ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM GROŽĐU PRIMJENOM HPLC METODE S ELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROM Ivana Novak,dipl.ing. Prehrambeno-tehnološki fakultet,osijek
POLIFENOLI predstavljaju veliku grupu prirodnih spojeva vrlo raširenih u biljnom svijetu glavni nutritivni izvori polifenola su: voće, povrće, sjemenke, te napici kao što su čajevi, voćni sokovi, vino i kava 7 6 Difenilpropan 8 O A C 2 3 5 4 2 1 3 B 6 4 5 podjela polifenola: ne-flavonoidi fenolne kiseline stilbeni flavonoidi flavoni flavanoli flavonoli flavanoni izoflavoni antocijanidini
značaj flavonoida: primjena u prehrambenoj industriji pozitivno djelovanje na ljudsko zdravlje U samim biljkama antocijanini djeluju: - antibakterijski, - antifungalno, - kao agensi koji privlače insekte koji sudjeluju u oprašivanju biljaka, - pružaju zaštitu od štetnog UV zračenja Biološke funkcije flavonoida pripisuju se njihovoj izvanrednoj antioksidacijskoj i antiradikalskoj aktivnosti.
GROŽĐE kao izvor polifenola crne sorte grožđa predstavljaju iznimno bogat izvor flavonoida oko 70% polifenola dolazi u sjemenci dok oko 30% dolazi u kožici grožđa Polifenolni spojevi identificirani u grožđu su: flavan-3-oli (katehin i epikatehin), polimeri (procijanidini) i oligomeri (tanini) flavan-3-ola, flavonoli (kvercetin, miricetin), antocijanidini. Antocijanini u kožici grožđa Sadržaj antocijanina u grožđu kreće se od 12 do 30 mg/g
ANTOCIJANINI predstavljaju najrašireniju i najznačajniju grupu prirodnih biljnih pigmenata odgovorni su za širok spektar boja u biljkama i biljnim proizvodima, uključujući narančastu, crvenu, ljubičastu i plavu Osnovna struktura antocijanidina - flavilijev kation R1 antocijanini su po svom kemijskom sastavu glikozidi antocijanidina HO O+ R2 antocijanin = antocijanidin + šećer
Euroazijske vrste grožđa (Vitis vinifera)sadrže sljedeće antocijanine: Cijanidin-3-O-glukozid Peonidin-3-O-glukozid OCH 3 + + O-Gluc O-GLuc Petunidin-3-O-glukozid Malvidin-3-O-glukozid + + OCH 3 OCH 3 O-Gluc O-Gluc
antocijanini određuju boju vina koncentracija antocijanina u vinu određena sadržajem antocijanina u grožđu i tehnološkim postupkom proizvodnje vina sadržaj antocijanina u grožđu ovisi o : vrsti grožđa, klimatskim faktorima, uvjetima uzgoja vinove loze, sastavu tla,... i povećava se tijekom zrenja grožđa. Indikator zrelosti grožđa phenolic maturity
SPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA antocijanini intenzivno apsorbiraju u vidljivom dijelu spektra, što je posljedica efikasne delokalizacije i rezonancijske stabilizacije u aromatskom π elektronskom sustavu molekula maksimum apsorbancije antocijanina je oko 520 nm mau 175 191.91 603.20 mau 175 191.91 603.20 Peonidin-3-glukozid 150 150 125 Cijanidin-3-glukozid 125 100 100 75 75 50 Malvidin-3-glukozid 50 25 25 Delfinidin-3-glukozid 200 300 400 500 nm 200 300 400 500 nm Spektri antocijanina
+H + kinoid flavilijev kation -H + + H 2 O halkon pseudobaza karbinol pseudobaza
apsorpcijski spektri malvina kod različitih ph vrijednosti
ELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA R 1 antocijanini podliježu elektrokemijskoj oksidaciji + R 3 R 2 elektroaktivne fenolne skupine Mehanizam elektrokemijske oksidacije antocijanina
elektroketrokemijska svojstva antocijanina utvrđena su primjenom elektrokemijskih metoda cikličke voltametrije, diferencijalne pulsne voltametrije i pravokutno valne voltametrije elektrokemijske metode daju podatak o: mehanizmu elektrokemijske oksidacije spojeva elektrokemijskim svojstvima spoja antioksidacijskoj aktivnosti spoja Veća sposobnost otpuštanja elektrona=niži oksidacijski potencijal=veća antioksidacijska aktivnost
