Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Određivanje sadržaja polikličnih aromatičnih ugljovodonika u zemljištu ~Master rad~ Mentor: Dr Vesna Stankov Jovanović Autor: Marija Ilić Niš, 2014.
Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: монографска текстуални / графички мастер рад Марија Илић Весна Станков Јовановић српски енглески Р. Србија Р. Србија Одређивање садржаја полицикличних ароматичних угљоводоника у земљишту Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) Научна област, НО: Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: 6 поглавља/ 43 стране/ 18 табела/ 30 слика хемија аналитичка хемија полициклични ароматични угљоводоници (PAH), ултразвучна екстракција, гасна хроматографија, масена спектрометрија УДК Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У оквиру овог мастер рада одређивана је концентрација 16 приоритетних полицикличних ароматичних угљоводоника (PAH) у узорцима земљишта применом методе гасне хроматографије масене спектрометрије (ГХ/МС). PAH ови су из узорака земљишта екстраховани системом растварача хексан ацетон, уз помоћ ултразвука, узорци су затим анализирани методом ГХ/МС и квантификација урађена применом софтверског пакета MassHunter. На основу добијених резултата закључено је да је у већини узорака основни извор контаминације земљишта нафтален (0,284 119,240 μg/kg), док је најмања концентрација у највећем броју узорака била за кризен и бензо[a]антрацен (0 до 0,172 μg/kg).укупна концентрација свих PAH-ова се налази у опсегу од 1 972 μg/kg до 58 879μg/kg
Датум прихватања теме, ДП: 15. 01. 2014. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор: Образац Q4.09.13 - Издање 1
Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: monograph textual / graphic University master degree thesis Marija Ilić Vesna Stankov Jovanović Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons concentration in soil Language of text, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: Locality of publication, LP: Serbian English Republic of Serbia Serbia Publication year, PY: 2014. Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref /tables/pictures/graphs/ Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: UC 6 chapters/ 43 pages/ 18 tables/ 30 pictures chemistry analitical chemistry polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), ultrasonic extraction, gas chromatography, mass spectrometry Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: In this master thesis, the concentrations of 16 priority polycyclic aromatic hydrocarbons in soil samples were determinated by gas chromatography - mass spectrometry method (GC/MS). PAHs were extracted from soil samples ultrasonically, using solvent system hexane acetone, followed by GC/MS analysis and quantification was performed applying the soft wear package Mass Hunter. Based on the results, it was concluded that in most samples the main source of contamination of soil was naphthalene (0.284 119.24 μg/kg), while the lowest concentrations in the majority of samples was the one for chrysene and benzo[a] anthracene (0 0.172 μg/kg). Total concentration of all analysed PAHs was within the range of 1.97 μg/kg to 518.879 μg/kg. Accepted by the Scientific Board on, ASB: January the 15 th 2014 Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:
Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u labaratorijama Departmana za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu. Želim da se zahvalim svojoj mentorki, profesorki dr Vesni Stankov Jovanović, vanrednom profesoru na Departmanu za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu, na ukazanoj pomoći prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i tokom organizovanja izvođenja eksperimentalnog rada. Takođe, zahvalila bih se i profesorki dr Violeti Mitić na savetima i sugestijama pri pisanju rada. Neizmernu zahvalnost dugujem i doktorantima Jeleni Cvetković, Mariji Dimitrijević, Mariji Ilić i Strahinji Simonivuću, na nesebičnoj pomoći prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog diplomskog rada. Srdačno se zahvaljujem i svojoj porodici i prijateljima na bezgraničnoj podršci tokom studija i izrade masetr rada.
Sadržaj 1. Uvod...1 2. Teorijski deo 2.1. PAH ovi...2 2.1.1. Definicija PAH ova i struktura...2 2.1.2. Osobine PAH ova, rasprostranjenost i poreklo...6 2.1.3. Mehanizam formiranja...10 2.1.4. Toksičnost PAH ova...10 2.1.5. Toksikokinetika...11 2.1.6. Degradacija PAH ova u životnoj sredini...13 2.2. Tehnike analize PAH ova u uzorcima zemljišta...14 2.2.1. Uzorkovanje...14 2.2.2. Ekstrakcija...15 2.2.3. Prečišćavanje...16 2.2.4. Metode analize...16 2.2.5.Gasna hromatografija...17 2.2.6. Masena spektrometrija...18 2.3. Pregled literature...19 3. Eksperimentalni deo 3.1. Faze eksperimentalnog rada...22
3.2. Aparatura...22 3.3. Pribor...22 3.4. Reagensi...22 3.5. Ultrazvučna ekstrakcija...23 3.6. Prečišćavanje uzoraka...23 3.7. Analiza...24 3.8. Obrada dobijenih rezultata...25 4. Rezultati i diskusija...28 Kvantitativna analiza...31 5. Zaključak...41 6. Reference...42
1. Uvod Policiklični aromatični ugljovodonici PAU (polycyclic aromatic hidrocarbons PAH), zbog svog dugog perioda degradacije u životnoj sredini i toksičnog delovanja spadaju u grupu perzistentnih organskih zagađivača (Persistent Organic Pollutants POPs). Njihovi proizvodi degradacije (kiseonični i azotovi derivati) takođe predstavljaju opasnost po životnu sredinu. Samim tim PAH ovi i njihovi produkti degradacije prestavljaju toksična organska jedinjenja. Oni pokazuju kancerogeno delovanje, dovode do akutne toksičnosti, razvojne i reproduktivne toksičnosti, citotoksičnosti i genotoksičnosti. Iako toksični, PAH ovi se mogu naći u hrani i životnoj sredini. PAH ovi u životnoj sredini mogu biti prirodnog ili antropogenog porekla. PAH ovi se sastoje iz dva ili više kondenzovana benzenova prstena, a nastaju kao posledica nepotpunog sagorevanja uglja, nafte, naftnog gasa, organskog otpada i raznih organskih supstanci. Postoji više od 100 različitih PAH ova koji se najčešće javljaju u smešama, ali se u nekim slučajevima mogu pronaći i kao pojedinačna jedinjenja. PAH ovi su veoma rasprostranjeni u svim delovima biosfere. Mogu se naći u industrijskim i komunalnim otpadnim vodama, odakle se veoma brzo distribuiraju kroz hidrosferu i bivaju transformisani. Takođe, usled nepotpunog sagorevanja organskih materija i nastajanja finog aerosola otpadnih voda mogu se naći i u atmosferi.. Najveća akumulacija PAH ova zabeležena je u zemljištu, kao posledica izlivanja nafte, šumskih požara, aktivnosti vulkana, prisustva industrijskog i komunalnog otpada u zemljištu i atmosferske depozicije. Ugljovodonici, u koje spadaju i PAH ovi, mogu biti degradirani pod dejstvom mikroorganizama i sunčeve svetlosti. Kako su i produkti degradacije PAH ova kao i sami PAH ovi veoma štetni, mora se pratiti njihova količina u životnoj sredini i primenjivati odgovarajući postupci za degradaciju i eliminaciju iz okruženja. Zbog potencijalnog kancerogenog i mutagenog dejstva koje imaju, veoma je važno praćenjekoncentracije PAH-ova u ljudskom okruženju. Iz tih razloga, propisane su granične vrednosti koncentracija ovih jedinjenja u različitim uzorcima. Cilj ovog master rada je određivanje koncentracije određenih PAH ova u uzorcima zemljišta primenom GC/MS metode. PAH ovi su iz uzoraka zemljišta ekstrahovani sistemom rastvarača heksan aceton, uz pomoć ultrazvuka. Za ovaj rad ispitivana je koncentracija PAH ova, koje Evropska Unija propisuje kao važne pokazatelje zagađenja životne sredine: acenaftilen, antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3- cd]piren, naftalen, fenantren, piren.
2.1. Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU, PAH) 2.1.1. Definicija PAH ova i struktura Policiklični aromatični ugljovodonici (PAH) predstavljajui jednu od najrasprostranjenijih grupa organskh polutanata u životnoj sredini. Hemijski gledano, to su jedinjenja organskog porekla koja u svojoj strukturi sadrže dva ili više kondenzovanih aromatičnih prstenova. Sastoje se uglavnom iz ugljenika i vodonika, ali u ovu grupu jedinjenja spadaju i derivati PAH ova kod kojih su atomi ugljenika zamenjeni atomima azota, sumpora ili kiseonika čineći tako heterociklična aromatična jedinjenja. Postoji preko 100 različitih PAH ova, sa većim ili manjim brojem kondenzovanih prstenova, međutim, oni koji su najzastupljeniji u životnoj sredini sadrže od dva do sedam benzenovih jezgaraa. Pored različitog broja kondenzovanih prstenova, PAH ovi se razlikuju i po rasporedu prstenova i po prisustvu i rasporedu bočnih nizova. Tako na primer, PAH ovi sa istim brojem kondenzovanih prstenova, se mogu bitno razlikovati osobinama u zavisnosti od toga da li su ti prstenovi raspoređeni linearno, ugaono ili u obliku klastera ( Lundstedt S., 2003.). Iako postoji veliki broj različitih PAH ova, za istraživanje i praćenje njihovih koncentracija u uzorcima iz životne sredine Evropska Unija definiše kao prioritetne samo njih 16 (European Commision, 2005.) čija imena i strukturne formule su prikazane u Tabeli 1. Tabela 1: EU prioritetni policiklični aromatični ugljovodonici Naziv Strukturna formula Molekulska formula Molekulska masa Naftalen C 10 H 8 128
Acenaftilen C 12 H 8 152 Acenaften C 12 H 10 154 Fluoren C 13 H 10 166 Fenantren C 14 H 10 178 Antracen C 14 H 10 178 Fluoranten C 16 H 10 202 Piren C 16 H 10 202
Benzo[a]antracen C 18 H 12 228 Krizen C 18 H 12 228 Benzo[b]fluoranten C 20 H 12 252 Benzo[k]fluoranten C 20 H 12 252 Benzo[a]piren C 20 H 12 252 Indeno[1,2,3- cd]piren C 22 H 12 276
Dibenzo[a,h]antracen C 22 H 14 278 Benzo[ghi]perilen C 22 H 12 276 Najprostiji PAH ovi su fenantren i antracen, oba sa po tri kondenzovana prstena. Najrasprostranjeniji su oni koji sadrže pet ili šest kondenzovanih prstenova. Oni sa šest kondenzovanih prstenova nazivaju se alternativni PAH ovi, dok se neki iz te grupe nazivaju i benzenoidnim PAH ovima. U takozvane male PAH ove spadaju oni molekuli koji sadrže do šest kondenzovanih benzenovih jezgra, dok se oni sa više od šest nazivaju velikim PAH ovima. Osobine i biološka aktivnost u ovim grupama se znatno razlikuju, što je posledica kinetičkih ograničenja usled voluminoznosti molekula kao i molekulske mase. Iako veliki PAH ovi imaju mogućnost za postojanje većeg broja izomera, to ipak nije slučaj. Istraživanja se najčešće baziraju na proučavanju takozvanih malih PAH ova, što je najčešće posledica dostupnosti uzoraka. Postoji nekoliko različitih načina za imenovanje PAH ova, međutim, najveću primenu našla je nomenklatura koju je ustanovila Međunarodna unija za čistu i primenjenu hemiju (IUPAC), koja se zasniva na sledećim pravilima (Slika 1): 1. Struktura jedinjenja piše se tako da najveći broj prstenova leži u horizontalnom redu; 2. Horizontalna i vertikalna osa povlače se kroz centar horizontalnog reda, a molekul se orijentiše tako da maksimalan broj prstenova, koji ne leže u horizontalnoj ravni, bude u gornjem desnom, a minimalan u donjem levom kvadrantu; 3. Atomi ugljenika se numerišu u smeru kazaljke na satu, pri čemu se sa numeracijom počinje od ugljenika koji nije deo ni jednog drugog prstena i koji se nalazi na gornjem desnom prstenu, dok se ugljenikovi atomi koji su deo dva ili više prstena ne numerišu; 4. Veze između dva atoma koji nisu zajednički za dva ili više prstenova, obeležavaju se slovima abecede, pri čemu slovo a predstavlja vezu između atoma
obeleženih sa 1 i 2. Slovna obeležja takođe su orijentisana u smeru kretanja kazaljke na satu; 5. Jedinjenje (ili izomer) koje sadži neki supstituent imenuje se tako što se neposredno ispred naziva supstituenta u zagradi napiše odgovarajući broj ugljenikovog atoma ili slovo, kako bi se označilo na kom mestu je došlo do supstitucije. Slika 1. Struktura molekula PAH ova i numeracija C atoma Neznatan broj molekula (npr. fenantren i antracen) odstupa od navedenih pravila za imenovanje PAH ova. Neki od njih mogu se videti na Slici 2 (N. K. Nagpal, 1993.).
Slika 2. Odstupanje od pravila numeracije i nomenklature PAH - ova 2.1.2. Osobine PAH ova, rasprostranjenost i poreklo Fizičke i hemijske osobine PAH ova u mnogome zavise od njihove molekulske mase. Boja PAH ova u čvrstom stanju može biti bela, bledo zelena, žuta, ali mogu biti i u vidu bezbojnih kristala. Takođe, većina PAH ovi pokazuje dobru liposolubilnost, otpornost na fotorazgradnju i mogućnost fluorescencije u pobuđenom stanju. PAH ovi pokazuju karakteristične UV spektre na čemu se zasniva mogućnost njihove analize i kvantifikacije.
Na osnovu razlika u osobinama pravi se gruba podela PAH ova na PAH ove niske molekulske mase (LMW) i PAH ove velike molekulske mase (HMW). Tako se, na primer, otpornost prema oksidaciji ili redukciji smanjujesa povećanjem molekulske mase, dok rastvorljivost u vodi i isparljivost opadaju sa povećanjem molekulske mase jedinjenja. Neke veličine kao što su rastvorljivost, definisana koeficijentom rastvorljivosti u sistemu oktanol: voda (K ow ) i napon pare (Pa) razlikuju se od pet do dvanaest redova veličine sa povećanjem broja prstenova od dva do šest, što se može videti u Tabeli 2 (Lundstedt S., 2003.). Kao rezultat različitih osobina javlja se njihova različita rasprostranjenost, ponašanje i distribucija u životnoj sredini, kao i njihov uticaj na biološke sisteme, toksičnost i drugo. Tabela 2: Fizičke osobine policikličnih aromatičnih ugljovodonika PAH Broj prstenova Molekulska masa Rastvorljivost u vodi (mg/l) Napon pare (Pa) log K ow Acenaftilen 3 152 16 9*10-1 3,37 Antracen 3 178 0,045 1*10-3 4,54 Benzo[a]antracen 4 228 0,011 2,8*10-3 5,91 Benzo[a]piren 5 252 0,0038 7*10-7 5,91 Benzo[b]fluoranten 5 252 0,0015-5,80 Benzo[ghi]perilen 6 276 0,00026 1,4*10-8 6,50 Benzo[k]fluoranten 5 252 0,0008 5,2*10-8 6,00 Krizen (93%) 4 228 0,006 5,7*10-7 5,91 Dibenzo[a,h]antracen 6 278 0,006 3,7*10-10 6,75 Fluoranten 4 202 0,26 1,2*10-3 5,22 Fluoren 3 166 1,9 9*10-2 4,18 Indeno[1,2,3-cd]piren 6 276 0,0019-6,50 Naftalen 2 128 31 1*10 2 3,37
Fenantren 3 178 1,1 2*10-2 4,57 Piren 4 202 0,13 6*10-4 5,18 Acenaften 3 154 3,8 3*10-1 3,92 Na osnovu podataka o različitim fizičkim osobinama (Tabela 2) može se zaključiti da će promet LMW PAH ova u životnoj sredini biti daleko veći nego što je slučaj sa HMW PAH ovima. Takođe, usled veće isparljivosti, količina LMW PAH ova će biti veća u vazduhu, ali će oni biti i skloniji degradaciji pod dejstvom atmosfere. Slično tome, PAH ovi niske molekulske mase naćiće se u vodenoj sredini delimično ili potpuno rastvoreni, dok će se PAH ovi velike molekulske mase u vodi i vazduhu naći u obliku nerastvornih stabilnih čestica. Velike količine PAH ova bivaju dugotrajno sorbovane od strane organskih materija u zemljištu i na taj način relativno nedostupne za degradaciju. Međutim, izvesna količina PAH ova niske molekulske mase usled isparavanja, degradacije i izluživanja biva izgubljena tokom vremena. Sa porastom molekulske mase raste i stepen sorpcije organskim materijama u zemljištu, usled povećanja lipofilnosti. Zapravo, istraživanja pokazuju da dolazi do degradacije samih organskih komponenata zemljišta tokom vremena od strane PAH ova i taj je fenomen poznat pod nazivom starenje. Starenje se uglavnom javlja kao posledica spore difuzije unutar zemljišta, ali postoje i drugi mehanizmi koji uključuju formiranje veznih rezidua usled degradacije i na taj način stvaranje fizičkih klopki unutar mikropora u zemljištu. Procesi sorpcije i starenja ograničavaju stepen degradacije zagađivača, ali smanjuju i toksičnost zagađivača u zemljištu, smanjivanjem njihove koncentracije dostupne živim organizmima. Količina PAH ova u zemljištu bitno se razlikuje u zavisnosti od okoline. Tako na primer, koncentracija PAH ova u šumskim predelima iznosi od 5 do 100 μg/kg. Slične količine (10 100 μg/kg) PAH ova karakterišu i ruralne oblasti, dok su za naseljena mesta karakteristične znatno veće koncentracije, reda veličine od 600 do 3000 μg/kg (Georgiadis P., 1999.). U industrijskim oblastima, i u blizini prometnih puteva, koncentracija ovih štetnih materija može biti i znatno veća od pomenutih granica. PAH ovi su ubikvitarna jedinjenja. Prisustvo PAH ova u životnoj sredini javlja se kao posledica bilo prirodnih, bilo antropogenih uticaja. Prirodnim putem, izvesna količina PAH ova dospeva u biosferu kao posledica šumskih požara, vulkanskih erupcija, hidrotermalnih procesa, dok se neki od njih dobijaju i raspadanjem biljaka, gljiva kao i dejstvom bakterija. Međutim, iako neki od prirodnih načina nastanka mogu biti jako velikih razmera, najveće količine PAH ova potiču od delovanja antropogenog faktora. Najveć izvore zagađenja predstavljaju zapravo toplane i privatne
kuće koje se tokom zimskog perioda snabdevaju toplotnom energijom sagorevanjem čvstih goriva. Takođe, ogromne količine PAH ova potiču i od same prerade i proizvodnje nafte, koksa, katrana, asfalta i čađi. Saobraćaj, koji se uglavnom zasnova na korišćenju vozila sa motorima sa unutrašnjim sagorevanjem, predstavlja veliki izvor PAH ova. Velike količine ovih materija mogu se naći u zatvorenom prostoru kao posledica pripreme hrane, pušenja ili zagrevanja pomoću kerozinskih peći (Slika 3). Iako su PAH ovi svuda rasprostranjeni, njihove koncentracije su znatno veće u blizini samih izvora emisije. Koncentracije ovih jedinjenja su, dakle, znatno veće u urbanim nego u ruralnim i zabačenim oblastima. Kako se radi o lakoprenosivim, ubikvitarnim jedinjenjima, koja se mogu transportovati putem atmosfere, izvesne količine PAH ova mogu se naći i na udaljenim i nepristupačnim delovima Zemlje. Koncentracija PAH ova u vazduhu varira u opsegu od 5 do 200000 ng/m 3. Pretpostavlja se da su izvesne količine PAH ova formirane još u prvih nekoliko milijardi godina posle Velikog praska, zajedno sa formiranjem zvezda i egzoplaneta. Neke studije takođe ukazuju na to da PAH ovi čine značajan procenat ugljenika u svemiru.
Slika 3. Poreklo PAH ova u životnoj sredini Prisustvo PAH ova u površinskim vodama vezuje se za atmosferska taloženja i ispuštanje industrijskih otpadnih voda u akumulacije, kao i za ispiranje zagađenog zemljišta. Zbog niske rastvorljivost, koncentracija PAH ova u vodi je znatno manja, reda veličine 1000 ng/l.
Tokom vremena dolazi do akumuliranja PAH ova u vodi, vazduhu i zemljištu, nakon čega lako mogu da dospeju u lanac ishrane i do samog čoveka. S druge strane, izvesna količina PAH ova može se naći u hrani usled neadekvatne pripreme, ili kao posledica razgradnje organskih komponenata namirnice, o čemu se posebno mora voditi računa. 2.1.3. Mehanizam formiranja PAH ova Iako sam mehanizam nastajanja PAH ova nije u potpunosti razjašnjen, pretpostavlja se da u osnovi leže reakcije pirolize i pirosinteze. Sam proces počinje pri visokim temperaturama kada dolazi do delimične razgradnje na manje stabilne fragmente, najčešće radikale, koji dalje, simultano, međusobno reaguju stvarajući na taj način stabilna policiklična aromatična jedinjenja. Ovako dobijena jedinjenja su termostabilna. U najvećem broju slučajeva dolazi do pirosinteze produkata koji sadrže dve ili četiri ugljenične jedinice, kao to je slučaj sa etilenskim, odnosno butadienskim radikalima (Slika 4): Slika 4. Pirosinteza policikličnih aromatičnih ugljovodonika Kako su dobijena policiklična jedinjena termostabilna, a polazna jedinjenja nestabilna pri visokim temperaturama, to je udeo nastalih PAH ova veći pri višim temperaturama, oko 500 o C. Pri nižim temperaturama 100 150 o C, uz duži period nastajanja, može nastati izvesna količina, najčešće supstituisanih PAH ova (Larsen J. C., 2002.). 2.1.4. Toksičnost PAH ova Usled velike rasprostranjenosti PAH ova u svim delovima biosfere i njihovih specifičnih osobina, PAH ovi mogu veoma lako dospeti kako do mikroorganizama, tako i do kopnenih biljaka, vodenog živog sveta, gmizavaca, ptica, pa i sisara i dospeti u
njihov lanac ishrane. Efekti na živi svet su raznovrsni. Oni utiču na rast, razvoj, metabolizam, izazivaju formiranje i razvoj tumora, dovode do akutne toksičnosti, razvojne i reproduktivne toksičnosti, citotoksičnosti i genotoksičnosti. Mnoga toksikološka ispitivanja potvrdila su uticaj PAH ova u pogledu oštećenja DNK i izazivanja mutacija, što u nekim slučajevima može dovesti i do formiranja kancera. Sami PAH ovi su u suštini inaktivni, odnosno sa DNK reaguju metaboliti i supstituisani oblici PAH ova. Međutim, metabolizam PAH ova se odvija u višim organizmima. Na taj način se dobijaju jedinjenja veće rastvorljivosti u vodi, pa samim tim može doći do njihove lakše ekskrecije. Nažalost, prilikom metaboličke degradacije može doći i do formiranja reaktivnih jedinjenja koja sa DNK formiraju adukte koji sprečavaju normalno funkcionisanje organizma. Mutacije na DNK pod dejstvom metabolita PAH ova mogu dovesti do različitih poremećaja, ali tu se pre svega misli na nastanak raka (Air Quality Guidelines for Europe, 2010.). PAH ovi različitih struktura pokazuju različitu sklonost ka kancerogenom delovanju. Međutim, istraživanja su pokazala da nesupstituisani molekul treba da sadrži minimum četiri kondenzovana prstena kako bi pokazao kancerogeno delovanje. To ne znači da su svi PAH ovi sa četiri kondenzovana prstena kancerogeni, a posebno ne da pokazuju istu aktivnost. Aktivnost dodatno raste uvođenjem u strukturu nekih funkcionalnih grupa. PAH ovi koji su poznati po svojim kancerogenim, teratogenim i mutagenim svojstvima su: benzo[a]antracen i krisen, benzo[b]fluoranen, benzo[j]fluoranen, benzo[k]fluoranen, benzo[a]piren, benzo[ghi]perilen, koronen, dibenzo[a,h]antracen (C 20 H 14 ), indeno[1,2,3-cd]piren i ovalen. 2.1.5. Toksikokinetika Toksično delovanje PAH ova na ljudski organizm odvija se kroz nekoliko faza, kao što se može videti na Slici 5.
Slika 5. Šematski prikaz faza toksičnosti 1. Apsorpcija putem: a. pluća i respiratornog trakta udisanjem vazduha koji sadrži izvesne količine PAH ova u vidu aerosola ili sitnih čestica, b. gastro intestinalnog trakta uzimanjem kontaminirane hrane, c. kože prilikom neposrednog kontakta (IPCS, 1998). 2. Distribucija, kao posledica velike lipofilnosti PAH ova. Istraživanja pokazuju da se znatne količine PAH ova nalaze u organizmu u gotovo svim unutrašnjim organima, dok izrazite depoe čine organi bogati masnim tkivima i delovi gastrointestinalnog trakta (IPCS, 1998). 3. Metabolizam Za metabolizam PAH ova zaslužni su različiti enzimi, prvenstveno iz grupe oksidaza, uključujući NADH ili NADPH i prisustvo molekulskog kiseonika, kako bi se neaktivni oblik preveo u polarni hidroksilni ili oksi derivat. Prva reakcija je reakcija epoksidacije. Ukoliko se kao primer posmatra benzo[a]piren, kao odgovarajući epoksidni oblik dobija se odgovarajući 7, 8 eposkid, koji se pod dejstvom eposkidnih hidrolaza transformiše u odgovarajuće stereoizomerne dihidrodiole, (Slika 6) koji se dalje mogu oksidovati do 7, 8 dihidrodiola 9, 10 epoksida, a terminacija se vrši pomoću enzima citohrom P 450. Dobijeni diol epoksid se može javiti u četiri različita stereoizomerna oblika od kojih su neki kancrogeni. Nakon ovog stupnja, dobijeni epoksidi učestvuju u konjugaciji sa glutationom, posredstvom enzima glutation transferaze. Neproreagovali
epoksidi mogu se konvertovati u fenolna i diolna jedinjenja. Ovi metaboliti su nedovoljno rastvorni kako bi se mogli adekvatno izlučiti iz organizma pa dolazi do njihove akumulacije, ili reakcije sa glukuronskom ili sumpornom kiselinom kako bi se pospešilo njihovo izbacivanje iz organizma. Pored konjugovanja sa hidroksilatom, PAH ovi mogu biti podvrgnuti nizu reakcija oksidacije i hidroksilacije, pri čemu se mogu dobiti različiti derivati, poput difenola, triola, tetrola i pentola (Lundstedt S., 2003). Slika 6. Metabolizam benzo[a]pirena 4. Eliminacija putem fekalija i urina.
2.1.6. Degradacija PAH ova u životnoj sredini Degradacija PAH ova u životnoj sredini se odvija kroz niz bioloških, hemijskih i fotohemijskih procesa. Degradacioni proizvodi s jedne strane mogu smanjiti štetnost, smanjujući količinu PAH ova, ali s druge strane u toku procesa degradacije nastaju i drugi, potencionalno štetni produkti, koji takođe mogu da se akumuliraju (Slika 7). Slika 7. Degradacija PAH ova na površini zemljišta i u vodenoj sredini Koncentracija PAH ova u zemljištu se smanjuje zahvaljujući dejstvu mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice, koje mogu da dovedu do transformacije PAH ova do drugih organskih ili prostih neorganskih jedinjenja. Krajnji proizvod degradacije pod dejstvom mikroorganizama jesu ugljen dioksid i voda. Neki mikroorganizmi čak i koriste PAH ove kao izvor ugljenika i energije potrebne za njihovo funkcionisanje. Ostali organizmi prevode PAH ove u neka druga jedinjenja bez neke veće koristi za same organizme, pri čemu može doći do delimične degradacije (Lundstedt S., 2003.). Izvesne količine PAH ova u zemljištu bivaju degradirane abiotičkim procesima oksidacije ili putem fotohemijskih reakcija, na površini zemljišta. Većina slobodnih radikala potrebnih za iniciranje procesa oksidacije zapravo nastaju u procesima
fotohemijskih reakcija, dok se drugi dobijaju od neorganskih soli i oksida, posebno posredstvom gvožđa i mangana. Mehanizam delovanja se razlikuje u zavisnosti od primenjenog radikal inicijatora. Najčešći oksidansi su singletni kiseonika ( 1 O 2 ), organski peroksidi, vodonik peroksid, ozon i radikali, kao što su alkoksi radikali (RO ), peroksi radikal (RO 2 ) i hidroksi radikal (HO ). Ovim mehanizmom dobija se veliki broj intermedijera i krajnjih produkata. Finalni proizvodi uključuju smešu ketona, aldehida, hinona, fenola i karboksilnih kiselina. Fotohemijska degradacija često podrazumeva dobijanje istih produkata kao kod obične hemijske oksidacije PAH ova. 2.2. Tehnike analize PAH ova u uzorcima zemljišta PAH ovi predstavljaju veoma važne indikatore zagađenosti životne sredine, a pored toga su i veoma toksična jedinjenja, pa je neophodno stalno pratiti njihovu koncentraciju u uzorcima iz životne sredine i adekvatnim tretmanom je održavati na nekom optimalnom nivou. S obzirom na to da se PAH ovi mogu naći u svim delovima biosfere, različiti uzorci zahtevaju različit tretman i različite metode analize. Uopšteno govoreći postupak analize PAH ova sastoji se iz sledećih koraka (Khan Z. i ostali, 2005): 1. uzorkovanje i homogenizacija uzorka u cilju bolje ekstrakcije; 2. ekstrakcija koja se izvodi sa ciljem dobrog odvajanja PAH ova od matrice uzorka i prevođenja u odgovarajući medijum za dalju analizu, 3. prečišćavanje, kako bi se uklonile koekstrahovane nečistoće 4. instrumentalna analiza, koja se vrši kako bi se izvršilo odvajanje, identifikacija i kvantifikacija ispitivanih molekula u datom uzorku. 2.2.1. Uzorkovanje Pojedinačni uzorci zemljišta uzimaju se sondom ili ašovom na odgovarajućoj dubini u zavisnosti od mesta uzorkovanja (obradive površine, šume, put i sl.). Ašovom se izvadi grumen zemlje, a zatim se uz ivicu rupe ponovo zabode ašov pod uglom od 90º - od površine do odgovarajuće dubine. Pažljivo se izvadi ašov sa zemljom, tako da ona ostane na ašovu kada se položi na tlo. Potom se po zemlji koje je na ašovu nožem napravi kaiš, širine 3 4 cm po sredini ašova do njegovog vrha. Zemlja na ašovu levo i desno od kaiša se odbaci, a kaiš zemlje se ubaci u čistu kofu. Ukoliko se radi o većoj površini zemljišta, uzorci se uzimaju na više ravnomerno raspoređenih mesta na isti način i ubacuju u istu kofu. Zemlja u kofi se dobro izmeša, usitne se veće
grudve i odstrane se kamenje i biljni delovi. Nakon ponovnog mešanja zemlje u kofi u polietilensku vrećicu se stavi oko 0,5 1 kg reprezentativnog uzorka zemlje, a višak zemlje se baci. Uzorak se obeleži i dalje tretira (Slika 8). Slika 8. Uzorkovanje zemljišta Uzorci se zatim suše na vazduhu ili liofiliziraju, a mogu se koristiti i neka sredstva za sušenje. Ne preporučuje se sušenje na povišenim temperaturama jer može doći do isparavanja PAH ova. Čuvanje uzoraka zemljišta za analizu PAH ova vrši se na hladnom i tamnom mestu, u staklenim, dobro zatvorenim posudama. 2.2.2. Ekstrakcija U cilju pripreme uzoraka zemljišta za analizu PAH ova mogu se koristiti najrazličitije metode. Neke od najčešće primenjivanih metoda jesu metoda ultrazvučne ekstrakcije smešom rastvarača, ekstrakcija po Soxhlet u, mikrotalasna esktrakcija, ekstrakcija organskim rastvaračima na koloni, ekstrakcija superkritičnim fluidima, mikroekstrakcija čvrstom fazom. Prednosti i mane svake od metoda date su u Tabeli 3 (Joa K. i drugi, 2005.).
Tabela 3. Prednosti i nedostaci različitih metoda ekstrakcije pri pripremi uzoraka za analizu PAH - ova Metoda ekstrakcije Prednosti Mane Soxhlet Ultrazvučna ekstrakcija Mikrotalasna ekstrakcija Ekstrakcija velikom brzinom kretanja rastvarača Ekstrakcija superkritičnim fluidima Mikroekstrakcija čvrstom fazom Klasična i najčešće primenjivana metoda Dobre recovery vrednosti Male količine uzorka i kratko vreme potrebno za pripremu eksperimenta Jeftina Brza Jednostavna za izvođenje Dostupna u većini laboratorija Male količine rastvarača Jeftina Brza Dobre recovery vrednosti za analizu PAH ova Brza Male količine rastvarača Moguće pakovanje kolone bez naknadnog prečišćavanja Odlična selektivnost Brza Upotreba vrlo malih količina rastvarača, što je dobro sa aspekta očuvanja životne sredine Brza Jednostavna za izvođenje Dugo vreme analize Skupa, zahteva veliku potrošnju rastvarača Relativno niske recovery vrednosti za određivanje PAH ova u odnosnu na ASE i SPE metode Niska selektivnost Niže recovery vrednosti u odnosu na metodu po Soxhletu i ASE Niska selektivnost Posedovanje specifične opreme za njeno izvođenje Niska selektivnost Niske recovery vrednosti za HMW PAH ove Efikasnost odvajanja zavisi od matriceuzorka Posedovanje specifične opreme za njeno izvođenje Niska selektivnost Posedovanje specifične opreme za njeno izvođenje
2.2.3. Prečišćavanje Sve metode prečišćavanja uzoraka za analizu PAH ova mogu se podeliti u dve grupe i to na tehnike predfiltriranja, koje se koriste kako bi se uklonila veća količina biogenog materijala, zaostalog posle ekstrakcije i tehnike frakcionisanja, koje se koriste kako bi se ciljani analit odvojio od ostalih potencijalno ekstrahovanih organskih jedinjenja. Za uzorke koji sadrže jedinjenja u tragovima, kao što je to slučaj pri analizi PAH ova i njihovih degradacionih produkata, ova dva postupka se često kombinuju. Za prečišćavanje uzoraka za analizu PAH ova mogu se primenjivati adsorpciona hromatografija, hromatografija na koloni, ekstrakcija čvrstom fazom i tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) (Khan Z. i drugi, 2005.). Gotovo sve metode pripreme uzoraka, osim ekstrakcije čvrstom fazom (SPE) zahtevaju prečišćavanje, uz predpripremu uzoraka i odvajanje analita od matrice uzorka, u cilju boljeg odvajanja i uštede reagenasa potrebnih za ekstrakciju. Jedan od najjednostavnijih i relativno jeftinih metoda prečišćavanja jeste tankoslojna hromatografija (TLC) sa UV detekcijom (Luks-Betlej K., 1977.). HPLC tehnika ima najveću moć razdvajanja i reproduktivnost, a imaju i mogućnost povezivanja sa odgovarajućim detektorom čime se ujedno obezbeđuje i analiza uzoraka. Međutim, ukoliko se za analizu koristi neka druga tehnika, za prečišćavanje se koriste jednostavnije i jeftinije metode, poput hromatografije na koloni, tečno tečne ekstrakcije ili ekstrakcije čvrstom fazom. 2.2.4. Metode analize Polazeći od činjenice da su količine PAH ova u uzorcima veoma niske, same metode što pripreme uzoraka, što analize moraju biti veoma specifične i osetljive. Shodno tome, najširu primenu u analizi PAH ova imaju metoda tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i gasna hromatografija kuplovana sa masenim detektorom (GC/MS) (Khan Z. i drugi, 2005.). Kvantifikacija PAH ova u uzorcima se vrši pomoću kalibracione prave koje se konstruiše na osnovu rezultata dobijenih snimanjem serije standardnih rastvora. Standardni rastvori PAH ova moraju se čuvati na hladnom i tamnom mestu, dobro zatvoreni. Kao unutrašnji standardi koriste se supstance koje se kao takve ne nalaze u samom uzorku, pa najširu primenu imaju deuterisani analozi PAH ova, kao što su fenantren d10, krizen d12, perilen d12.
Za adekvatnu analizu primenom HPLC metode, moraju biti ispunjeni odgovarajući uslovi. Stacionarna faza treba biti, na primer oktadecilsilan (RP 18) ili neki specifični sorbent za PAH ove, dužina kolone treba da bude 15 25 cm, unutrašnja debljina maksimum 4 6 mm. Eluenti moraju biti degasifikovani, a eluiranje se mora vršiti najmanje pomoću dva rastvarača u sistemu polarno/nepolarno, u gradijentnom modu. Najčešće se eluiranje počinje sa 50% polarnog rastvarača u smeši, a završava eluiranjem čistim polarnim reagensom. Eluiranje traje oko 40 minuta.pre sledećeg injektovanja, mora se vršiti ispiranje, najmanje 5 10 minuta. Kako bi se dobili reprezentativni rezultati i bolja retenciona vremena vreme eluiranja i vreme ispiranja mora biti isto za svaki uzorak, a preporučuje se korišćenje autosemplera. Takođe, preporučena je upotreba termostatiranih kolona (10 30 o C), UV detektori, zbog karakterističnih linija spektara PAH ova na njihovim optimalnim talasnim dužinama. Detekcija se može izvršiti i upotrebom flourescentnog detektora. Zbog veće selektivnosti i osetljivosti, veću primenu u analizi PAH ova našla je metoda gasne hromatografije sa masenim detektorom (GC/MS). Dužina kolone unutrašnjeg prečnika od najviše 0,25 mm treba biti minimum 25 m. Stacionarna faza može da bude u opsegu od nepolarno do slabo polarne. Noseći gas koji se upotrebljava za ove analize je helijum. Preporučuje se korišćenje autosemplera. Temperatura kolone treba biti optimizovana u zavisnosti od očekivanih PAH ova u uzorku. 2.2.5.Gasna hromatografija Gasna hromatografija je metoda razdvajanje koja se veoma često koristi za razdvajanje i detekciju organskih jedinjenja. Uslov da bi se neka supstanca mogla ispitivati metodom gasne hromatografije jeste da je lako isparljiva i da je stabilna na temperaturi isparavanja. Kod ove metode kao mobilna faza, a ujedno i noseći gas, koristi se neki inertan gas, najčešće argon ili helijum, ili neki drugi gas koji ne reaguje sa analitom, dok kao stacionarna faza mogu poslužiti različiti adsorbensi i molekulska sita u koloni. Princip gasno hromatografske metode analize zasniva se na prolasku uzorka kroz kolonu u kojoj se vrši razdvajanje uzorka na komponente u zavisnosti od njihovih fizičkih i hemijskih osobina. Identifikacija komponenata smeše vrši se na osnovu retencionog vremena, odnosno vremena zadržavanja svake komponente na stacionarnoj fazi. Svaka supstanca ima svoje karakteristično vreme zadržavanja na odgovarajućoj koloni. Na kraju kolone nalazi se detektor koji registruje odvojene komponente uzorka prevodeći ih u električni signal i prikazuje ih u vidu hromatograma.
Gasni hromatogram sastoji se iz sledećih delova (Slika 9): boca sa nosećim gasom i regulatorom pritiska, autosempler, injektor, peć za regulisanje temperature, kolona, detektor, monitor ili štampač. Slika 9. Šema gasnog hromatograma Radi dobijanja boljih rezultata, pored dobre pripreme uzoraka, autosempler omogućava dobru ponovljivost i optimizaciju vremena, što zapravo predstavlja i osnovne prednosti autosemplera nad manuelnim uzorkovanjem. Za unošenje uzorka u kolonu koristi se injektor. U gasno hromatografskoj analizi koriste se dve vrste kolona i to: Pakovane kolone, koje su napravljene od nerđajućeg čelika ili stakla i inertnog punjenja presvučenog tečnom ili čvrstom stacionarnom fazom. Ove kolone imaju dužinu od 1,5 10 m i prečnik od 2 4 mm. Odabir stacionarne faze zavisi od vrste jedinjenja koje se analizira. Kapilarne kolone, koje karakteriše velika dužina (25 60 m) i mali prečnik (nekoliko desetih delova milimetra). Zidovi kolone obloženi su nekom
aktivnom materijom. Većina kapilarnih kolona je napravljenja od stopljenog silika gela sa poliimidnom oblogom. U gasno hromatografskoj analizi koriste se različite vrste detektora. Najširu upotrebu imaju plameno jonizacioni (FID) i termo provodljivi detektor (TCD). Oba ova detektora imaju širok opseg primene na različitim organskim jedinjenjima, u širokoj oblasti koncentracije. Kao detektor može se kloristiti i maseni spektrometar. On ima široku oblast primene, a njime se mogu detektovati analiti u opsegu koncentracija od 0,25 100 pg. 2.2.6. Masena spektrometrija Masena spektrometrija je veoma osetljiva analitička metoda koja se zasniva na pretvaranju ispitivanog uzorka u jonski snop i razdvajanju tog snopa u sastavne komponente na bazi njihovih odnosa mase i naelektrisanja (m/e). Maseni spektrometar sastoji se iz nekoliko osnovnih delova i to: sistema za uvođenje uzorka, jonskog izvora, u kome se proizvodi snop jona ispitivanog uzorka, masenog analizatora, u kome se vrši razlaganje jona na osnovu odnosa mase i naelektrisanja, detektora. Jonski izor je veoma važna komponenta masenog spektrometra. Njegova osnovna uloga je da proizvede jone iz atoma i molekula uzorka i da formira i ubrza jonski snop ka masenom analizatoru. On mora da stvori takav jonski snop čiji će sastav tačno predstaviti sastav materijala od koga je sastavljen uzorak. Ni jedan jonski izvor se ne može univerzalno koristiti i zbog toga postoji veliki broj različitih jonizacionih tehnika. Uopšteno gledano, tehnike jonizacije se mogu podeliti u dve osnovne grupe i to na jonizacione i desorpcione tehnike. Maseni analizator je osnovni deo masenog spektrometra, jer se pomoću njega ostvaruje primarna funkcija masene analize - razdvajanje pojedinih masa iz jonizovanog uzorka i omogućavanje merenja njihovih količina. Shodno tome, može se reći da maseni analizator ima dvostruki zadatak: da odvoji jone mase m od jona bliske mase m + Δm i da, zatim, fokusira izdvojeni snop jona. Postoji veliki broj različitih vrsta masenih analizatora, ali širu primenu nalaze sledeći: magnetni analizator sa jednostrukim fokusiranjem, analizatori sa dvostrukim fokusiranjem, anlizatori na bazi vremena preletanja (Time-of-Flight, TOF), kvadrupolni analizatori i jonska zamka.
Detekcija se najčešće izvodi električnim putem, tako što se meri jačina ukupne jonske struje. Prikupljanje podataka i snimanje masenih spektara može se vršiti jednim od dva metoda: SCAN podrazumeva snimanje kompletnog masenog spektra i SIM (Selected Ion Monitoring) u kome se prate samo odabrani joni. SCAN tehnika podrazumeva skeniranje mase u zadatom opsegu uz istovremeno praćenje retencionog vremena, čime se omogućava identifikacija analita. Zadati maseni opseg i brzina skeniranja hromatograma određuju vreme praćenja određene mase (dwell time). SIM tehnika se koristi u kvantitativnim određivanjima. Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti anliza SCAN metodom. SIM tehnikom se detektuju vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praćenja jona je veće pa se samim tim povećava i osetljivost čak od 100 do 1000 puta. Karakteristični joni, vreme početka snimanja (start time) i vreme praćenja jona (dwell time) biraju se na osnovu podataka dobijenih pomoću SCAN tehnike. Hromatogram se dobija kao zavisnost ukupne jonske struje sabrane tokom analize od vremena, a daje podatke o kvalitetu (retenciono vreme) i kvantitetu (površina pika) posmatrane komponente. 2.3. Pregled literature Prvenstveno zbog svoje toksičnost, a zatim i drugih osobina koje poseduju PAH ovi veoma je bitno pratiti njihovu koncentraciju u uzorcima iz životne sredine. Samim tim, postoji veoma veliki broj radova u kojima su se naučnici bavili ovom tematikom, što u Srbiji što širom sveta. Vremenom, razrađene su nove tehnike priprema samih uzoraka, ali i njihove analize. U poslednje vreme, glavno mesto u analizi zauzimaju baš gasnohromatografske metode sa masenim detektorom (GC/MS). U nekim radovima, čak, postoje i rezultati koji opisuju kako se određene vrste PAH ova ponašaju nakon određenih tretmana. Tako na primer Lundstedt u svom radu Analiza PAH ova i njihovih proizvoda transformacije u zagađenom zemljištu i postupci remedijacije prati koncentraciju PAH ova i njihovih derivata, posebno takozvanih oksi PAH ova, tokom primene različitih metoda remedijacije zemljišta. Dobijeni rezultati ukazuju na veoma dobru perzistentnost oksi PAH ova, na šta je veoma važno obratiti pažnju zbog njihove velike toksičnosti. Pored toga, eksperimenti rađeni na glistama pokazuju da se oksi PAH ovi lakše apsorbuju u živom tkivu od
samih PAH ova. Pod određenim uslovima sva tri ispitivana postupka remedijacije zemljišta (tretman u Bio Slurry reaktoru, dejstvo mikroorganizama i hemijski tretman Fentonovim reagensom) rezultirala su povećanjem sadržaja oksi PAH ova u zemljištu (Lundstedt S., 2003.). U radu PAH ovi antropogenog i biopedogenog porekla u koluvijalnom hidromorfnom zemljištu Zapadne Evrope autori Irena Atanassova i Gerhard W. Brummer ukazuju na to da PAH ovi kao što su benzo[a]antracen, benzo[b]fluoranten, benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren i indeno[1,2,3-cd]piren pretežno antropogenog porekla, dok su acenaften, fluoren, piren, dibenzo[a,h]antracen, naftalen i benzo[g,h,i]perilen pretežno biopedogenog porekla. Poreklo nastajanja fluorantena, krizena i fenantrena je mešovito (Tabela 4) (Atanassova I., Bru mmer G. W., 2004.). Tabela 4. Koncentracije PAH ova u uzorcima zemljišta Istraživanje sprovedeno u Nju Delhiju imalo je za cilj uporedno ispitivanje količine PAH ova u uzorcima zemljišta uzetim u blizini glavnih saobraćajnica i ruralnim oblastima. Ukupna količina PAH ova u uzorcima iz ruralnih oblasti bila je 886 ± 303 μg/kg, dok su uzorci iz gradskih oblasti sadržali čak 1062 9652 μg PAH/kg zemljišta. Strukturno gledano, dominantni PAH ovi u gradskim oblastima sadrže pet
konjugovana prstenova (više od 50% ukupnih PAH ova). S druge strane, ruralne oblasti su bogatije PAH ovima sa dva i tri konjugovana prstena (više od 50% zastupljenosti). Na osnovu odnosa sadržaja TOC (ukupni organski ugljenik) i ukupnih PAH ova zaključeno je da veliki broj vozila koristi naftu kao gorivo (Tabela 5) (Agarwal T., 2009.). Tabela 5. Koncentracije PAH ova u ruralnoj, odnosno gradskoj sredini Što se naše zemlje tiče, u radu Prisustvo teških metala, organskih jedinjenja i radioaktivnosti u uzorcima zemljišta iz Zapadne Srbije Dugalić i drugi istraživači došli su do zaključaka da je prosečna koncentracija PAH ova u uzorcima bila 1920 μg /kg, što je znatno više od maksimalne dozvoljene koncentracije u Srbiji, ali više od koncentracija koje propisuje Evopska Unija za zemljište na kome se uzgajaju kulture koje se koriste u ihrani (Tabela 6). Koncentracije ukupnih PAH ova su veoma visoke uprkos činjenici da neki od njih, kao što su benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren i dibenzo[a,h]antracen, uopšte nisu ni detektovani (Dugalić G. i ostali, 2010.).
Tabela 6. Koncentracije PAH ova u uzorcima zemljišta iz Srbije
3. Eksperimentalni deo 3.1. Faze eksperimentalnog rada Eksperimentalni rad obuhvatao je sledeće faze: 1. Priprema rastvora standarda, serije standardnih rastvora za kalibraciju i rastvora unutrašnjih standarda; 2. Priprema uzoraka za analizu metodom ultrazvučne ekstrakcije u sistemu heksan/aceton; 3. Prečišćavanje uzoraka i priprema za GC/MS analizu; 4. Analiza prečišćenih uzoraka primenom GC/MS tehnike. 3.2. Aparatura Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7000 Series Vaga, Shimadzu AX20 Ultrazvučno kupatilo J.P.Selectra, s.a. Barselona, Spain Centrifuga Sušnica Aparat za dejonizovanu vodu TKA MICROMED Vakuum uparivač 3.3. Pribor Erlenmajer sa čepom Kvantittativni levak Balon sa okruglim dnom Kiveta za centrifugu Vijale za GC Automatska pipeta Menzura Normalni sudovi Kleme, mufovi, stativi, prsten za levak 3.4. Reagensi Heksan for HPLC, Fluka, Spain
3. Eksperimentalni deo Aceton for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH PSA Primary secondary amine Selectra UCT Bulk Sorbents Al 2 O 3 Merck PAH Kit 601 N Supelco, Bellefonte, Pennsylvania; koji sadrži: acenaftilen, antracen, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren, acenaften u čvrstom obliku Deuterisani standardi (krizen d10, acenaften d10) Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, u obliku čvrste supstance Surogat deuterisani Standard Mix 4 mg/ml - Supelco, Bellefonte, Pennsylvania; koji sadrži 2-hlorfenol-3,4,5,6-d4, 1,2-dihlorbenzen-d4, 2- fluorbifenil, 2-fluorfenol, nitrobenzen-d 5, fenol-d6, p-terfenil-d14, 2,4,6- tribromofenol 3.5. Ultrazvučna ekstrakcija Kao metoda izbora za pripremu uzoraka za analizu u ovom radu uzeta je metoda ultrazvučne ekstrakcije u sistemu rastvarača heksan/aceton (1:1, v/v). Odmerena količina uzorka zemljišta (5 g) prenese se u erlenmajer sa zapušačem i doda se 15 ml smeše rastvarača. Ekstrakcija se vrši 3 puta po 15 minuta na ultrazvučnom kupatilu, sa po 15 ml smeše rastvarača. Kako bi odvajanje bilo što bolje preporučuje se da se nakon druge ekstrakcije procedi deo količine ekstrakta u balon sa okruglim dnom i nastavi ekstrakcija sa novom porcijom rastvarača. Treba voditi računa da ne dođe do zagrevanja vode u ultrazvučnom kupatilu u toku ekstrakcije. Ukoiko do zagrevanja doe, između dve serije ekstrakcije zameniti vodu. Nakon završene ekstrakcije, procediti ekstrakt u balon sa okruglim dnom. Vršiti uparavanje dobijenog esktrakta do suva na vakuum uparivaču, podešenom na 40 o C. Nakon zavšenog uparavanja kvantitativno preneti ostatak nakon uparavanja u kivetu, tako da ukupna zapremina ekstrakta bude 5 ml. Prebacivanje u kivetu vršiti brzo, a kivetu je potrebno dobro zatvoriti, jer može da dođe do gubitaka usled isparavanja. 3.6. Prečišćavanje uzoraka U kivetu u kojoj se nalazi 5 ml ekstrakta dodati 250 mg PSA i 500 mg Al 2 O 3 (5%), pripremljenog na odgovarajući način. Al 2 O 3 (5%) se priprema tako što se najpre vrši njegova aktivacija sušenjem u sušnici na 150 o C, a nakon toga njegova deaktivacija
3. Eksperimentalni deo dodatkom vode u količini od 0,5 ml na svakih 10 g Al 2 O 3. Tako dobijeni Al 2 O 3 se fino homogenizuje u avanu. Za pripremu serije standardnih rastvora u kivete dodati redom 50, 100, 250 i 500 μl standardnog rastvora koncentracije 1619,5 μg/ml i redom 950, 900, 750 i 500 μl ekstrakta slepe probe. Dodati 50mg PSA i 100 mg pripremljenog Al 2 O 3. U kivete sa uzorcima, odnosno standardnim rastvorima dodati 200μL unutrašnjeg standarda koncentracije 80 μg/ml i 100 μl surogat standarda koncentracije 100 μg/ml. Kivete energično mućkati u toku 5 minuta a zatim centrifugirati 10 minuta na 8000 obrtaja u minuti. Nakon završenog centrifugiranja pažljivo preneti 0,6 ml ekstrakta u vijalu za GC snimanja. U ovom radu korišćen je p terpfenil d14 kao surogat standard. Pripremljeno je 25 ml rastvora koncentracije 100 μg/ml odmeravanjem u normalni sud 0,69 ml osnovnog rastvora p terpfenila d14, koncentracije 3609 μg/ml. Deuterisani rastvori standarda koji su korišćeni su rastvori acenaftena d10 i krizena d12, koncentracije 2500 μg/ml. Ovi rastvori dobijeni su odmeravanjem po 25 mg acenaftena d10 i krizena d12 i razblaživanjem do 10 ml. Od ovog osnovnog rastvora pripremani su rastvori koncentracije 80 μg/ml razblaživanjem 320 μl osnovnog rastvora do 10 ml. Priprema serije standardnih rastvora vrši se odmeravanjem određenih količina standardnih rastvora PAH ova u normalne sudove i daljim razblaživanjem smeše do odgovarajuće zapremine. Koncentracije dodatih standardnih rastvora PAH ova su prethodno preračunate i predstavljene su u Tabeli 7. Tabela 7. Koncentracije serije standardnih rastvora PAH - ova PAH Standardni rastvori odgovarajućih koncentracija koncentracija (μg/ml) S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 Acenaftilen 3.846 19.231 38.461 96.154 192.308 Antracen 0.192 0.961 1.923 4.808 9.615 Benzo[a]antracen 0.004 0.019 0.038 0.096 0.192
3. Eksperimentalni deo Benzo[a]piren 0.019 0.096 0.192 0.481 0.9615 Benzo[b]fluoranten 0.004 0.019 0.038 0.096 0.192 Benzo[ghi]perilen 0.019 0.096 0.192 0.481 0.961 Benzo[k]fluoranten 0.004 0.019 0.038 0.096 0.192 Krizen 0.192 0.961 1.923 4.808 9.615 Dibenzo[ah]antracen 0.038 0.192 0.384 0.961 1.923 Fluoranten 0.192 0.961 1.923 4.808 9.615 Fluoren 0.385 1.923 3.846 9.615 19.231 Indeno[1,2,3-cd]piren 0.038 0.192 0.384 0.961 1.923 Naftalen 3.846 19.230 38.461 96.154 192.308 Fenantren 0.192 0.961 1.923 4.808 9.615 Piren 0.192 0.961 1.923 4.808 9.615 Acenaften 3.846 19.231 38.461 96.154 192.308 3.7. Analiza U ovom radu, za analiziranje pripremljenih uzoraka, zbog prednosti koje poseduje, korišćena je metoda gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom. Snimanje je vršeno na aparatu Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7000 Series (Slika 10), pod sledećim radnim uslovima: noseći gas He temperatura 75 C prvih 3 minuta a zatim povećanje temperature od 6 C/min do temperature od 300 C 10 minuta pritisak 15.44 psi protok gasa 3 ml/min snimanje vršeno u SIM modu
3. Eksperimentalni deo Slika 10. Triple Quadrupole GC/MS system Agilent 7000 Series 3.8. Obrada dobijenih rezultata Za obradu dobijenih rezultata analize korišćen je program Mass Hunter. Analiza i obrada dobijenih rezultata odvija se kroz sledeće korake: 1. Postavljanje nove serije uzoraka i standarda 2. Postavljanje nove metode kvantifikacije, koja se zasniva na selekciji standarda sa najvećom koncentracijom 3. Odabir željenih komponenti 4. Podešavanje parametara za kvantifikaciju metode 5. Automatska kvantifikicaija i čuvanje rezultata.
3. Eksperimentalni deo 1. Postavljane nove serije uzoraka i standarda U programu za kvantitativnu analizu (Q TOF) iz File sekcije odabrati radnju New Batch i iz foldera odabrati željenu datoteku. Nakon toga iz sekcije File/ Add Sample odabrati željene uzorke za analizu (Slika 11). Slika 11. Postavljane nove serije uzoraka i standarda 2. Postavljanje nove metode kvantifikacije, koja se zasniva na selekciji standarda sa najvećom koncentracijom Za postavljanje nove metode bira se standard sa najvećom koncentracijom, markiranjem kursorom miša, a zatim se odabere sekcija Method/Edit.
3. Eksperimentalni deo 3. Odabir željenih komponenti U okviru ovog koraka biraju se željeni podaci za kvantifikaciju i odgovarajući unutrašnji standardi. Odabirom sektora Method Setup Task/ MRM Compound Setup može se imati uvid u podatke o jedinjenjima i jonima koji se ispitujuo. Ukoliko se želi uvid u retenciona vremena svake komponente bira se sekciju Method Setup Task/ Retention Time Setup. U ovom odeljku mogu se izvršiti iznovna podešavanja u vezi sa retencionim vremenima. Za odabir unutrašnjih standarda za svaku od komponenata koja se analizira u odeljku ISTD Compound Name iz sekcije Method Setup Task/ ISTD Setup odabere se odgovarajući unutrašnji standard i u odeljku ISTD Concentration unese njegova koncentracija. 4. Podešavanje parametara za kvantifikaciju metode Da bismo se izvršila kalibracija u odeljku Method/ Create Levels from Calibration Samples za seriju standardnih rastvorapotrebno je podesiti željene koncentracije standarda. U slučaju da neki od standarda imaju istu koncentraciju, Mogu se kopirati vrednosti koncentracija odabirom jedinjenja sa istim koncentracijama u odeljku Method/ Copy Calibration Levels to. Ukoliko su na ovaj način uneti svi potrebni podaci, novu metodu možemo validirati i sačuvati odabirom opcije Validate iz sekcije Save/ Exit. Podešavanje integratora vrši se u odeljku Method/ Edit/ Method Tasks/ Advanced Tasks. Za sve uzorke je neophodno podesiti MS MS metod integracije i zapamtiti podešavanje. 5. Analiza i čuvanje rezultata Analiza serije rezultata vrši se klikom na dugme Analyze Batch, dok se čuvanje podataka postiže odabirom komande Save Batch iz File sekcije (Slika 12). Ovako dobijeni rezultati se dalje mogu koristiti i obrađivati.
3. Eksperimentalni deo Slika 12. Analiza i čuvanje rezultata
4. Rezultati i diskusija Cilj ovog master rada bio je određivanje koncentracije određenih PAH ova u uzorcima zemljišta i biljnom materijalu primenom GC/MS metode. PAH ovi su iz uzoraka zemljišta ekstrahovani sistemom rastvarača heksan aceton, uz pomoć ultrazvuka. Za ovaj rad ispitivana je koncentracija PAH ova, koje Evropska Unija propisuje kao važne pokazatelje zagađenja životne sredine: acenaftilen, antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen (93%), dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren. Na osnovu hromatograma dobijenih snimanjem uzoraka zemljišta (Slike 13 21), pripremljenim na adekvatan način, može se izvršiti kvalitativna analiza. Upoređivanjem dobijenih retencionih vremena sa tabličnim vrednostima može se zaključitikoji PAH ovi se nalaze u ispitivanim uzorcima (Tabela 8). Tabela 8. Retenciona vremena analiziranih PAH - ova PAH Retenciono vreme (min) Acenaftilen 18,962 Antracen 24,493 Benzo[a]antracen 34,577 Benzo[a]piren 39,307 Benzo[b]fluoranten 38,263 Benzo[ghi]perilen 43,992 Benzo[k]fluoranten 38,347 Krizen (93%) 34,577 Dibenzo[a,h]antracen 43,182 Fluoranten 28,900 Fluoren 20,731 Indeno[1,2,3-cd]piren 43,046
4. Rezultati i diskusija Naftalen 12,259 Fenantren 24,318 Piren 29,717 Acenaften 18,962 Slika 13. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 1 u SIM modu Slika 14. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 2 u SIM modu Slika 15. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 3 u SIM modu Slika 16. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 4 u SIM modu
4. Rezultati i diskusija Slika 17. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 5 u SIM modu Slika 18. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 6 u SIM modu Slika 19. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 7 u SIM modu Slika 20. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 8 u SIM modu
4. Rezultati i diskusija Slika 21. Hromatogram dobijen snimanjem uzorka 9 u SIM modu Na Slikama od 13 do 21 prikazani su hromatogrami za svaki od uzoraka, snimljenih u SIM modu. Kao što se može primetiti primenjene tehnike pripreme uzoraka i prečišćavanja, kao i parametri snimanja uzoraka su odabrani tako da dovedu do dobrog odvajanja i dobijanja čistih pikova. Jedini problem se javlja kod benzo[a]pirena i krizena koji se javljaju na jako bliskim retencionim vremenima, pa dolazi do spajanja njihovih pikova, što predstavlja problem i dalje u kvantitativnoj analizi, jer se kvantifikacija vrši za oba jedinjenja zajedno. Ovaj problem mogao bi se rešiti upotrebom druge kolone, kao što je na primer HP DB5 kolona. Takođe, može se uočiti i da je bazna linija kod svih hromatogama ravna, odnosno da ne postoje onečišćenja koja bi dovela do opterećenja hromatograma i pogrešnih rezultata. Ovo ukazuje na to da je sama priprema uzoraka bila adekvatno sprovedena. Kvantitativna analiza Kvantitativna analiza PAH ova u uzorcima izvršena je na osnovu kalibracionih pravi dobijenih analizom serije standardnih rastvora. U tabeli (Tabela 9) su prikazane jednačine pravih i R 2 vrednosti za svaki analizirani PAH.