Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod E. Teske (1)

GENERAL COMMISSIONED PAPER Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod E. Teske (1) ZHRNUTIE Vo veterinárnej medicíne je záujem o techniku cytologického vyšetrenia náterov získaných tenkoihlovou aspiráciou (FNAB - fine ne-- edle aspiration) skôr záležitosťou ostatného obdobia. Jeden by si dokonca mohol pomyslieť, že sa jedná o techniku aktuálne vyvinutú, ale nič nie je vzdialenejšie pravde ako takéto tvrdenie. Už v roku 1851 popísal švajčiarsky patológ H. Lebert metódu diagnostickej aspirácie vo svojej knihe Traité des Maladies cancéreuses et des Affections curables confondues avec le Cancer :... a exploratívna aspirácia môže vyvrátiť všetky pochybnosti. Ak sa jedná o hnisavú alebo seróznu cystu, z ihly voľne odchádza tekutý obsah, ak však punktujeme kancerózny obsah, ihla bude obklopená pevnejšími štruktúrami a menej pohyblivá. Ak získame nejaký materiál, jedná sa o tenkú vrstvu, ktorú keď vyšetríme makroskopicky a v prípade potreby mikroskopicky, javí sa ako rakovina. Ešte o pár rokov skôr popísal berlínsky fyziológ Johannes Müller po prvýkrát cytologické kritériá, ako odlíšiť benígne od malígneho. Napokon dnes, po vyše jeden a pol storočí, začína byť táto technika populárna aj vo veterinárnej medicíne. Výhody a nevýhody FNAB Cytologické vyšetrenie náteru získaného pomocou FNAB má niekoľko nevýhod oproti histologickému vyšetreniu bioptátov, ale má aj rôzne výhody. Rozhodovanie o tom, kedy odobrať aspiráty alebo chirurgicky biopsie treba zvažovať veľmi opatrne. Pozitívna prognostická hodnota cytológie je vyššia ako negatívna. Inými slovami, neprítomnosť malígnych buniek v cytologickom preparáte je menej spoľahlivá ako ich prítomnosť. Aspiračnú ihlu môžeme, bohužiaľ, zaviesť tesne popri tumore, namiesto do tumoru, alebo do nekrotickej, alebo zápalovej časti tumoru, alebo môže tumor pozostávať z buniek, ktoré sa ťažko aspirujú. Všetky tieto skutočnosti môžu viesť k falošnému tumor negatívnemu výsledku. Ďalším limitom FNAB je nedostatok príležitostí študovať histologickú štruktúru lézií. Atraktívnosť FNAB spočíva v jej výhodách. Je to metóda, ktorá sa dá ľahko naučiť. Je lacná a rýchla, výsledky môžeme mať k dispozícii do pol hodiny. FNAB môžeme previesť bez anestézie, takže môže byť súčasťou klinického vyšetrenia. Nátery nemusia byť spracované hneď, ale môžeme si ich odložiť na neskôr. Pomocou FNAB môžeme získať viaceré aspiráty z jednej lézie, čo je výhodou v procese sledovania pacienta počas jeho liečby. Riziko metastáz spôsobených FNAB je tak nízke, že ho pokladáme za zanedbateľné. Indikácie na FNAB Na základe cytologického vyšetrenia vzoriek získaných aspiráciou je zväčša možné odlíšiť zápalové tkanivo od tumoru, odlíšiť akútny zápal od chronického a rozlíšiť medzi benígnym a malígnym tumorom. Taktiež je možné identifikovať rôzne etiologické príčiny infekčného zápalu (baktérie, plesne alebo parazity ako Toxoplazma alebo Leishmania), rovnako ako odlíšiť mnohé typy tumorov. Kožné a podkožné lézie, ktoré nie je možné jednoznačne diagnostikovať klinickým vyšetrením, sú výbornou indikáciou na aspiračnú biopsiu. Pomocou FNAB dokážeme mnohé kožné tumory nielen pomenovať, ale aj klasifikovať (ako napr. mastocytóm, histiocytóm, karcinóm squamóznych buniek, karcinóm bazálnych buniek a melanóm). Naopak, v prípade mezenchymálnych proliferácií je často ťažké odlíšiť reaktívny proces od tumorózneho. Chronický zápalový proces, prítomnosť malignity a typ nádoru (fibróm/fibrosarkóm, hemangióm/he- (1) Department Clinical Sciences Companion Animals, Veterinary Faculty, Utrecht University PO Box 80.154, NL- 3508 TD Utrecht. E-mail: e.teske@uu.nl