Za separaciju i kvantifikaciju antocijanina u prirodnim uzorcima najčešće se koriste metode visokodjelotvorne tekućinske kromatografije (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) u kombinaciji s: UV/Vis, PDA, masenim detektorom. mobilna faza pumpa injektor kolona -Shematski prikaz tekućinskog kromatografa detektor obrada podataka
amperometrijski konduktometrijski kulometrijski potenciometrijski
ELEKTROKEMIJSKI DETEKTOR protočna ćelija wall-jet tipa, u kojoj je: radna elektroda elektroda od staklastog ugljika, referentna elektroda je ISAAC elektroda (in situ Ag/AgCl), protuelektroda je Pt žica Outlet inlet Radna elektroda Pomocna elektroda Referentna elektroda
R O + ne - signal pobude RADNA ELEKTRODA konst. električni napon signal odziva struja detekcija elektroaktivnih supstanci
OSJETLJIVOST Granice detekcije - najmanja količina analita u uzorku koja se može detektirati Granice kvantifikacije - najmanja količina analita u uzorku koja se može kvantificirati Granice detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ), izražene u mol L -1, dobivene primjenom PDA i elektrokemijskog detektora Uzorak oenin peonidin mirtilin kuromanin PDA detektor LOD LOQ 1 10-8 3.6 10-8 3 10-8 1 10-8 5 10-8 1.7 10-8 3.7 10-8 1.2 10-8 Elektrokemijski detektor LOD LOQ 7.5 10-11 2.5 10-11 4.5 10-11 1.5 10-11 5.3 10-11 1.7 10-11 2 10-11 7 10-11 Detekcija analita u tragovima
0.1 na 0.25 mau (A) Kromatogrami dobiveni (A) elektrokemijskim i (B) PDA detektorom za otopine kuromanina koncentracija 5 10-10 M ( ), 1 10-9 M ( ),1 10-8 M ( ) (B) 4 6 8 10 12 Time (min) (A) peonidin oenin Kromatogrami ekstrakta kožice grožđa vrste tinta roriz, razrijeđenog 100-puta. (A) Kromatogram snimljen elektrokemijskim detektorom pri potencijalu +0.5 V, (B) kromatogram snimljen PDA detektorom, pri valnoj duljini 520 nm myrtillin petunidin 1 na kuromanin (B) 4 mau 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Time (min)
PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U KVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZI visoka osjetljivost selektivnost selektivna detekcija elektroaktivnih spojeva odabirom radnog potencijala (multi-channel elektrokemijski detektori) linerana ovisnost visine pika o koncentraciji elektroaktivne vrste dobra reproducibilnost cijena Kromatogrami meda dobiveni primjenom multichannel elektrokemijskog detektora kod potencijala: (a) +900 mv, (b) +700 mv, (c) +600 mv, (d) +400 mv.pikovi: (1) galna kiselina, (2) protokatehinska kiselina, (3), vanilinska kiselina, (kafeinska kiselina), (siringična kiselina), (6) p- kumarinska kiselina
PRIMJENA: MEDICINA Determination of total cholesterol in serum by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (K. Hojo et.al.) FARMACIJA Sensitive quantification of chosen drugs by reversed-phase chromatography with electrochemical detection at a glassy carbon electrode (A. Chmielewska et.al.) PREHRAMBENA INDUSTRIJA Application of HPLC with electrochemical detection for the determination of low lewels of antioxidants (M. Škrinjar et.al.) Determination of phenolic acids in vegetable oil using HPLC coupled with electrochemical detection (I. Bernweiser et.al.) EKOLOGIJA Fast separation and sensitive detection of carcinogenic aromatic amines by reversed phase m- liquid chromatography coupled with electrochemical detection (M. Shelke et.al.)
Cilj istraživanja: optimizacija HPLC metode za analizu antocijanina u kožici grožđa u metodi su korišteni PDA i elektrokemijski (amperometrijski) detektor Za analizu su korištene 4 vrste grožđa (jaen, tinta roriz, touriga nacional, alfrosheiro) uzorkovane u regiji Dão, Portugal.
ZAHVALA NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO ŠKOLSTVO, OBRAZOVANJE I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE