Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Određivanje farmaceutskih preparata u površinskim vodama metodom HPLC/MS -Master rad- Mentor: Prof. dr Tatjana Anđelković Kandidat: Milena Ivanović Niš, septembar 2013.
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редниброј, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Монографска текстуални / графички мастер рад Милена Ивановић Татјана Анђелковић Одређивање фармацеутских препарата у површинским водама методом ХПЛЦ/МС Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: Српски Енглески Република Србија Србија Година, ГО: 2013. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога) Научнаобласт, НО: Научна дисциплина, НД: 43 стране/ 6 поглавља/ 26 слика и графика/ 7 табела Хемија Хемија животне средине Предметна одредница/кључне речи, ПО: Фармацеутски препарати, женски полни хормони, ХПЛЦ, МС УДК 615.45 + 543.61 + 556.5 + 543.544.5 Чува се, ЧУ: Важна напомена, ВН: Библиотека Експериментални део рада је урађен у лабораторији за хемију животне средине Хемијског факултета Технолошког универзитета у Брну, Чешка Извод, ИЗ: Циљ овог мастер рада је одређивање присуства и количине фармацеутских препарата женских полних хормона из оралних контрацептива, у површинској води. Прикупљени су узорци воде река Саве и Дунава, као две највеће реке које протичу кроз Србију. Конзервирани су чувањем на 4 С. Узорци су транспортовани у стакленим боцама од тамног стакла. Узорци су припремљени техником екстракције на чврстој фази, а затим анализирани методом ХПЛЦ/МС течна хроматографија под високим притиском спрегнута са масеном спектрометријом. Датум прихватањатеме, ДП: 15.01.2013. Датум одбране, ДО: Члановикомисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Monograph textual / graphic university master degree thesis Milena Ivanović Tatjana Anđelković Determination of pharmaceuticals in surface waters by HPLC/MS Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2013 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 43 pages/ 6 chapters/ 26 paintings and prints/ 7 tables (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: Enviromental chemistry Subject/Key words, S/KW: Pharmaceuticals, female hormones, HPLC, MS UC 615.45 + 543.61 + 556.5 + 543.544.5 Holding data, HD: Library Note, N: The experimental part of the thesis was done in Enviromental chemistry lab, in Faculty of Chemistry, Brno University of Techology, Czech Republic. Abstract, AB: The aim of the thesis was determinating female hormones from oral contraceptives in surface waters. The samples were collected from the rivers Sava and Danube and preservated by keeping on 4 С. They were transported in bottles made of dark glass. The samples were prepaired by solid phase extraction and then analyzed by HPLC/MS. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2013. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:
Ovaj master rad je urađen u okviru TEMPUS projekta Modernization of Post-Graduate Studies in Chemistry and Chemistry Related Programmes, u Laboratoriji za hemiju životne sredine, na Hemijskom fakultetu Tehnološkog univerziteta u Brnu, Češka. Zahvaljujem se mentoru, dr Tatjani Anđelković, na pruženoj prilici i ukazanom poverenju, kao i profesoru Jozefu Časlavskom, na savetima i saradnji. Porodici, prijateljima i mom dragom, za svu ljubav, podršku i razumevanje hvala od srca!
Sadržaj: 1. Uvod... 1 2. Teorijski deo... 3 2.1. Fizičko-hemijske osobine vode... 4 2.1.1. Mutnoća vode... 4 2.1.2. Boja vode... 4 2.1.3. Miris i ukus vode... 4 2.1.4. Temperatura vode... 5 2.1.5. Provodljivost, κ... 5 2.1.6. ph vrednost... 5 2.1.7. Rastvoreni kiseonik... 5 2.2. Voda u prirodi... 6 2.3. Zagađivači i zagađujuće supstance površinskih voda... 7 2.4. Farmaceutski preparati kao zagađujuće supstance površinskih voda... 7 2.4.1. Ženski polni hormoni kao zagađujuće supstance i njihova transformacija... 8 2.5. Metode određivanja farmaceutskih preparata u površinskim vodama... 9 2.6. Ekstrakcija na čvrstoj fazi... 9 2.7. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom HPLC... 11 2.8. Masena spektrometrija... 13 2.8.1. Jonski izvori... 14 2.8.2. Maseni analizatori... 15 2.8.3. Detektori... 16 2.8.4. ESI-MS kao tehnika određivanja organskih supstanci... 17 2.8.5. Prednosti i nedostaci ESI-MS tehnike... 19 3. EKSPERIMENTALNI DEO... 21 3.1. Program i metodika eksperimenta... 22 3.2. Eksperimentalni postupak... 22 3.2.1. Uzorkovanje vode... 22 3.2.2. Hemikalije... 23 3.2.3. Pribor... 24 3.3. Tok eksperimenta... 24 3.3.1. Priprema uzoraka... 24
3.3.2. Priprema standardnog rastvora smeše hormona... 26 3.3.3. HPLC-MS analiza... 26 4. REZULTATI I DISKUSIJA... 28 4.1. Prikaz i diskusija rezultata... 29 5. ZAKLJUČAK... 38 6. LITERATURA... 40
1. Uvod 1
Sa povećanjem broja ljudi na Zemlji, rastu i potrebe za pijaćom vodom, pa podzemne rezerve čiste vode odavno nisu dovoljne. Zato je bilo neophodno pristupiti prečišćavanju površinskih voda, naročito reka, u cilju dobijanja pijaće vode. Međutim, reke su najzagađeniji vodeni baseni, u koje se ulivaju nedovoljno prečišćene i otpadne vode iz industrijskih postrojenja i domaćinstava. Zagađujuće supstance u zemljištu i sedimentima se iz istih mogu osloboditi tokom poplava, pa se njihova koncentracija u rekama povećava nakon povlačenja vode u rečna korita. Zagađujuće supstance koje se sve češće nalaze u životnoj sredini su farmaceutski preparati, od kojih se mnogi mogu kupiti bez recepta. Mnogi od njih su izuzetno rastvorljivi, pokazuju visok stepen bioakumulacije, a konvencionalnim metoda prečišćavanja se ne mogu potpuno ukloniti iz vode. Negativan uticaj delovanja farmaceutskih preparata se ogleda u remećenju vodenih ekosistema, dok se kod ljudi javljaju ozbiljni poremećaji, poput endokrine disfunkcije. Nedavna istraživanja su pokazala da ženski polni hormoni iz oralnih kontraceptiva, koji su često prisutni u rečnoj vodi, povećavaju rizik oboljevanja od raka prostate kod muškaraca. Metoda HPLC/MS pruža mogućnost određivanja koncentracija polnih hormona, koje su reda veličine ng/l. U ovom radu je izvršeno određivanje prisustva i količine ženskih polnih hormona u uzorcima reka Sava i Dunav metodom HPLC/MS. Razrađen je postupak ekstrakcije primenom SPE tehnike. Odabrani su hormoni koji se najčešće javljaju u komunalnim i otpadnim vodama, a koji zatim dospevaju do rečnih tokova. To su: estron, estriol, α-estradiol, β-estradiol, etinilestradiol, dietilstilbestrol, progesteron i noretindron. Rezultati pokazuju prisustvo svih ispitivanih hormona u reci Sava, dok hormoni β- estradiol, dietilstilbestrol i estriol nisu detektovani u uzorcima reke Dunav. Koncentracije α- estradiola nizvodno pokazuje tendenciju rasta, dok su koncentracije estrona i progesterona približno ujednačene. 2
2. Teorijski deo 3
2.1. Fizičko-hemijske osobine vode Kvalitet vode uslovljen je u njoj rastvorenim mineralnim i organskim materijama, gasovima, koloidima i suspendovanim česticama. Ocena kvaliteta vode za piće započinje određivanjem fizičkih pokazatelja: mutnoće, prozračnosti, boje, mirisa, ukusa, temperature. 2.1.1. Mutnoća vode Mutnoća vode potiče od suspendovanih i koloidnih čestica u vodi. Može da bude izazvana neorganskim česticama organskim komponentima, proizvodima raspada biljnih i životinjskih organizama. Mutnoća je svojstvena površinskim vodama sa velikom brzinom proticanja. Meri se poređenjem svetlosnih efekata koji se odvijaju prolaskom svetlosti kroz uzorak i kroz standard. Što je veći intenzitet skretanja svetlosti, što je veća interferencija, veća je mutnoća uzorka. Izražava se u nefelometrijskim jedinicama mutnoće i izražava kao sadržaj SiO 2 u vodi (mg/l). Mutnoća daje vodi neprozirnost. Vode koje sadrže zanemarljive količine suspendovanih čestica su prozračne. Voda za piće ne sme da ima mutnoću veću od one koju bi prouzrokovo 10 mg silikatne gline u 1 dm 3 destilovane vode [1]. 2.1.2. Boja vode Boja predstavlja optičko svojstvo vode i spade u organoleptičke karakteristike voda. Boja vode posledica je apsorpcije i refleksije svetlosti određene talasne dužine, bez skretanja talasnih dužina. Boja kao parametar ne spada u toksične parametre, ali se nalazi na EPA (eng. Environmental Protection Agency - Agencija za zaštitu životne sredine) listi sekundarnih (estetskih) parametara i utiče na izgled, a ponekad i na miris vode. Boja vode određuje se i meri kolorimetrijskim metodama i izražava brojem. Boju treba odrediti na licu mesta, nakon uzimanja uzorka, a jedinica boje bazirana je na platina-kobalt (Pt-Co) standardnom rastvoru koji formira žutu boju. Jedan stepen ove skale odgovara sadržaju 2,49 mg kalijumhlorplatinata K 2 [PtCl 6 ] i 2,018 mg kobalt-hlorida CoCl 2 6H 2 O. Prema Pravilniku o higijenskoj ispravnosti vode za piće propisana je maksimalna dopuštena vrednost boje od 5 stepeni kobalt-platinske skale. U vanrednim prilikama ova vrednost ima vrednost od 50 stepeni kobalt-platinske skale [2]. 2.1.3. Miris i ukus vode Miris i ukus prirodne vode potiču od rastvorenih soli, gasova i organskih jedinjenja nastalih procesom životnih aktivnosti vodenih organizama. U zavisnosti od porekla mirisi se dele na prirodne i veštačke. Prirodni mirisi (ribe, mošvare, plesni, truleži) nastaju rezultatom 4
životnih aktivnosti vodenih organizama, a takođe i pri razlaganju organskih materija. Veštački mirisi (fenolni, hlorfenolni i drugi) javljaju se pri zagađenju otpadnim vodama [1]. 2.1.4. Temperatura vode Temperatura vode predstavlja varijabilan parametar. Većina izvora vodosnabdevanja ima određeni opseg kolebanja temperature uslovljen klimatskim uslovima. Najprijatnija temperatura vode za piće kreće se od 7 do 12 o C. Temperatura, osim organoleptičkih osobina, ukazuje i na poreklo vode. Temperatura površinskih voda zavisi od sezonskih i dnevnih kolebanja temperature, kao i od kvantitativnog odnosa atmosferskih i podzemnih voda koje stvaraju površinski tok. Temperatura podzemnih voda je stabilnija i zavisi od klimatskih uslova određene oblasti. U slučaju da ona varira, to je pouzdan znak da se nalazi na relativno maloj dubini. [1]. 2.1.5. Provodljivost, κ Provodljivost, κ, je električno svojstvo vode. Provodljivost zavisi od jona prisutnih u vodi, od koncentracije jona, pokretljivosti i naelektrisanja jona, kao i od temperature na kojoj se određuje provodljivost. Prema Pravilniku o higijenskoj ispravnosti vode za piće propisana je maksimalna dopuštena vrednost provodljivosti (u μs, na 20 C, odnosno 293,15 K) do 1000μS, u vanrednim prilikama do 2500 μs [2]. 2.1.6. ph vrednost ph vrednost je mera relativnog alkaliteta ili aciditeta vode i definiše se kao negativan logaritam koncentracije vodonik-jona: ph= -log [H + ] Prema Pravilniku o higijenskoj ispravnosti vode za piće, propisana ph vrednost je od 6,8-8,5 [2]. 2.1.7. Rastvoreni kiseonik Sadržaj kiseonika u površinskim vodama uslovljan je njegovim dospevanjem iz vazduha. Zavisi od dubine, godišnjeg doba i prisustva mikro i makrorganizama, te od njihovih metaboličkih aktivnosti. Sadržaj kiseonika se smanjuje sa dubinom, zbog smanjenja intenziteta fotosinteze. 5
Sniženje koncentracije rastvorenog kiseonika može da ukaže na zagađenost voda organskim jedinjenjima [1]. 2.2. Voda u prirodi Prema poreklu, prirodne vode se mogu podeliti u tri velike grupe: atmosferske, površinske i podzemne vode. Atmosferska voda dospeva na zemlju u vidu padavina (kiša, sneg, grad). Pored apsorbovanih gasova iz vazduha - kiseonika i ugljen-dioksida, u njoj se može naći i izvesna količina neorganskih i organskih supstanci, što zavisi od sastava okolne atmosfere. Podzemne vode nastaju poniranjem atmosferskih i površinskih voda kroz tlo, pri čemu se, prolazeći kroz različite slojeve zemljine kore, prečišćavaju od mehaničkih primesa, ali pri tom rastvaraju niz soli. Lakorastvorljive soli, kao što su NaCl, NaSO 4, MgSO 4 tom prilikom se lako rastvaraju. Teškorastvorljive soli, karbonati magnezijuma, kalcijuma i gvožđa rastvaraju se zahvaljujući prisustvu CO 2 u vodi. Kao rezultat ovih reakcija obrazuju se bikarbonati. Prisustvo rastvorenih silikata u vodi posledica je dugotrajnog delovanja vode na silikate i aminosilikate (granit, kvarc), u prisustvu organskih kiselina. Ukupan sadržaj soli dostiže vrednosti 1500-2000 mg/l. Površinske vode (reke, jezera, mora, bare) sadrže pretežno nerastvorene mehaničke nečistoće organskog i neorganskog porekla i nešto rastvorenih soli (sa izuzetkom morske vode). Osobine površinskih voda određene su vrstom tla, količinom i osobinama podzemnih i atmosferskih voda, kao i otpadnih (industrijskih i komunalnih) voda. Kako se količina površinskih voda menja tokom godine u znatnim granicama (zbog topljenja snega, učestalih padavina ili sušnih perioda), menjaju se i njene osobine. Rečne vode sadrže relativno malu količinu rastvorenih soli- najviše od 500-600 mg/l, dok vode mora i okeana sadrže znatno više, približno 35 g/l. Specifičnosti hemijskog sastava voda reka, jezera i akumulacija tesno su povezane sa karakteristikama njihovog hidrološkog režima. Za reke je karakteristična neprekidna promena vode, usled čega rečne vode relativno malo isparavaju i prilično slabo deluju na ranije isprano zemljište rečnog korita, ali intenzivno reaguju sa atmosferskim vazduhom. Ovi uslovi opredeljuju sledeće specifičnosti hemijskog sastava rečnih voda: 1. malu mineralizaciju u poređenju sa drugim vodama 2. brzu promenljivost pod uticajem hidrometereoloških uslova 3. često značajan sadržaj organskih materija 4. stalno prisustvo u vodi rastvorenih gasova koji se nalaze u atmosferi i neznatno malu količinu gasova koji se u njoj ne nalaze. 6
Materije nerastvorne u rekama najvećim delom se transportuju u suspenziji. Oko 90% suspendovanog materijala u rekama ima veličinu častica manju od 0,1 mm. Najčešće su mineralnog porekla i one mogu da budu pokrivene organskim materijalom. Ove čestice se talože u mirnim rečnim zonama ili na rečnim deonicama gde je brzina toka ispod 0,1 m/s. Na takvim se mestima nagomilava talog rečnog dna[1]. 2.3. Zagađivači i zagađujuće supstance površinskih voda Zagađujuće supstance dospevaju u površinske vode prirodnim putem usled vulkanskih erupcija, poplava, zemljotresa, šumskih požara i klimatskih promena. Međutim, antropogeni izvori predstavljaju mnogo veću opasnost. Pošto se u reke ulivaju zagađujuće supstance iz nedovoljno prečišćenih industrijskih voda i komunalne vode iz domaćinstava, posebnu pažnju treba obratiti u onim slučajevima gde se rečna voda koristi kao izvor pijaće vode. Sa razvojem industrije veliki problem u zaštiti životne sredine predstavlja prisustvo i drastično povećanje koncentracije sintetskih organskih supstanci u površinskim vodama, naročito u rekama. Ozbiljnu pretnju predstavljaju proizvodi za ličnu higijenu i pesticidi, za koje postoji osnovana sumnja da značajno mogu poremetiti normalno funkcionisanje endokrinih žlezdi, što se dalje manifestuje kroz niz sistemskih poremećaja [3]. Prekomerna upotreba pesticida u poljoprivredi rezultuje njihovom pojavom u rekama usled spiranja tokom kišnih perioda, kao i tokom navodnjavanja. Policiklični aromatični ugljovodonici su zagađujuće supstance, svuda prisutne, a zbog svoje perzistentnosti, toksičnosti, mutagenosti i karcinogenosti zavređuju sve veću pažnju naučne javnosti [4]. 2.4. Farmaceutski preparati kao zagađujuće supstance površinskih voda Poslednjih decenija je velika pažnja usmerena na farmaceutske preparate, kao novu vrstu zagađujućih supstanci životne sredine. Zbog intenzivne, a često i nesmotrene primene u humanoj medicini i veterini, povećane koncentracije farmaceutika u osnovnom, ali i metabolisanom obliku, sve češće se nalaze u površinskim i podzemnim vodama, u priobalnim područjima, pa čak i u pijaćoj vodi. Glavni načini njihovog dospevanja do vodenih sistema su izlivanje komunalnih voda, koje su recipijensi humanih ekskreta [5], kao i neadekvatno skladištenje i uništavanje lekova. Posebna pažnja se mora obratiti u onim slučajevima gde se ovakvi vodeni sistemi koriste kao izvor sirove vode, koja se kasnije prerađuje u vodu za piće. Konvencionalnim metodama prerade se ne postiže značajnije uklanjanje farmaceutskih komponenti koje pokazuju visoku hemijsku stabilnost i rastvorljivost u vodi, a malu biodegradabilnost[6]. 7
Stepen uklanjanja sulfometoksazola (antibiotik), karbamazepina (antiepileptik) i diklofena (analgetik) flokulacijom solima gvožđa i aluminijuma je manji od 20% [7]. Analgetici, antiepileptici, antibiotici, beta-blokatori, glukokortikoidi i polni hormoni mogu izazvati različite fiziološke odgovore akvatičnih organizama, od kojih je najznačajnija endokrina disfunkcija, a pokazuju i visoku sposobnost bioakumulacije. Endokrina disfunkija je sistemski poremećaj i manifestuje se kroz veliki broj zdravstvenih problema, kao što su sterilitet, nepotpuno razviće polnih karakteristika, izmenjena funkcija štitne i nadbubrežne žlezde, veća sklonost ka oboljevanju od određenih vrsta raka. Mora se uzeti u obzir i činjenica da uticaj brojnih lekova, od kojih se mnogi mogu kupiti bez recepta, na endokrini sistem još uvek nije ispitan [3]. 2.4.1. Ženski polni hormoni kao zagađujuće supstance i njihova transformacija Ženski polni hormoni, estrogeni i progestogeni (slika 1), pripadaju grupi steroidnih hormona i svi u svojoj strukturi sadrže ciklopentan-o-perhidrofenantren. To su biološki aktivna jedinjenja, koja se sintetišu iz holesterola, a luče ih jajnici i placenta (kod trudnica). Prirodni estrogeni estron, estriol i estradiol su važni za održavanje pravilne funkcije i zdravlja reproduktivnih organa, kože, mozga. Progestogeni održavaju hormonalnu ravnotežu estrogena. Prirodni estrogeni su slabo isparljiva i hidrofobna jedinjenja, čija je rastvorljivost oko 13 mg/l, dok je kod sintetskih estrogena - etinilestradiola i mestranola, rastvorljivost još manja i iznosi 4.8 mg/l i 0.3 mg/l, respektivno. Polni hormoni podležu metaboličkoj transformaciji u jetri, pri čemu dolazi do njihovog oksidovanja, hidroksilovanja ili metilovanja, pre konačne konjugacije sa glukuronskom kiselinom ili sulfatima. Glukuronidni i sulfatni oblici su biološki neaktivni i kao takvi se izlučuju iz organizma. Međutim, podležu delovanju bakterija, prisutnih u komunalnim i otpadnim vodama, pri čemu dolazi do oslobađanja hormona, u aktivnom, molekulskom obliku. U seriji eksperimenata sa aktivnim muljem, pri aerobnim uslovima, estradiol se oksidovao do estrona, dok dalji degradacioni proizvodi nisu uočeni. Mestranol se brzo eliminiše, dajući male količine etinilestradiola usled demetilovanja. Etiniestradiol pokazuje stabilnost pri aerobnim uslovima, ali se potpuno razlaže pod dejstvom nitrifikujućeg aktivnog mulja, u roku od 6 dana. Ženski polni hormoni iz oralnih kontraceptiva uzrokuju probleme sa reproduktivnim organima i sterilitet kod riba. U rekama Velike Britanije zabeležena je feminizacija i vitelogeneza kod riba muškog pola [8], a mogu izazvati rak prostate kod muškaraca [9]. 8