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod - E. Teske mangiosarkóm) je zavše neurčitý. V mnohých prípadoch je možné zájsť len po diagnózu mezenchymálna proliferácia. Nádory mliečnej žľazy môžu takisto predstavovať problém, najmä pre neskúseného cytológa, keďže podráždené tkanivo mliečnej žľazy často obsahuje atypické bunky. Naopak, viaceré abnormality lymfatických uzlín (vrátane metastáz) môžeme poľahky diagnostikovať. Pre skúsených cytológov sa vždy otvárajú nové možnosti diagnostiky pomocou FNAB: prostatické zmeny, zmeny v interstíciu pľúc, klinické podozrenia na zmeny v pečeňovom alebo slezinnom parenchýme. Pre tieto indikácie však, bohužiaľ, existujú aj vyššie riziká komplikácií. Obzvlášť perkutánne biopsie pľúc by nemali byť prevádzané, pokiaľ vyšetrujúci nie je dostatočne pripravený zvládať možné komplikácie. Technika FNAB Materiál potrebný k FNAB je extrémne jednoduchý: niekoľko podložných sklíčok s mliečnym okrajom, 10 ml jednorazová striekačka (prípadne menšia 5 ml, podľa komfortu vyšetrujúceho) a tenká ihla 22G (obr. 1). Je dôležité používať sklíčka s mliečnym okrajom, nakoľko na tento okraj sme schopní označiť vzorky pomocou obyčajnej uhlíkovej ceruzky/mikrotužky/verzatilky. Obzvlášť pri odbere viacerých vzoriek naraz môže byť pomiešanie vzoriek veľmi nešťastné (jednak pre lekára a zároveň pre pacienta). Riziko pomiešania vzoriek je omnoho vyššie v prípade, kedy si vzorky sami mikroskopicky nevyšetrujete, ale odosielate ich na posúdenie do externého laboratória. Najlepší spôsob označovania vzoriek je uhlíková ceruzka, pretože túto na rozdiel od atramentu nezmyjete alkoholom, ktorý sa pri farbení preparátu používa. V humánnej medicíne sa odporúča na aspiráciu Obr. 1 Minimálne vybavenie potrebné pre FNAB: niekoľko podložných sklíčok s matným okrajom, 10 ml jednorazová striekačka a tenká (22G) ihla. Obr. 2 Špeciálny FNAB nástroj (Cybio ) vyvinutý pre veterinárnu medicínu. používať držiaky. Sú zväčša stavané na 20 ml striekačku, ktorá je podľa nás menej pohodlná. Zároveň vzdialenosť od pacienta je príliš veľká, čo v prípade neposedných pacientov vo veterinárstve môže byť veľkou nevýhodou. Použitie malej striekačky má tú nevýhodu, že piestik treba vytiahnuť omnoho viac na dosiahnutie potrebného vákua. Striekačka s objemom 10 ml sa javí byť dobrým kompromisom. Momentálne je už aj vo veterinárnej medicíne dostupný špeciálny inštrument na FNAB (Cybio ), ktorý sa ľahko používa a podáva dobré výsledky (obr. 2). Niektorí odporúčajú pri tenkoihlovej biopsii používať iba techniku kapilárneho odberu, ktorá je jednoduchšie manévrovateľná a môže spôsobovať menej kontaminácie krvou. Obzvlášť pri hemopoetických a epiteliálnych útvaroch to môže byť efektívna metóda, avšak pri mezenchymálnych tkanivách je jej pole rozsahu menšie ako pri FNAB. Je chybou si myslieť, že hrubšou ihlou získame lepšie vzorky. Väčšou ihlou aspirujeme väčšiu masu tkaniva. Tieto sa ťažšie vybavujú z ihly na sklíčko, ľahko sa poškodia a je ich ťažšie farbiť a následne posudzovať. Navyše do hrubšej ihly ľahšie aspirujeme aj kontaminujúcu krv. Skúsenosti preukázali, že ihla s diametrom 22G poskytuje najlepšie výsledky. Iba v prípade, keď touto ihlou nezískame z lézie žiaden materiál, stojí za to použiť o trošku hrubšiu ihlu. Anestézia je pri FNAB len zriedkavo potrebná. Hoci je niekedy aspirácia z končatín a hlavy bolestivá, ani pri týchto