Ispitivanje prisustva zenskih hormona u vodama Save i Dunava

Ispitivanje prisustva zenskih hormona u vodama Save i Dunava

UVOD Voda je osnovni preduslov za zivot svih zivih bica na Zemlji.Ona je izvor hrane i neophodnih minerala,sredstvo za rad,sredina za mnoge zive organizme, izvor energetskih resursa,mesto rekreacije,itd.neophodna je za odrzavanje strukturnog jedinstva celija,tkivai celog organizma.najvecu ulogu u zagadjivanju vode ima covek sa svojim aktivnostima.izvori zagadjivanja zivotne sredine mogu se podeliti u dve kategorije:jednu cine prirodni izvori zagadjivanja a drugu predstavljaju vestacki.u procesu prirodnog kruzenja vode mnoge zagadjujuce materije koje covek proizvodi u okviru svojih raznovrsnih aktivnosti dospevaju u prirodne vode. Prema navodima naucnih saradnika i ekoloskih grupa,od kasnih devedesetih,naucna zajednica je saznala da su lekovi,posebno oralni kontraceptivi,pronadjeni u otpadnim vodama potencijalni zagadjivaci vode za pice. Na ovom projektu ispitivane su vode dve reke u Srbiji,Dunava i Save. Dunav je druga po velicini reka u Evropi i njen najprometniji plovni put koji kroz svoj tok od planine Svarcvald u Nemackoj do usca u Crno more povezuje deset zemalja i 80 miliona ljudi razlicitih jezika,nacionalnosti,istorijskog i kulturnog nasledja.duga je 2850 km a u svom slivu ima 120 pritoka.dunav se pruza kroz Srbiju sa 588 km. Reka Sava duga 945 km,podrucjem Beograda protice u duzini od 30 km.usce Save u Dunav ispod Kalemegdana je nanadmorskoj visini od 68 metara. Cilj ovog našeg istraživanja je da se identifikuju zagađivači,tj.ostaci lekova(zenskih hormona) u uzorcima vode uzetim iz Save i Dunava, pomoću LC/MS tehnike ( tecna hromatografija -masena spekrtometrija ) i da se ustanove njihovi izvori.nedavne studije pokazuju zabrinutost zbog rizika raka prostate kod muskaraca usled dugorocnog konzumiranja ostataka farmaceutskih preparata koji se koriste kao zenski kontraceptivi a nalaze se u vodi za pice. ZENSKI POLNI HORMONI Zenski polni hormoni jos se nazivaju i estrogeni hormoni. Tri glavna estrogena kod zena su estriol,estron i estradiol (slike 1., 2. i 3.),zatim imamo i sinteticki estrogen,to je dietilstilbestrol,steroidni hormon progesterone i noretindron koji je sinteticki progesteron i koristi se kod oralnih kontraceptiva. Slika 1.Estriol [HBTS] Page 2

Slika 2.Estron Slika 3. Estradiol Razlika u strukturi ova tri estogena je u cetvrtom (D) prstenu. Estriol na cetvrtom prstenu ima vezane dve hidroksilne grupe (-OH), estradiol na cetvrtom prstenu ima jednu hidroksilnu grupu, dok estron ima keto grupu (=O). Hemijska formula estriola je C18H24O3, dok mu je molekulska masa 288.39 gr/mol. Hemijska formula estrona je C18H22O2, molekularna masa 270,336 gr/mol, a polu-zivot 19 casova. Hemijska formula estradiola je C18H24O2, molekularna masa 272.39 gr/mol, dok mu je poluzivot 13 casova. [HBTS] Page 3

Estriol je hormone koji se javlja u toku trudnoce. Estron je najmanje zastupljen od sva tri estrogena hormona u ljudskom (zenskom) organizmu. Dok je estradiol zastuljen u zenskom organizmu gotovo sve vreme, estron je zastupljen najvise u toku trudnoce. Estron je bitan za zdravstveno stanje, jer se konvertuje u estron sulfat, derivat estrona dugog zivota. Estron sulfat deluje kao rezerva estrona, koji se po potrebi konvertuje u aktivniji estradiol. Estradiol je polni hormon koji nema samo uticaja na seksualnu funkciju, vec ima i uticaja i na ostale organe, cak i na strukturu kostiju. On je i primarni estrogen u organizmu muskarca. U periodu mogucnosti reprodukcije najveci deo estradiola kod zena proizvodi se aromatizacijom androstenediona u estriol, koji se kasnije konvertuje u estradiol. Manji deo ovog hormona se proizvodi u nadbubreznoj kori, a kod muskaraca u testisima. Estradiol se takodje proizvodi u mozgu i u zidovima artetija.kolicina estadiola okd zena odrzava primarnu aktivnost jajnika.estradiol, kod zena, deluje kao hormon rasta i razvoja organa za reprodukciju. Razvice sekundarnih polnih odlika kod zena je u zavisnosti od estrogena, narocito estradiola. Te promene pocinju u periodu puberteta, najprimetnije su u reproduktivnom dobu, a manje su primetne u periodu kada nivo estradiola pada, u periodu menopauze. To znaci da estradiol utice na razvoj grudi kod zena, promene u organizmu, razvoj skeleta, zglobova, deponovanja masti, kompozicije koze.uticaj estradiola i estrogena uopste kod muskaraca je slozeno. Estriol se kod muskaraca proizvodi u posebnim celijama u testisima. UZORKOVANJE VODE Uzorci su uzeti 03.04.2013.godine, nisu konzervirani i uzeti su na sledecim mestima: 1. Reka Sava~Zabran 2. Reka Sava~Makis 3. Reka Sava~Kapetanija 4. Reka Dunav~Batajnica 5. Reka Dunav~Vinca [HBTS] Page 4

Na mapi su prikazana mesta uzorkovanja: Slika 4.Mesta uzorkovanja Tabela 1. Lokacije na kojima je izvrženo uzorkovanje [HBTS] Page 5

#SPE METOD: UZORAK 400 ML RECNE VODE POSTUPAK ISPITIVANJA KERTRIDZI:SUPERCLEAN-18,SPETUBES,6ML,1GR SLIKA 5.KERTRIDZI KONDICIONIRANJE:5ML HEKSANA,5ML ETIL ACETATA,5ML METANOLA,10ML MILLIQ-WATER SLIKA 6.KONDICIONIRANJE [HBTS] Page 6

PROPUSTANJE UZORAKA SLIKA 7.PROPUSTANJE UZORKA SUSENJE 20MIN U VAKUUMU SLIKA 8.SUSENJE [HBTS] Page 7

ELUIRANJE:6ML SMESE ETIL ACETAT-METANOL(5:1) EVAPORACIJA DO SUVA SLIKA 9.EVAPORACIJA REKONSTITUISANJE SA 1ML METANOLA FILTRIRANJE(LUT SYRINGE FILTERS PTFE,13MM,0.45UM SLIKA10.FILTRACIJA [HBTS] Page 8

SPREMLJENI UZORCI SLIKA11.UZORCI(VIJALE) Kondicioniranje kertridža Kondicioniranje kertridža je izvršeno pomoću četiri rastvarača. Najpre je propušteno 5 ml heksana, zatim 5mL etil-acetata, onda 5 ml metanola, in a kraju 10 ml milliq vode. Nanošenje uzorka Nakon kondicioniranja, na kertridže je naneto po 400 ml svakog uzorka. Nanošenje uzorka je vršeno automatski, pomoću cevčica, zapreminskim protokom od približno 3-5 ml/min. Sušenje Posle nanošenja uzorka izvršeno je sušenje kertridža na vakuumu u trajanju od 20 minuta. Eluiranje Analiti su eluirani sa kertridža sa 6 ml smeše etil-acetat methanol (5:1). Nakon eluiranja, rastvori su upareni do suva u struji azota i rekonstituisani sa 1 ml metanola. Zbog mogućeg prisustva različitih vrsta nečistoća u površinskoj void uzorci su zatim filtrirani (LUT Szringe Filters PTFE, 13 mm, 0,45 μm). [HBTS] Page 9

TECNA HROMATOGRAFIJA I MASENA SPEKTROMETRIJA APARAT NA KOM SU RADJENE ANALIZE I NJEGOVE KARAKTERISTIKE: SLIKA12.LC SLIKA13.LC/MS HPLC/ESI-MS ANALYSIS: COLUMN: PHENOMENEX KINETEX 2.6 ΜM, C18, 100 A, 150X3 MM MOBILE PHASE: ACN/WATER GRADIENT OF MOBILE PHASE:T 0 =40% OF ACN, T 20 =90% OF ACN COLUMN TEMPERATURE: 25 C FLOW: 0.25 ML.MIN -1 NEBULIZER PRESSURE: 25 PSI DRYING GAS TEMPERATURE: 350 C DRYING GAS FLOW: 10 L.MIN -1 CAPILLARY VOLTAGE: -109 V IN NEGATIVE MODE; +109 V IN POSITIVE MODE NEGATIVE MODE: ESTRADIOL (Α- AND Β-), ESTRIOL, ESTRONE, DIETHYLSTILBESTROL, ETHINYL ESTRADIOL [HBTS] Page 10

POSITIVE MODE: NORETHINDRONE AND PROGESTERONE SCAN: 50-800 M/Z Uzorci pripremljeni na prethodno opisani način analizirani su metodom tečne hromatografije u sprezi sa masenom spektrometrijom HPLC-MS. Za analizu je korišćen instrument HPLC-Agilent 1100 Series sa masenim spektrometrom MS-Agilent 6320 Series Ion Trap. Hromatografsko razdvajanje alanita izvršeno je na koloni Phenomenex Kinetex 2,6 μm, C18, 100 A, 150x3 mm. Temperatura kolone bila je 25 C. Kao mobilna faza korišćena je smeša acetonitrila i vode (gradijent mobilne faze t 0 =40% ACN, t 20 =90% ACN). Za jonizaciju uzorka nakon hromatografskog razdvajanja korišćena je elektrosprej jonizacija ESI (engl. Electrospray Ionization). Pritisak nebulajzera je bio 25 psi, temperatura gasa za sušenje (N 2 ) 350 C, a protok 10 L/min. Kao gas raspršivač takođe je korišćen azot. Maseni analizator korišćen u analizi je jonski trap. Šest hormona analizirano je u negativnom modu (napon kapilare -109 V) i to: α-estradiol, β- estradiol, estriol, estron, dietil-stilbestrol i etinil-estradiol, dok su preostala dva, progesteron i noretindron analizirani u pozitivnom modu (napon kapilare +109 V). skenirani su svi joni čija je vrednost odnosa mase i naelektrisanja u opsegu 50-800 m/z. Pre snimanja realnih uzoraka, snimljeni su kalibracijski standardi odabranih hormona koncentrracija 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml i 1,2 μg/ml za ngativni mod, odnosno 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml i 1 μg/ml za pozitivni mod. Zatim je snimljeno i 15 prethodno pripremljenih uzoraka (5 uzoraka rečne vode x 3 probe). Nepoznate koncentracije hormona u realnim uzorcima računate su u odnosu na koncentracije kalibracionih standarda (instrument automatski radi kalibraciju i preračunava). [HBTS] Page 11

HROMATOGRAFIJA(SEMA APARATA): Tecna hromatorgafija (LC), je vrsta hromatografije u kojoj je mobilna faza noseći gas. Obično se koristi inetran gas kao što je helijum ili nereaktivan gas kao što je azot. Stacionarnu fazu predstavlja mikroskopski sloj tečnosti ili polimera na čvrstom inertnom nosaču koji se nalazi u staklenoj ili metalnoj koloni. Instrument koji se koristi za izvođenje ovakve hromatografije naziva se gasni hromatograf. SLIKA14.SEMA HROMATOGRAFA [HBTS] Page 12

MASENA SPEKTROMETRIJA: ANALITIČKA METODA U KOJOJ SE ISPITIVNANI UZORAK JONIZUJE, A DOBIJENI JONI SE RAZDVAJAJU PREMA ODNOSU MASE I NAELEKTRISANJA (M/Z). SLIKA15.MASENI SPEKTROMETAR [HBTS] Page 13

SLIKA16.PRIMENA HPLC-MS METODE: IDENTIFIKACIJA ZAGADJIVACA KADA RADIMO LC/MS ANALIZE,ZA IDENTIFIKACIJU ZENSKIH HORMONA KORISTIMO RACUNARE SA INSTALIRANIM SOFTVERIMA ZA IDENTIFIKACIJU PODATAKA,A DOBIJENI PIKOVI SE UPOREDJUJU SA POSTOJECOM BIBLIOTEKOM PODATAKA TJ BAZOM PODATAKA.NAJZNACAJNIJI PIKOVI SE IZDVAJAJU I IMAJU SVOJE MASE I ODREDJENO RETENCIONO VREME. [HBTS] Page 14

DISKUSIJA REZULTATA Na osnovu dobijenih rezultata došli smo do zaključka da su u uzorcima vode uzetim iz Dunava i Save prisutni sledeći zenski polni hormoni: Hormone Sampling place Sava River, Zabran Sava River, Makiš Sava River, Kapetanija Danube River, Batajnica Danube River, Vinča Compound LOD (ng.l -1 ) Recovery (%) α-estradiol (ng.l -1 ) β-estradiol Ethinyl estradiol Diethylstilbestrol (ng.l -1 ) (ng.l -1 ) (ng.l -1 ) Estrone (ng.l -1 ) Estriol (ng.l -1 ) Progesterone (ng.l -1 ) Norethindrone (ng.l -1 ) 0,0259 - - - 0,192 0,5653-0,0805 0,0818 0,0833 0,1587 0,0373 0,1775 0,3720 0,0287 0,1340 0,0784 - - - 0,1452-0,0237 0,0530 0,2275-0,2044-0,1969-0,0551-0,1116 - - - 0,0969-0,0331 0,0834 α-estradiol β-estradiol Ethinyl estradiol Diethylstilbestrol Estrone Estriol Progesterone Norethindrone 0,03 0,08 0,10 0,02 0,08 0,15 0,01 0,01 76,98 79,46 89,07 97,63 74,48 80,61 81,63 86,07 Tabela 2. Rezultati Na osnovu koncentracija dobijenih analizom na HPLC-MS instrumentu, izračunate su stvarne koncentracije hormona u uzorcima površinskih voda: gde je: c 1 izmerena koncentracija μg/ml, V 1 injektovana zapremina uzorka, 10 μl, c 2 koncentracija u vijalama, μg/ml, V 2 zapremina rastvora u vijali, 1 ml i [HBTS] Page 15

gde je: c realna koncentracija hormona u uzorku, μg/ml, V zapremina uzorka, 400 ml. Zamenom vrednosti zapremine u prethodna dva izraza i njihovim sređivanjem dobija se konačan izraz za izračunavanje koncentracije: gde je koncentracija analita u uzorcima rečne vode izražena u ng/l. u tabeli 2 prikazane su izračunate vrednosti koncentracija odabranih hormona u uzorcima rečne vode sa Save i Dunava. ZAKLJUCAK Rezultati istrzivanja pokazali su prisustvo svih ispitivanih hormona u reci Savi.Etinil estradiol je pronadjen u uzorku uzetom na Makisu(0.1587 ng.l -1 ),dok se koncentracije pronadjenih hormona:estrona,estriola,progesterone i noretindrona krecu od 0.1452-0.1920ng.L -1,0.3720-0.5653ng.L - [HBTS] Page 16

1,0.0237-0.0287ng.L -1,0.0530-0.1340ng.L -1.Hormoni β-estradiol,dietilstilbestrol i estriol nisu pronadjeni u uzorcima reke Dunav.Noretindron je otkriven u uzorku u Vinci(0.0834ng.L -1,dok je etinil estradiol bio prisutan samo u uyorku sa Batajnice. α-estradiola,progesterone i estrona pronadjene su koncentracije koje se krecu od 0.1116-0.2275ng.L -1.Nivo α-estradiola pokazuje tendenciju porasta nizvodno,a nivoi estrona i progesterone su manje ili vise stabilni.mozemo zakljuciti da je HPLC/ESI-MS odgovarajuca metoda za determinaciju i kvantifikaciju zenskih hormona u vodama matrice. LITERATURA I SAJTOVI: 1. Caliman, F.A., Gavrilescu, M. (2009) Pharmaceuticals, Personal Care Products and Endocrine Disrupting Agents in the Environment, Clean-Soil Air Water 37 (2009) 277-303 2. Ying, G.G., Kookana, R.S., Ru, Y.J., (2002) Occurence and fate of hormone steroids in the environment, Environment International 28, 545-551 3. Touraud, E. et al., (2011) Drug residues and endocrine disruptors in drinking water: Risk for humans?, International Journal of Hygiene and Environmental Health 214, 437-441 4. Liu, S., Ying, G., Zhao, J., Chen, F., Yang, B., Zhou, L., Lai H., (2011), Trace analysis of 28 steroids in surface water, wastewater and sludge samples by rapid resolution liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectromentry, Journal of Chromatography A 1218 1367-137 5. www.wikipedia.org [HBTS] Page 17