Estradiol Estriol Estron Etinilestradiol Dietilstilbestrol Progesteron Noretindron Slika 1. Strukturne formule ženskih polnih hormona 2.5. Metode određivanja farmaceutskih preparata u površinskim vodama Termostabilni farmaceutski preparati kiselog karaktera se najčešće određuju metodom gasna hromatografija masena spektrometrija (GC/MS). Imunoreakcije su nova i atraktivna metoda za brzo i osetljivo određivanje farmaceutika, kao što je primena ELISA (eng. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) testa za određivanje diklofenaka [10]. Ali za određivanje mnogih drugih još uvek nema odgovarajućih antitela. Kinetičko-spektrofotometrijske metode hemijske analize pružaju određene mogućnosti za relativno brzo i dovoljno selektivno određivanje niskih koncetracija farmaceutskih komponenti u rastvorima. Uz to, one ne zahtevaju skupu opremu i uglavnom koriste lako dostupne reagense, što ih čini pristupačnim za analizu u laboratorijskim uslovima [11]. Daleko najveću primenu ima metoda tečna hromatografija - masena spektrometrija (LC/MS), sa elektrosprej jonizacijom, sa prethodnom ekstrakcijom na čvrstoj fazi (eng. Solid Phase Extraction SPE). Njome se mogu određivati polarna farmaceutska jedinjenja, njihovi metaboliti ili proizvodi različitih reakcija transformacije, sa granicom detekcije 1 ng/l [6]. 2.6. Ekstrakcija na čvrstoj fazi Ekstrakcija na čvrstoj fazi (engl. solid phase extraction-spe) je jedan od najboljih načina za prečišćavanje i koncentrisanje uzoraka. Još se naziva tečno-čvrsto ekstrakcija ili ekstrakcija na koloni. 9
Suština SPE je dovođenje tečnog ili gasovitog uzorka u kontakt sa čvrstim sorbentom, koji se nalazi u plastičnom kertridžu, gde zatim dolazi do selektivnog vezivanja analita za površinu čvrste faze. Na kraju se vrši eluiranje odgovarajućim rastvaračem, u cilju desorpcije željenog analita i njegove dalje analize. SPE podleže osnovnim hromatografskim principima: sorbent u kertridžu predstavlja stacionarnu, a tečni ili gasoviti uzorak mobilnu fazu. Ranije su kao sorbenti korišćeni ugljenik, magnezijum-silikat (Florisil), celit i jono-izmenjivačke smole. Međutim, sve veća pažnja se danas posvećuje sorbentima na bazi silika-gela, koji se dobijaju reakcijom između silanol-grupa i hloroalkil- ili alkoksialkilsilana. Reakcija sa monofunkcionalnim silanima rezultuje monomernom čvrtom fazom, dok reakcija sa dvofunkcionalnim i trofunkcionalnim silanima može rezultovati monomernom ili polimernom čvrstom fazom, u zavisnosti od uslova reakcije (slika 2): Slika 2. Sorbenti na bazi silika gela: a) nastanak monosloja b) nastanak polimernog sloja Valjanim odabirom kombinacije stacionarne i mobilne faze postiže se vezivanje željenog analita za sorbent, dok ostale komponente uzorka prolaze bez zadržavanja (slika 3). Slika 3. Ekstrakcija na čvrstoj fazi 10
U zavisnosti od tipa interakcije sa analitom, sorbenti su podeljeni u 3 grupe: nepolarne, polarne i jonoizmenjivačke sorbente. Po analogiji sa hromatografijom, SPE se odvija na reversnoj fazi ako je sorbent nepolaran, a rastvarač polaran. Ukoliko je sorbent polaran, a rastvarač nepolaran, ekstrakcija se odvija na normalnoj fazi. Sorbenti mogu biti pakovani u špriceve, napravljene od polimernih, plastičnih materijala ili u Pasterove pipete, pri čemu masa sorbenta može da se kreće od 50 mg do 10 g, a zapremina špriceva od 1 ml do 60 ml. Ekstrakcija na čvrstoj fazi se odvija u 5 koraka: 1) Kvašenje sorbenta: izvodi se rastvaračem koji ima sposobnost solvatisanja ugljovodoničnih lanaca, jer su u suvom stanju oni uvijeni i polegli po površini sorbenta. 2) Kondicioniranje sorbenta: rastvarač ili pufer sličan ispitivanom rastvoru se propušta kroz kertridž. Kod jono-izmenjivačkih sorbenata, potrebno je kondicioniranje vršiti rastvorom koji ima ph pri kome su funkcionalne grupe analita i sorbenta suprotno naelektrisane. 3) Adsorpcija: ispitivani rastvor se propušta kroz kertridž, pri čemu je brzina isticanja kontrolisana. Da bi se obezbedila potpuna retencija analita, izvesne promene u ispitivanom rastvoru mogu biti izvršene, poput promene ph, viskoznosti ili polarnosti. 4) Ispiranje: propuštanjem odgovarajućeg rastvarača kroz kertridž, eventualne interferirajuće supstance se eluiraju, dok analit od interesa ostaje adsorbovan. 5) Eluiranje: primenom odgovarajućeg rastvarača, analit od interesa se desorbuje sa sorbenta i dalje analizira. SPE je široko primenjivana u različitim oblastima: u biohemijskim, farmakološkim i farmakokinetičkim istraživanjima, kontroli kvaliteta vode i hrane, kao i u forenzičkoj analizi [12]. 2.7. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom HPLC Hromatografija (od grčke reči chroma boja i grafein pisati) je zajednički naziv za grupu srodnih laboratorijskih tehnika za razdvajanje i analizu smeša, kao i identifikaciju jedinjenja. Ispitivani uzorak, rastvoren u pokretnoj, mobilnoj fazi, kreće se kroz nepokretnu, stacionarnu fazu, čime se njegove komponente razdvajaju, pa ih je moguće dalje analizirati i određivati, čak iako su veoma slične strukture ili fizičko-hemijskih osobina. Različite komponente uzorka imaju različit afinitet ka stacionarnoj fazi, pa usled interakcija koje se tom prilikom odvijaju, dolazi do usporenog kretanja istih kroz kolonu. Interakcije su elektrostatičke prirode, a razlikuju se dva glavna tipa: - polarne, Van der Valsove sile, koje su posledica dipol-dipol interakcija i uspostavljanja vodoničnih veza između molekula, 11
- nepolarne, Londonove sile, koje se javljaju između nepolarnih molekula. Svaka komponenta se distribuira između dve faze i uspostavlja se dinamička ravnoteža, definisana koeficijentom raspodele, K: 12
Slika 5. Šema HPLC sistema sa gradijentnim eluiranjem Nakon eluiranja, analit dospeva do detektora, koji je povezan sa računarom, a na čijem se ekranu dobija hromatogram. Pošto analiti poseduju različite karakteristike, odgovarajući detektori su usavršeni. Tako se mogu koristiti UV ili fluorescentni detektor, kao i maseni spektrometar. Najbolji rezultati se beleže pri povezivanju više detektora u seriju. 2.8. Masena spektrometrija Masena spektrometrija je analitička metoda koja zbog svoje osetljivosti, brzine i granice detekcije zauzima vodeće mesto među ostalim analitičkim metodama. Primenu je našla u oblastima organske, neorganske, organometalne i analitičke hemije. Maseni spektrometar je analitički instrument koji razdvaja naelektrisane čestise prema odnosu mase i naelektrisanja, a u kome se dešavaju sledeći procesi: - Nastanak jona iz uzorka u jonizacionom izvoru - Razdvajanje jona prema njihovim m/z vrednostima u masenom analizatoru - Fragmentisanje selektovanih jona i analiziranje fragmenata u drugom analizatoru - Detektovanje jona koji nastaju iz poslednjeg analizatora i merenje njihovog intenziteta detektorom koji konvertuje jone u električne signale - Obrađivanje signala iz detektora koji su preneti do računara i kontrolisanje instrumenta kroz povratne informacije. Maseni spektrometar se sastoji od izvora jona, elemenata za ubrzavanje i usmeravanje čestica, analizatora, detektora i vakuum pumpe (slika 6). 13
Slika 6. Blok šema masenog spektrometra 2.8.1. Jonski izvori Jonski izvor je deo masenog spektrometra u kom nastaju joni analiziranih molekula, putem izbijanja elektrona, zahvata elektrona, protonovanja, deprotonovanja ili građenja adukata. Pri tom procesu može doći i do fragmentacije molekula u dva ili više fragmenata, što u ovom delu masenog spektrometra nije poželjno. Jedan deo jona ostaje ceo i u spektru daje signal s najvećom vrednosti mase. Taj jon se naziva molekulski jon i pokazuje molarnu masu molekula. Postoji više načina jonizacije, koji se razlikuju po količini energije koja se predaje molekulu. Razlikuju se metode jake jonizacije (engl. hard method) i metode slabe jonizacije (engl. soft method). Slaba jonizacija omogućava da molekul od interesa bude potpuno netaknut. Metode kojima se predaje više energije, vrše izrazitu frgmentaciju i ne koriste se kod molekula koji se lako raspadaju ili u slučajevima kada je potreban signal molekulskog jona. Prilikom jonizacije je važno razmotriti fizičko-hemijska svojstva analita koji se jonizuje. U tabeli 1. je prikazan izbor jonizacije na osnovu agregatnog stanja uzorka i izvor energije u svakoj metodi. Tabela 1. Metode jonizacije Jonizacija Agregatno stanje uzorka Izvor energije EI Gas Elektroni CI Gas Hemijski agens FI Gas Jako polje FD Tečno, čvrsto Jako polje FAB Tečno Elektroni velike energije ESI Tečno Jako polje MALDI Čvrsto Laser 14
U zavisnosti od vrste izvora energije za jonizaciju razlikuju se sledeće metode jonizacije: - EI (engl. Electron Impact elektronski udar) jonizacija - CI (engl. Chemical ionization) - FD&FI (engl. Field desorption/ionization - desorpcija/jonizacija u jakom polju) - FAB (engl. Fast Atom Bombardment bombardovanje brzim atomima) jonizacija - MALDI (engl. Matrix Assisted Laser Desorption laserska desorpcija sa matriksa) jonizacija - ESI (engl. Electrospray Ionization jonizacija elektrosprejom) ESI metoda je primer kada se izvor jona nalazi na atmosferskom pritisku (API - engl. Atmospheric Pressure Ionization). ESI omogućava maseno-spektralnu analizu velikih i termonestabilnih polarnih molekula i upravo zbog toga je izuzetno pogodna kada se analiziraju biološki molekuli. Pruža mogućnost određivanja analita u niskim koncentracijama i u kompleksnim matriksima, vrlo je pogodna za kuplovanje sa HPLC, a nalazi primenu u organskoj hemiji. 2.8.2. Maseni analizatori Maseni analizator je deo masenog spektrometra, gde se joni razdvajaju na osnovu odnosa mase i naelektrisanja (m/z). Tu dolazi do disocijacije jona indukovane kolizijom (CID - engl. collision induced dissociation). Joni u masenom analizatoru bivaju razdvojeni prema njihovim masama, koje moraju biti determinisane. Fizičko svojstvo koje je mereno masenim analizatorom je m/z vrednost, a ne samo masa m. Postoji više vrsta masenih analizatora koji se razlikuju po tome što koriste statičko ili dinamičko električno ili magnetno polje ili njihovu kombinaciju. MSA (engl. Magnetic Sector Analyzer) - sastoji se od magneta, između čijih polova prolaze joni. Na ulasku i izlasku iz magnetnog sektora nalaze se dve pukotine koje ograničavaju snop jona koji ulaze, odnosno onih koji izlaze iz sektora kako ne bi smetali na detektoru. Pretraživanje po masama se sprovodi menjanjem jačine magnetnog polja. Zbog toga je ova metoda spora, ali odlikuje se vrlo dobrim razlučivanjem. ESA (engl. Electric Sector Analyzer), je sličan magnetnom sektoru, samo što umesto magnetnog polja upotrebljava električno polje, a pretraživanje se obavlja promenom napona na elektrodama. Ova metoda ima vrlo dobro razlučivanje, ali je spora. 15
Q (engl. Quadrupole Analyzer), kvadrupolni analizator se sastoji od četiri valjkaste paralelne elektrode. Joni se propuštaju između četiri elektrode na koje je priključen izvor naizmenične struje. Kroz analizator mogu proći samo određeni joni, a pretraživanje se sprovodi menjanjem frekvencije napona. TOF (engl. Time of Flight Analyzer), ubrzava jone iz jonizatora pomoću homogenog električnog polja. Lakši joni se jače ubrzavaju i prvi dolaze do detektora. Pretraživanje je ostvareno kašnjenjem težih jona iz analizatora. Zbog toga je ova metoda brza, ali ima manje razlučivanje od električnog ili magnetnog sektora. IT (engl. Ion Trap Analyzer), jonski trap je uređaj u kome, pomoću trodimenziomalnog kvadrupolnog polja mogu da se čuvaju i analiziraju joni. Primenom određenog napona, jedan po jedan jon može biti izbačen iz trapa i registrovan na detektoru. Kvadrupolno polje prihvata jone u dve ili tri dimenzije, pa se i jon trap može podeliti u dve grupe, 2D i 3D jon trap. Pokriva veliki opseg masa jona, ima dobru rezoluciju i mogućnost MS 2 i MS n analize. U oblasti ispred jon trapa se nalaze sočiva (engl. gate lens) koja regulišu broj jona u jon trapu. Previše jona u jon trapu prouzrokuje gubitak rezolucije, a premalo jona dovodi do gubitka osetljivosti. Na kvadrupolu postoje ulazna i izlazna kapa (engl. Entrance cap i End cap) i kružne elektrode na koje se dovodi