lokalitách nie je zväčša potrebné siahať po akejkoľvek forme anestézie. Pacienta je len potrebné dokonale fixovať majiteľom alebo asistentom. Po oholení a dezinfekcii miesta odberu jednou rukou fixujeme léziu a v druhej ruke držíme striekačku s ihlou, ihlou prenikáme do lézie. Podtlak 1-2 ml je zväčša dostatočný na aspiráciu potrebného množstva materiálu. Ihlou pohybujeme vo vnútri masy vo viacerých smeroch bez toho, aby sme ju vytiahli, tak, aby sme získali čo najreprezentatívnejšiu vzorku daného útvaru. V kónuse ihly často nevidíme žiaden alebo vidíme len malé množstvo odobratej vzorky. Ak náhle spozorujeme prítomnosť krvi, je najlepšie začať odznova, vziať si novú ihlu a striekačku, nakoľko prílišná kontaminácia krvou zabraňuje adekvátnemu posúdeniu vzorky. Pred vytiahnutím ihly z vyšetrovanej lézie je potrebné uvoľniť podtlak a nechať piestik, aby sa vrátil do svojej pozície, v opačnom prípade by po vytiahnutí ihly došlo k vsunutiu odobratej vzorky do striekačky a takáto vzorka sa len veľmi ťažko získava na ďalšie vyšetrenie. Následne odpojíme ihlu od striekačky, nasajeme do prázdnej striekačky niekoľko ml vzduchu, nasadíme ihlu naspäť a jej obsah vyfúkneme tlakom na podložné sklíčko. Bolo popísaných množstvo metodík, ako správne zhotoviť náter z aspirátu. Môžeme použiť druhé podložné sklíčko, ktorým prekryjeme vzorku, pootočíme a sklíčka zase oddelíme a získame tak dve podložné sklíčka so vzorkou. Získanú vzorku môžeme taktiež opatrne roztiahnuť po sklíčku pomocou ihly alebo čepieľky. Týmito metódami je však často zničené veľké množstvo buniek. Tomu sa môžeme vyhnúť tak, že cytologický náter zhotovíme rovnako ako krvný náter. Pomocou druhého sklíčka sa pod uhlom 45 priblížime k vzorke na dotyk a následne jedným ťahom roztiahneme materiál pozdĺž celého podložného sklíčka pomocou zadnej hrany druhého sklíčka. Ak má vzorka hlienovitý charakter, rýchlosť ťahu musí byť výrazne pomalšia ako

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 pri vzorkách vodnatého charakteru. Z každého tumoru odporúčame odobrať viacero vzoriek. Ak je tumor veľký, odoberte vzorky zo stredu aj z okrajov tumoru. Zvýšite si tým šancu získať reprezentatívnu vzorku. Na okraji tumoru je menšia pravdepodobnosť získania potrebných buniek, avšak správne odobratý aspirát je potom reprezentatívnejší, nakoľko rýchlorastúce nádory môžu podliehať vo svojom centre nekróze. Rovnaké platí aj pre lymfatickú uzlinu invadovanú nádorom. Pri generalizovanej lymfadenopátii je potrebné odobrať vzorky z viacerých lymfatických uzlín, nakoľko sú tieto tak nekrotické, že dobrá cytologická interpretácia ani nie je možná. Na dôvažok treba uviesť, že mandibulárne lymfatické uzliny sú menej použiteľné na odbery vzoriek, nakoľko tieto sú takmer vždy reaktívne v dôsledku rôznych, aj drobných patológií v ústnej dutine. Z tohto dôvodu môže byť skutočná príčina lymfadenopátie falošne maskovaná. Odtlačková cytológia Na rozdiel od FNAB hrčiek a orgánových tkanív, cytologické preparáty povrchových lézií môžeme zhotoviť aj niektorou z nasledujúcich metód. I. Priamy odtlačkový preparát Priamy odtlačkový preparát môžeme získať z lézií, ako sú vredy, exudatívna dermatitída, a z chirurgicky odstráneného tkaniva. Z kožných lézií získame preparát priložením podložného sklíčka a jemným pritlačením na kožu. Jednou z možností je aj občerstvenie lézie jemným zoškrabaním pomocou čepieľky. Odtlačkový preparát z chirurgického materiálu získame najlepšie tak, že najprv čepieľkou odrežeme tenkú povrchovú vrstvu v mieste plánovaného