. Seletković, I. Anić, 1995: Propadanje šuma kao pokazatelj promjene ekoloških uvjeta u atmosferi, Šum. list, Zagreb, 11-12: 361-371. Thormann, R., B. R. Stephan, 1993: Interpretation of isozyme patterns of malate dehydrogenase in Scots pine using two different standing methods, Silvae genetica, 42: 5-8. U r 1 i c h, B., 1989: Effect of acid precipitation on forest ecosystems in Europe, Advances in Enviromental Science, 27: 189-272. Vallej os, C. E., 1983: Enzyme Activity Staining. In: Tanskley, S.D., Orton, T.J. (ed.): Isozymes in Plant Genetics and Breeding (part A). Elsevier, Amsterdam, str. 516. Wendel, J.F., N. F. Weeden, 1989: Visualization and Interpretation of Plant Isoenzymes, (ed.) Soltis, D.E., Soltis, P.S.: Isozymes in Plant Biology, London, 5^45. 150