potencijal. Biranjem potencijala vrši se selekcija jona na osnovu masa jona, vremena zadržavanja u trapu, fragmentisanje i izbacivanje. Zahvaljujući dovedenom potencijalu i helijumu joni se nalaze oko centra kvadrupola. Joni se odbijaju jedan od drugog i tako se njihove putanje proširuju u toku vremena. Kako bi se sprečio gubitak jona ovim proširenjem putanje, odnosno da bi se joni kretali po stabilnim orbitama, održava se pritisak gasa helijuma, koji ima ulogu da uklanja višak energije jona analita i da usporava jone. Pri sudaru jona sa molekulima helijuma se ponekad oslobađa dovoljno energije kada dolazi do fragmentacije jona indukovane kolizijom. Jon trap analizator skladišti jone za dati eksperiment ili analizu unutar odabranog opsega vrednosti m/z. m/z odnos je određen naponom, a uređaj zadržava jone u površini oivičenoj elektrodama. Agilent 6320 maseni spektrometar, koji je korišćen u ovom radu, sadrži jon trap maseni analizator. 2.8.3. Detektori Posle ubrizgavanja, joni različitih masa se nalaze u jon trap-u i sada moraju biti analizirani na osnovu svojih masa. Na osnovu masa bivaju izbačeni u detektor, koji konvertuje jone u električni signal, koji se može registrovati na oscilposkopu, pisaču, računaru ili na nekom drugom uređaju. Elekrtični signali se registruju u vidu masenih spektara. S obzirom na veliku količinu podataka i brzinu kojom se oni dobijaju, nemoguće je zamisliti savremenu analizu bez primene računara. Uloga računara je, osim prikupljanja i 16
obrade podataka, i kontrola rada uređaja. Računar takođe snima spektre, primarno ih obrađuje, prepoznaje i izvodi računanje vezano za primenu MS. Računaru su osim podataka iz masene spektrometrije potrebni i podaci iz drugih analitičkih postupaka, zatim dokumentacija, kao i komercijalne i sopstvene biblioteke podataka. 2.8.4. ESI-MS kao tehnika određivanja organskih supstanci Pri ESI tehnici koristi se stvaranje finog aerosola ispitivanog rastvora, sačinjenog od visoko naelektrisanih kapljica u jakom električnom polju. Uzorak se rastvara u polarnom, lako isparljivom rastvaraču i ubrizgava se u kapilaru od nerđajućeg čelika pri brzini od 5 100 μl/min, ali je moguć protok i do 200 µl/min. Na ovu ubrizganu tečnost, u uslovima atmosferskog pritiska, deluje jako električno polje, koje se formira između kapilare i spregnute elektrode, u razlici potencijala od 3-6 kv, na distanci od 0,3-2,0 cm i reda je veličine 10 6 V/m. Pod uticajem ovog polja vrši se nagomilavanje naelektrisanja na površini tečnosti na izlazu iz kapilare. Pri napuštanju kapilare ova tečnost formira visoko naelektrisane kapljice. Uzorak se raspršuje u struji inertnog gasa azota (N 2 ) kako ne bi došlo do rasipanja kapljica (slika 7). Slika 7. Kretanje jona po izlasku iz kapilare U toku procesa dolazi do desolvatacije, smanjenja dimenzija kapi i povećanja broja naelektrisanja po jedinici zapremine. Kada električno polje na površini kapi postane dovoljno snažno, dolazi do desorpcije jona sa površine. Gustina naelektrisanja raste do kritične vrednosti, koja se naziva Rejlijeva (Rayleigh-eva) granica stabilnosti. Kapljice se dele u još manje zbog elektrostatičkog odbijanja i prelaska u aerosol. Ovaj proces je prikazan na slici 8. Desorpcija jona se vrši sa površine kapljice, što rezultuje povećanom osetljivošću za lipofilna jedinjenja, čija je koncentracija na površini veća. To znači da se prilikom analiziranja smeše može desiti da jedinjenja prisutna na površini potpuno maskiraju signal hidrofilnih jedinjenja, koja se nalaze u unutrašnjosti kapljice. 17
Slika 8. Desolvatacija naelektrisanih kapljica u ESI-jonizatoru Kako bi se uklonili poslednji molekuli rastvarača ove kapljice prolaze ili kroz zonu zagrejanog inertnog gasa (N 2 ), ili kroz zagrejanu kapilaru. Sudari čestica sa ovim gasom mogu da obezbede dovoljno energije da dođe i do fragmentacije, koja se naziva in-source fragmentacija, odnosno fragmentacija u samom izvoru. Cilj ovog koraka jeste da desolvatacija bude maksimalna, a fragmentacija minimalna kako bi se povećala osetljivost detekcije za određeni molekulski jon. Dobijeni aerosol se prolaskom kroz zagrejanu kapilaru (temperature od 170 o C do 300 o C) oslobađa ostatka rastvarača i onda se usmerava ka oblasti visokog vakuuma, gde joni iz rastvora prelaze u gasnu fazu i formiraju konstantnu jonsku struju. Nastali joni prolaze kroz skimer koji propušta jone iz središta jonske struje sa pravolinijskom putanjom, a eliminiše neutralne molekule. Skimer je vakuum pregrada između oblasti visokog i oblasti niskog pritiska. Nakon skimera joni prolaze kroz oktapole i dalje se usmeravaju ka masenom analizatoru. U zavisnosti od naelektrisanja jona u rastvoru, pri merenju se mogu upotrebljavati pozitivni ili negativni jonizacioni mod (ESI+ ili ESI ) u cilju dobijanja optimalnih rezultata. Pozitivan mod se koristi ukoliko analit sadrži funkcionalne grupe koje imaju afinitet prema protonu. Negativan mod se koristi kada se analit lako deprotonuje. Stehiometrija jona može biti direktno određena preko njihovih m/z vrednosti. Ukoliko postoje nedoumice u tumačenju spektara, masena spektrometrija visoke rezolucije, zatim MS- MS analiza, i/ili analiza izotopske šeme pikova, dovodi do skoro nedvosmislenog identifikovanja. Relativni udeli (%) pojedinih vrsta u analitu, mogu biti dobijeni direktno preko intenziteta molekulskih pikova. Određeni jon se može izolovati i zadržati u jonskom trapu izbacivanjem svih ostalih jona iz istog. Uvodjenjem He gasa u trap dolazi do sudara i fragmentacije selektovanog jona (slika 9). 18
a) MS analiza b) MS-MS analiza Slika 9. Fragmentacija selektovanog jona Registrovanjem produkata fragmenatcije snima se MS-MS, odnosno MS 2 spektar selektovanog jona. MS-MS koncept se zasniva na analizi koja se vrši u dva stupnja (potrebna su dva analizatora). Pomoću prvog analizatora se izoluje željeni jon (parent jon) i njegovom fragmentacijom dobija se daughter jon. 2.8.5. Prednosti i nedostaci ESI-MS tehnike U idealizovanim situacijama primene ESI-MS, kakve se u praksi retko nalaze, sve informacije potrebne za opis ravnotežnog stanja u rastvoru bivaju sakupljene lako i brzo. ESI-MS dozvoljava dobijanje masenih spektara direktno iz tečnog uzorka, na taj način analizirajući sve ravotežne vrste u nativnoj fazi. Blagi uslovi jonizacije ESI izvora minimizuju fragmentaciju, ostavljajući prisutne molekulske i jonske vrste uglavnom u neizmenjenom obliku. Druga pogodna karakteristika ESI-MS je niska granica detekcije, tako da su koncentracije do 10 6 mol/l pristupačne za ispitivanje, čime je omogućena analiza rastvora čije su koncentracije analita bliske onim uobičajenim u životnoj sredini ili biološkim uzorcima. Relativno mala količina (zapremina) uzorka potrebna za analizu takođe proširuje mogućnosti primene ove metode. Na kvalitet ESI jonizacije utiče veličina kapljice, površinski napon rastvarača, površinsko naelektrisanje, isparljivost rastvarača i jačina solvatacije rastvarača. Velike kapljice sa visokim površinskim naponom, niskom isparljivošću, jakom jonskom solvatacijom, malim površinskim naelektrisanjem i visokom električnom provodljivošću sprečavaju dobru jonizaciju elektrosprejom. 19
Organski rastvarači kao što su metanol, acetonitril i izopropil alkohol su bolji od vode, u slučaju ESI jonizacije zato što čista voda može prouzrokovati električna pražnjenja unutar ESI komore, što dovodi da nestabilnosti signala. Ovo prouzrokuje poteškoću u primeni ESI tehnike, jer većina realnih bioloških uzoraka ili uzoraka iz sistema životne sredine, kao što su vodeni uzorci sa znatnom jonskom jačinom, ne mogu biti analizirani kao takvi putem ESI- MS. Isparljive kiseline i baze je poželjno koristiti, ali prisustvo soli u koncentracijama iznad 10 mm i jakih kiselina i baza treba izbegavati za primenu u ESI izvoru. Prisustvo soli utiče na smanjenje jonske struje tj. na intenzitet tih jona, pa se može desiti da se uopšte ne detektuju. U ispitivanom rastvoru se ne smeju primenjivati visoke koncentracije elektrolita, kako zbog oštećenja ESI izvora, tako i zbog potiskivanja signala analiziranog jona u ESI-MS spektru od strane drugih jonskih vrsta [14]. 20
3. EKSPERIMENTALNI DEO 21
3.1. Program i metodika eksperimenta Cilj ovog master rada je određivanje prisustva i količine ženskih polnih hormona u uzorcima reka Sava i Dunav metodom HPLC/MS. Razrađen je postupak ekstrakcije primenom SPE tehnike. Odabrani su hormoni koji se najčešće javljaju u komunalnim i otpadnim vodama, a koji zatim dospevaju do rečnih tokova. To su: estron, estriol, α-estradiol, β-estradiol, etinilestradiol, dietilstilbestrol, progesteron i noretindron. Program eksperimentalnog dela obuhvata sledeće faze: 1. Uzorkovanje vode 2. Priprema uzoraka 3. Priprema rastvora standardnih smeša ženskih polnih hormona u acetonitrilu 4. Snimanje rastvora standardnih smeša ženskih polnih hormona na HPLC/MS 5. Snimanje uzoraka na HPLC/MS 6. Obrada dobijenih rezultata 3.2. Eksperimentalni postupak 3.2.1. Uzorkovanje vode Prikupljanje uzoraka rečne vode vršeno je na oko 15 cm od površine vode. Otvor boce je okrenut uz tok. Boce u kojima je voda prikupljena su od tamnog stakla, zapremine 2 l, prethodno oprane detedžentom i običnom vodom, pa isprane destilovanom vodom. Uzorkovanje vode je izvršeno u aprilu 2013. na lokacijama navedenim u tabeli 2. i prikazanim na slici 10. Odmah nakon uzorkovanja, određeni su in situ parametri, navedeni u tabeli 2. Reka Dunav, Batajnica Reka Sava, Kapetanija Reka Sava, Makiš Reka Dunav, Vinča Reka Sava, Zabran Slika 10. Mesta uzorkovanja reka Save i Dunava 22
Tabela 2. Lokacije na kojima je izvršeno uzorkovanje Oznaka lokacije Vreme uzorkovanja Mesto uzorkovanja Temperatura Providnost (m) ph vrednost Kiseonik mg/l Zasićenje kiseonikom, % Elektroprovodlj ivost, (μs/cm) 1 13:30 2 12:00 3 09:00 4 10:30 5 15:30 Površinska voda, reka Sava, Zabran (30 km) GPS koordinate: N 44 o 40 06.0 E0 20 o 14 40.0 Površinska voda, reka Sava, Makiš (10 km) GPS koordinate: N 44 o 45 58.0 E0 20 o 21 24.0 Površinska voda, reka Sava, Kapetanija, nizvodno od savskog pristaništa GPS koordinate: N 44 o 49 59.4 E0 20 o 26 72.0 Površinska voda, reka Dunav, Batajnica (1182 km) GPS koordinate: N 44 o 55 21.0 E0 20 o 19 23.0 Površinska voda, reka Dunav, Vinča (1145 km) GPS koordinate: N 44 o 46 09.0 E0 20 o 37 30.0 8.2 0.75 8.48 11.30 97.4 306 8.5 0.75 8.41 10.90 95.6 308 8.1 0.65 8.44 11.20 97.0 310 7.1 0.75 8.71 12.32 103.9 428 8.2 1.20 8.43 11.43 98.9 336 3.2.2. Hemikalije Tokom rada korišćene su sledeće hemikalije: - n Heksan (Merck) - Etil-acetat (Merck) - Metanol (Baker) - Milli-Q voda - Estriol (Fluka, Sigma Aldrich) - α-estradiol (Fluka, Sigma Aldrich) - β-estradiol (Fluka, Sigma Aldrich) - Dietilstilbestron (Fluka, Sigma Aldrich) - Estron (Fluka, Sigma Aldrich) - Etilen-estradiol (Fluka, Sigma Aldrich) - Progesteron (Fluka, Sigma Aldrich) - Noretindron (Fluka, Sigma Aldrich) 23
3.2.3. Pribor Tokom rada, korišćen je sledeći pribor: - Laboratorijske čaše, 400 ml - Menzure, 100 ml - Pipete, 5 ml i propipete - Automatske pipete - Pasterove pipete - SPE manifold - Teflonske cevčice - Membranski mikrofiltri 0.45 μm - Plastični špricevi Pribor i posuđe korišćeno tokom rada je najpre oprano običnom vodom i deterdžentom, a zatim isprano demineralizovanom vodom. 3.3. Tok eksperimenta 3.3.1. Priprema uzoraka Uzorci rečne vode su bili konzervirani čuvanjem na 4 o C. Za pripremu i koncentrovanje uzoraka primenjena je ekstrakcija na čvrstoj fazi (engl. solid phase extraction-spe), koja je podrazumevala 4 koraka: - Kondicioniranje sorbenta - Propuštanje uzorka - Sušenje sorbenta - Eluiranje analita Korišćeni su kertridži Supelclean, ENVI-18, 6 ml, 500 mg. Kondicioniranje sorbenta Kondicioniranje sorbenta je izvršeno propuštanjem po 5 ml rastvarača, redom: heksana, etil-acetata i metanola. Na kraju je propušteno 10 ml milli-q vode. Dodavanje uzorka Nakon kondicioniranja, propušteno je 400 ml uzorka, pomoću teflonskih cevčica, sa stalnim protokom 3-5 ml/min (slika 11). 24
Slika 11. Propuštanje uzorka pomoću teflonskih cevčica Sušenje sorbenta Sušenje sorbenta je izvršeno uključivanjem vakuum pumpe u trajanju od 20 minuta, nakon dodavanja celokupne količine uzorka. Eluiranje analita Eluiranje analita je izvršeno sa 6 ml smeše etil-acetat metanol (5:1). Nakon eluiranja, rastvori su upareni do suva u struji azota (slika 12), a rekonstituisanje je izvršeno sa 1 ml metanola. Svi uzorci su zatim filtrirani kroz membranske mikrofiltre (LUT Syringe Filters PTFE, 13 mm, 0,45 μm), direktno u vijale za HPLC-MS analizu. 25