odtlačku, gázou následne odsajeme vzniknuté krvácanie a takto pripravenú plochu jemne odtlačíme na sklíčko. Odporúča sa vždy zhotoviť niekoľko odtlačkových preparátov z jednej lézie. Ak odtlačky obsahujú málo buniek a majú tak nízku diagnostickú hodnotu, môžeme si pomôcť tak, že povrchovú léziu zoškrabeme čepieľkou a z nej potom zoškrabaný materiál prenesieme na sklíčko a zhotovíme z neho náter. II. Tampónová metóda Z lézií, ktoré sa nachádzajú v nose, uchu, ale taktiež na mukokutánnych spojoch, môžeme odoberať vzorky pomocou ušného tampónu. Materiál treba rozotrieť na sklíčko bezprostredne po odbere, inak tampón vyschne. III. Priamy ster Z povrchových alebo kožných lézií, ktoré obsahujú vezikuly, pustuly a pod., môžeme cytologické nátery poľahky zhotoviť zoškrabaním lézie čepieľkou a následne rozotrieť na sklíčko. V prípade vezikúl a pustúl je však často lepšie tieto otvoriť pomocou sterilnej čepieľky alebo ihly a odobrať materiál priamo z lézie alebo odtlačením materiálu, ktorý sa nachádza pod povrchovou škrupinou pustuly či vezikuly. Manipulácia s náterom Po zhotovení cytologického náteru volíme metódu ďalšieho spracovania podľa toho, akým spôsobom budeme preparát farbiť. Pri farbení podľa Papanicolau musíme náter okamžite fixovať (pomocou fixačného spreja alebo v alkohole). Pre Tabuľka 1 Typ farbenia Počet nádobiek Čas farbenia Papanicolau 24 35 min May-Grünwald Giemsa 3 22 min Hemacolor 3 0,5 min Tabuľka 2 Farbenie podľa Papanicolau 1. alkohol 70 % 20 s 13. alkohol 80 % 20 s 2. alkohol 50 % 20 s 14. alkohol 96 % 20 s 3. destilovaná voda 20 s 15. Orange G 3 min 4. Harris hematoxylín 6 min 16. alkohol 96 % 20 s 5. destilovaná voda 20 s 17. alkohol 96 % 20 s 6. 0,25 % HCl 3 kvapky 18. EA 50 5 min 7. tečúca voda 20 s 19. alkohol 96 % 20 s 8. lithium carbonate 1 min 20. alkohol 96 % 20 s 9. tečúca voda 20 s 21. alkohol 96 % 20 s 10. destilovaná voda 20 s 22. alkohol 100 % 20 s 11. alkohol 50 % 20 s 23. xylol 5 ponorení 12. alkohol 70 % 20 s 24. xylol 15 min

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod - E. Teske Hemacolor Roztok 1 Roztok 2 Roztok 3 Oplach v buffrovacom roztoku ph 7,2 Tabuľka 4 5 x 1 s 3 x 1 s 6 x 1 s Obr. 3 Rýchle farbenie Hemacolor : alkoholový fixátor, červené farbenie, modré farbenie a buffer. farbenia spoločne nazývané podľa Romanowského (Giemsa, May-Grünwald Giemsa, Hemacolor, DiffQuick ) je potrebné preparát nechať uschnúť na vzduchu. Usušené preparáty je možné aj dlhodobo skladovať pred samotným farbením (obr. 3). Pre farbenia podľa Romanowského nie je možné preparát fixovať fixačným sprejom, alkoholom, zohriatím alebo formalínom. A podložné sklíčko, samozrejme, nesmieme zakryť krycím sklíčkom. Ako bude popísané nižšie, existuje viacero techník farbenia preparátov (tab. 1). Farbenie podľa Papanicolau (tab. 2) je veľmi prácne a časovo náročné. Jeho výhodou je, že poskytuje veľmi dobrý detail jadrových štruktúr. Taktiež veľmi dobre zobrazuje stupeň keratinizácie buniek. Naopak, cytoplazmatické granuly nefarbí vôbec alebo len minimálne. Jednak z literatúry, ako aj našich osobných skúseností sa nám farbenia podľa Romanowského javia ako najlepšie aplikovateľné pre veterinárnu klinickú prax (tab. 3 a 4). Tieto farbenia sú vhodné na zobrazenie cytoplazmatických inklúzií a mikroorganizmov. Okrem týchto všeobecných farbení poznáme mnoho ďalších špeciálnych farbení. Príkladom je farbenie obsahujúce kyselinu rubeánovú na potvrdenie prítomnosti medi (napr. v pečeňových bunkách). Pre tieto farbenia sú dostupné viaceré učebnice. Základné princípy interpretácie cytologických preparátov Skúsený cytológ môže vyšetrením preparátu stanoviť diagnózu už za niekoľko sekúnd. So svojimi schopnosťami má vytvorený určitý rozoznávací vzor. Pri náročných preparátoch vedie systematický prístup k rýchlejšiemu stanoveniu diagnózy. Toto jednoznačne platí pre začínajúceho alebo menej skúseného cytológa. V tomto texte sú uvedené návody, ako postupovať pri vyšetrovaní preparátov získaných aspiráciou alebo ako odtlačkový. Na druhej strane si treba uvedomiť, že nie je možné v jednom článku obsiahnuť všetky cytologické diagnózy. Pre tých, ktorí si po prečítaní tohto textu chcú zvýšiť svoju odbornosť v tejto oblasti, odporúčame referencie na konci článku. Tento článok sa zameriava na vyšetrovanie cytologických preparátov. V prvom rade treba pochopiť, že kvalita preparátu je životne dôležitá pre stanovenie diagnózy. V cytológii je vzorka všetko: hodnotíš smeti, výsledkom je smetie (V. Perman, 1984). Dobrá technika odberu, dobrá fixácia náteru a dobré farbenie preparátu sú esenciálne. No a, samozrejme, správna technika mikroskopovania s kvalitným mikroskopom je veľmi dôležitá. Odhliadnuc od možnosti zlej techniky odberu vzorky, cytológia má aj ďalší limitujúci faktor zmienený vyššie: negatívny nález (napr. tumor negatívny) má menšiu výpovednú hodnotu ako pozitívny nález. Ťažký zápal alebo nekróza vo vnútri nádoru, alebo nesprávna technika odberu môžu viesť k falošne negatívnemu výsledku. Tento aspekt treba mať vždy na zreteli. A tak ako pri všetkých diagnostických technikách, tak aj pri cytológii sa odporúča brať do úvahy pravdepodobnosť cytologickej diagnózy v kontexte klinickej diagnózy a neposudzovať ju samostatne. Vyšetrenie cytologického preparátu má tri fázy. Prvou je určiť typ tkaniva, druhou je odlíšiť zápal od hyperplázie/benígneho tumoru a od malígneho tumoru a treťou je klasifikácia zápalového procesu alebo nádoru. Určenie typu/pôvodu tkaniva Nakoľko cytologická charakteristika hyperplázie, zápalu a malignity sa v jednotlivých typoch tkaniva líši, je veľmi dôležité v prvom rade určiť prevažujúcu populáciu buniek v preparáte. Rozlišujeme tieto tri typy tkanív. l. Hemopoetické tkanivo Tieto bunky pochádzajú z krvi, kostnej drene, lymfatických uzlín, sleziny a týmu. Patria sem aj mastocyty, makrofágy a histiocyty. Hemopoetické bunky sú samostatne stojace, zväčša okrúhleho tvaru a majú jednoznačne rozoznateľnú cytoplazmatickú membránu (obr. 4). Nátery sú väčšinou mnohobunkové. Preparáty, ktoré počas prípravy neboli Tabuľka 3 Farbenie podľa May-Grünwald Giemsa Roztok 1: methyl alkohol 90 % Roztok 2: 1 diel May-Grünwald farbenia + 1 diel fosfátový buffer ph 6,98 Roztok 3: 1 diel Giemsa farbenie + 9 dielov fosfátový buffer ph 6,98 5 min 4 min 15 min

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 4 Hemopoetické tkanivo: mnoho jednotlivých okrúhlych buniek s niekoľkými erytrocytmi v pozadí (kostná dreň psa s myeloidnou leukémiou). rozotrené, môžu pôsobiť dojmom organizovaného tkaniva, ale táto pseudoštruktúra mizne na okrajoch preparátu. Veľkosť buniek varíruje od malých po stredné. Často obsahujú aspoň malú cytoplazmu. ll. Epiteliálne žľazové tkanivo Tento typ buniek máva tendenciu spájať sa jedna s druhou. Môžu vytvárať aj dvoj- alebo trojrozmerné zhluky, ale nachádzame ich aj v jednej vrstve (obr. 5), v acinoch (obr. 6) alebo v štruktúrach v tvare vývodov. Občas je prítomná aj stromálna zložka. Môžu byť prítomné aj individuálne bunky. Bunkovosť je obvykle o niečo menšia ako Obr. 5 Jedna vrstva epiteliálnych buniek (pes s epiteliózou mliečnej žľazy). Obr. 6 Žľazový epitel (pes s komplexným adenómom mliečnej žľazy). Obr. 7 Dva fibroblasty v mezenchymálnej proliferácii (pes s fibrómom na hrudníkovej končatine). pri hemopoetických preparátoch. Benígne epiteliálne bunky majú okrúhle jadrá. Často majú výdatnú cytoplazmu a ohraničenie buniek je jasné. Niekedy, ako napríklad pri endokrinných nádoroch, sa pri rozťahovaní náteru cytoplazma oddelí od jadra a v preparáte potom pozorujeme len nahé jadrá. Veľkostne sú tu zastúpené bunky od malých (bazálne bunky) po veľmi veľké (squamózne epiteliálne bunky). lll. Mezenchymálne tkanivo Do tohto typu tkanív radíme bunky pochádzajúce zo spojovacích tkanív, svalov, chrupaviek a kostí. Vzhľadom na silné prepojenie týchto buniek je pomerne ťažké získať dobrý materiál. Nátery z tohto typu tkanív sú preto charakteristické nízkou celularitou a bunky sú zväčša nachádzané jednotlivo, hoci občas nachádzame aj zhluky buniek. Množstvo cytoplazmy je rôzne a ohraničenie buniek je skôr neúplné. Tvar jadra je rôzny, ale poväčšine oválny (obr. 7). Bunky môžu mať svoj špecifický tvar, spomedzi ktorých je najtypickejší vretenovitý. Bunky synovie, osteoblasty a chondroblasty môžu mať tvar vajíčka, v ktorom je jadro uložené excentricky a občas leží na polovicu mimo ohraničenia cytoplazmy. Tukové bunky sú obrovské a môžeme ich rozlíšiť aj pri malom zväčšení. Tukové bunky sú často navzájom pospájané, majú jasne definované okraje, oválne jadro v strede bunky a priehľadnú cytoplazmu. Benígny patologický proces Zápal Ak sa v preparáte vyskytujú primárne zápalové bunky, môže sa jednať o proces akútneho alebo subakútneho zápalu, alebo skôr chronického, alebo niekedy granulomatózneho zápalu. Ale môže sa jednať aj o sekundárny proces - zápal v neoplastickom procese. Preto je dôležité aj za prítomnosti zápalových buniek hľadať iné možné typy buniek. Je potom trochu náročnejšie odlíšiť dysplastické, reaktívne a neoplastické bunky. Zápalový proces rozlišujeme podľa času trvania (akútny verzus chronický), typu (purulentný, pyogranulomatózny, granulomatózny a eozinofilný) a etiológie (bakteriálny, parazitárny, plesňový, alergický, reakcia na cudzie teleso a pod.). Pri purulentnom zápale sú majoritnou skupinou buniek neutrofilné polymorfonukleárne leukocyty. V akútnej fáze

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod - E. Teske Obr. 8 Akútny septický zápal s niekoľkými neutrofilmi s vnútrobunkovými baktériami a karyolýzou. zápalového procesu môžu tvoriť až 85 % populácie prítomných buniek a klesnúť na 30 50 % v chronickejšej fáze zápalu. V purulentnom zápale môžeme pozorovať aj makrofágy. Tieto tam môžu byť prítomné už niekoľko hodín po vzniku zápalu a nie sú teda indikátorom chronicity. Opak platí o lymfocytoch a plazmocytoch. Tieto bunky totiž prenikajú do miesta zápalu až po 1-2 týždňoch. Zápalový proces môžeme ďalej charakterizovať prítomnosťou alebo absenciou degeneratívnych zmien v zápalových bunkách. Karyolýza je charakterizovaná zdurením jadra, menej intenzívnym sfarbením a dezintegráciou jadra. Tento proces pozorujeme najmä v prípadoch, kedy sa uvoľňuje veľa toxických látok a dochádza k výraznej proliferácii baktérií (obr. 8). Ak pozorujeme tieto charakteristické príznaky, musíme vynaložiť zvýšené úsilie pri hľadaní patologického agens. Naopak, pyknóza a karyorexia sú charakteristické pre pomalšiu smrť buniek (obr. 9). Pyknóza spôsobuje, že jadro sa výrazne zmenší a stráca svoj chromatínový vzor. Jadro sa stáva uniformnou, tmavo sa farbiacou masou. Ak dôjde k rozpadu pyknotického jadra, hovoríme o karyorexii. Pri granulomatóznych zápaloch pozorujeme menej polymorfonukleárnych buniek ako pri purulentnom zápale. Naopak, je u viac makrofágov a epiteliálnych buniek. Makrofágy tu často vykazujú menej známok fagocytózy ako pri purulentnom zápale. Taktiež tu môžu byť prítomné mnohojadrové obrovské bunky (obr. 10). Obr. 9 Aseptický exudatívny zápal. Niekoľko netoxických neutrofilov, pyknózy (vľavo), karyorexia (v strede) a niekoľko makrofágov. Obr. 10 Pyogranulomatózny zápal v dôsledku plesňovej infekcie. Môžeme pozorovať niekoľko obrovských buniek s viacerými jadrami, ktoré sú obklopené neutrofilmi, niekoľkými makrofágmi a lymfocytmi. Keď infekcia prechádza do chronickej fázy, začínajú sa objavovať lymfocyty a plazmacytárne bunky. Pri tomto type zápalu by cytológ mal brať do úvahy infekciu plesňami, aktinomycétami alebo podobnými baktériami a reakciu na cudzie teleso. Eozinofilný zápal obsahuje veľké množstvo eozinofilných granulocytov. Tento typ zápalu pozorujeme pri eozinofilnom granulóme mačiek, pri tzv. lick granuloma pri psoch (granulóm z rozlízania, pozn. prekladateľa), ale taktiež pri parazitárnych infekciách a pri alergických reakciách. Infiltráty eozinofilných granulocytov typicky nachádzame aj v mnohých mastocytómoch. Tkanivová regenerácia V bunkách môžeme pozorovať mnoho morfologických zmien súvisiacich so zvýšenou metabolickou aktivitou, ako napr. bazofilná cytoplazma (vysoký obsah RNA a proteínov), výrazné alebo viaceré jadierka a zvýšený počet mitóz. V takomto prípade je odlíšenie od malignity ťažké. Zväčša nachádzame normálne zrenie buniek. Jazvové tkanivo môžu sprevádzať mladé formy buniek spojovacích tkanív a cievne kapiláry. Môžeme tiež pozorovať malé množstvo zápalových buniek. Obr. 11 Karcinóm pečeňových buniek u psa. Všimnite si zmeny v bazofílii, anizocytózu a zmeny v N/C pomere.

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 12 Karcinóm pečeňových buniek psa. Obzvlášť evidentné sú jadrové kritériá malignity: anizokaryóza, prominujúce a mnohopočetné jadierka, niektoré sú hranaté, čo sa nazýva anizonukleolióza. Navyše môžeme vidieť nepravidelné jadrové membrány. Neoplastický proces Na odlíšenie malígneho tumoru od benígneho tumoru alebo hyperplázie je treba použiť jednak všeobecné a jednak bunkové (jadrové a cytoplazmatické) kritériá. V nasledujúcich riadkoch budeme diskutovať rôzne kritériá malignity. V prvom rade treba pochopiť, že neexistuje kritérium, ktoré by samo o sebe indikovalo malignitu. Najzávažnejšie sú kritériá súvisiace s bunkovým jadrom. Na dôvažok, kritériá nie sú identické pre rôzne typy buniek a lokalizácií. Kritériá malignity používame väčšinou pri epiteliálnych tumoroch. Pri mezenchymálnych tumoroch sú menej prediktívne a hemopoetické nádory sú väčšinou klasifikované podľa iných kritérií. S ohľadom na všeobecné kritériá treba zhodnotiť celú zobrazenú populáciu buniek. Neprítomnosť zápalových buniek, uniformná populácia (ako napríklad jeden typ buniek) pleomorfných buniek (napr. bunky rôzneho tvaru) sú indikáciou na malignitu. Vysoká bunkovosť preparátu a abnormálne vzťahy medzi bunkami (napr. tvorba zhlukov) sú taktiež typické pre malignitu. Tvorba zhlukov znamená trojrozmerný Obr. 13 Karcinóm mliečnej žľazy u psa. Okrem zmien v bazofílii a niekoľkých mikrocytoplazmatických vakuol vidíme jasne anizokaryózu, hrudkovitý vzor chromatínu, abnormálny tvar jadier a mnohopočetné jadierka s anizonukleoliózou. rast buniek bez organizovaných prepojení. Naopak, jedna vrstva buniek a formovanie