Slika 12. Uparavanje u struji azota 3.3.2. Priprema standardnog rastvora smeše hormona Standardni rastvori smeša hormona su pripremljeni rastvaranjem čvrstih supstanci u acetonitrilu, pri čemu je dobijen osnovni rastvor, a njegovim razblaživanjem dobijeni su kalibracioni rastvori željenih koncentracija. Za negativni mod, kalibracioni rastvori su bili koncentracija 0.1μg/ml, 0.5μg/ml i 1.2 μg/ml. Za pozitivni mod, kalibracioni rastvori su bili koncentracija 0.1μg/ml, 0.5μg/ml i 1.0 μg/ml. 3.3.3. HPLC-MS analiza U uzorcima površinskih voda ispitivano je prisustvo 8 ženskih polnih hormona. Od svakog uzorka uzete su 3 probe, zapremine 400 ml. Uzorci pripremljeni na prethodno opisani način analizirani su metodom tečne hromatografije u sprezi sa masenom spektrometrijom, HPLC-MS. Analiza je izvršena na instrumentu HPLC-Agilent 1100 Series sa masenim spektrometrom MS-Agilent 6320 Series Ion Trap. Hromatografsko razdvajanje analita 26
C. Smeša acetonitrila i vode je korišćena kao mobilna faza, pri čemu je vršeno gradijentno eluiranje. Započeto je sa 40% acetonitrila, a završeno sa 90% acetonitrila, u roku od 20 minuta. Pre snimanja vršeno je ispiranje mobilnom fazom, u trajanju od 20 minuta. Nakon završenog ispiranja, gradijent mobilne faze se vraća na početne uslove. Injektovano je 10 μl uzorka. Za jonizaciju uzorka nakon hromatografskog razdvajanja primenjena je elektrosprej jonizacija. izvršeno je na koloni Phenomenex Kinetex C18, 2,6 μm, 150x3 mm, a radna temperatura kolone bila je 25,1 27
4. REZULTATI I DISKUSIJA 28
4.1. Prikaz i diskusija rezultata Šest hormona koji su analizirani u negativnom modu, pri naponu kapilare od -109 V, dati su tabeli 3. Pripremljeni su standardni rastvori smeše dole navedenih hormona, u acetonitrilu, sledećih koncentracija: 0.1 μg/ml, 0.5 μg/ml i 1.2 μg/ml. Na osnovu hromatograma smeše koncentracije 1.2 μg/ml, (slika 13.), beležena su retenciona vremena za svaki od hormona. Očitana retenciona vremena su u saglasnosti sa podacima iz literature. α-estradiol β-estradiol Estriol Etinilestradiol Estron Dietilstilbestron Slika 13. Hromatogram standardnog rastvora smeše hormona koncentracije 1.2 μg/ml analiziranih u negativnom modu Tabela 3. Retenciona vremena i karakteristični joni hormona analiziranih u negativnom modu Naziv hormona m/z Retenciono vreme (min) Estriol 287.1 3.7 α-estradiol 271.1 9.5 β-estradiol 271.1 10.1 Dietilstilbestron 267.1 12.6 Estron 269.1 11.1 Etinilestradiol 295.1 10.7 Na slici 14., prikazan je kalibracioni grafik standardnih serija ispitivanih hormona analiziranih u negativnom modu. Nakon izvršenog fitovanja prikazane zavisnosti, dobijene su kalibracione prave dobre linearnosti, sa zadovoljavajućim koeficijentom korelacije, R 2, prikazanim u tabeli 4. 29
Povrsina pika(abs. units) 1x10 7 1x10 7 1x10 7 1x10 7 1x10 7 9x10 6 8x10 6 7x10 6 6x10 6 5x10 6 4x10 6 3x10 6 2x10 6 1x10 6 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 koncentracija (ug/ml) Slika 14. Kalibracioni grafik standardnih serija ispitivanih hormona analiziranih u negativnom modu Tabela 4. Koeficijenti korelacije kalibracionih pravih standardnih serija hormona analiziranih u negativnom modu Naziv hormona α estradiol Etinilestradiol Dietilstilbestrol Estron Estriol β-estradiol Koeficijent korelacije, R 2 0.9893 0.9911 0.9804 0.9828 0.9877 0.9943 Dva hormona koja su analizirana u pozitivnom modu, pri naponu kapilare od +109 V, data su u tabeli 5. Pripremljeni su standardni rastvori smeše dole navedenih hormona, u acetonitrilu, sledećih koncentracija: 0.1 μg/ml, 0.5 μg/ml i 1.0 μg/ml. Na osnovu hromatograma smeše najveće koncentracije (slika 15.), zabeležena su retenciona vremena za oba hormona, koja su u saglasnosti sa podacima iz literature. 30
Noretindron Progesteron Slika 15. Hromatogram standardnog rastvora smeše hormona koncentracije 1.0 μg/ml analiziranih u pozitivnom modu Tabela 5. Retenciona vremena i karakteristični joni hormona analiziranih u pozitivnom modu Naziv hormona m/z Retenciono vreme (min) Noretindron 299.1 10.2 Progesteron 315.1 16 Na slici 16., prikazan je kalibracioni grafik standardnih serija ispitivanih hormona analiziranih u pozitivnom modu. Nakon izvršenog fitovanja prikazane zavisnosti, dobijene su kalibracione prave sa zadovoljavajućim koeficijentom korelacije, R 2, prikazanim u tabeli 5. Povrsina pika (abs. units) 8x10 7 7x10 7 6x10 7 5x10 7 4x10 7 3x10 7 2x10 7 1x10 7 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 koncentracija (ug/ml) Slika 16. Kalibracioni grafik standardnih serija ispitivanih hormona analiziranih u pozitivnom modu 31
Tabela 6. Koeficijenti korelacije kalibracionih pravih standardnih serija hormona analiziranih u pozitivnom modu Naziv hormona Koeficijent korelacije, R 2 Progesteron 0.9847 Noretindron 0.9544 Nepoznate koncentracije hormona u realnim uzorcima računate su u odnosu na koncentracije kalibracionih standarda. Na slici 17. prikazan je hromatogram uzorka reke Save kod Zabrana, sa hormonima analiziranim u negativnom modu. Na slici 18. prikazan je hromatogram istog uzorka sa hormonima analiziranim u pozitivnom modu. Poređenjem sa hromatogramom standardne smeše hormona i na osnovu retencionih vremena, izvršena je identifikacija prisutnih hormona, a integraljenjem površine ispod pika, izračunata je koncentracija hormona koja je prisutna u uzorku. Slika 17. Hromatogram uzorka reke Save kod Zabrana, sa hormonima analiziranim u negativnom modu 32
Slika 18. Hromatogram uzorka reke Save kod Zabrana, sa hormonima analiziranim u pozitivnom modu Na slici 19. prikazan je hromatogram uzorka reke Save kod Makiša, sa hormonima analiziranim u negativnom modu. Na slici 20. prikazan je hromatogram istog uzorka sa hormonima analiziranim u pozitivnom modu. Poređenjem sa hromatogramom standardne smeše hormona i na osnovu retencionih vremena, izvršena je identifikacija prisutnih hormona, a integraljenjem površine ispod pika, izračunata je koncentracija hormona koja je prisutna u uzorku. Slika 19. Hromatogram uzorka reke Save kod Makiša, sa hormonima analiziranim u negativnom modu 33