acinov alebo vývodov predpovedá lepšiu diferenciáciu buniek. Prítomnosť buniek určitého typu na mieste, kde sa normálne nenachádzajú, je okamžite podozrivá. Dobrým príkladom takéhoto výskytu je prítomnosť epiteliálnych buniek v lymfatickej uzline. Medzi cytoplazmatické kritériá malignity patrí najmä výrazná bazofília cytoplazmy alebo aj značná rozdielnosť v bazofílii cytoplazmy pri sebe stojacich buniek. Táto bazofília súvisí s množstvom RNA a proteínov v cytoplazme a je teda meradlom aktivity bunky. Reaktívne bunky však môžu byť tiež silno bazofilné. Anizocytózu (značné rozdiely vo veľkosti buniek) a makrocytózu (abnormálne veľké bunky) pozorujeme častejšie v malígnych ako benígnych nádoroch (obr. 11). Medzi ďalšie cytoplazmatické kritériá malignity patria abnormálne cytoplazmatické inklúzie (obzvlášť kanibalizmus druhých buniek), atypická vakuolizácia, vysoký N/C pomer (pomer jadro/cytoplazma) - pomerne malá cytoplazma a značné rozdiely v N/C pomere medzi susediacimi Tabuľka 5 Zhrnutie cytoplazmatických a jadrových kritérií malignity Cytoplazma Anizocytóza Makrocytóza Bazofília Premenlivá bazofília Abnormálne cytoplazmatické inklúzie Atypické vakuoly Vysoký N/C pomer Premenlivý N/C pomer Jadro Anizokaryóza Makrokaryóza Mnohopočetné jadrá Abnormálny tvar jadier Nepravidelné zhrubnutie jadrovej membrány Nepravidelný vzor chromatínu Hyperchromázia/anizochromázia Vysoký mitotický index Abnormálne mitózy Mnohopočetné jadierka Veľké jadierka Jadierka nepravidelného tvaru Anizonukleolióza

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod - E. Teske bunkami. Najdôležitejšie kritériá malignity sú však tie, ktoré súvisia s jadrom bunky. Veľké jadrá, anizokaryóza (nerovnaká veľkosť jadra), mnohopočetné jadrá v bunke (obzvlášť ak sú rozdielnej veľkosti a je ich viac ako dve), abnormálny tvar jadra a značné rozdiely v tvare jadier medzi jednotlivými bunkami, nepravidelné a zhrubnuté jadrové membrány (veľmi dobre viditeľné pri farbení podľa Papanicolau) a nepravidelný, hrudkovitý vzor chromatínu - toto všetko sú kritériá, ktoré charakterizujú malignitu (obr. 12 a 13). Zvýšený mitotický index a najmä abnormálne mitózy sú ďalšie jadrové kritériá malignity. Kritériá malignity jadierok sú mnohopočetné jadierka, abnormálne veľké jadierka, anizonukleóza a abnormálne tvarované jadierka. Niektorí autori navrhujú, že prítomnosť 3- až 4-jadrových kritérií malignity môžu byť považované za indikatívne na malígny proces, nakoľko takéto množstvo kritérií sa nemôže vyskytovať v hyperplastickom tkanive. V praxi to však môže stále predstavovať veľký problém jednoznačne odlíšiť malignitu od hyperplastickej reakcie, najmä pri mezenchymálnych proliferáciách. Prehľad vyššie zmienených kritérií malignity nájdete v tab. 5. Prehľad odporúčanej literatúry: ALLEN (S.W.), PRASSE (K.W.) - Cytologic diagnosis of neoplasia and perioperative implementation. Comp Cont Ed Pract Vet, 1986, 8:72. BAKER (R.), LUMSDEN (J.H.) - Color Atlas of Cytology of the Dog and Cat. Mosby Inc, St. Louis. 2000. BOON (G.D.), REBAR (A.H.), DENICOLA (D.B.) - A cytologic comparison of Romanowsky stains and Papanicolaou-type stains. I. Introduction, methodology and cytology of normal tissues. Vet Clin Pathol, 1982, 11: 22. COWELL (R.L.), TYLER (R.D.), MEINKOTH (J.H.), DENI- COLA (D.B.) - Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 3rd Ed. Mosby Elsevier, St. Louis. 2008. GRUNZ (H.), SPRIGGS (A.I.) - History of Clinical Cytology. A selection of documents. 2nd ed. G-I-T Verlag Ernst Giebler, Darmstadt, West Germany, 1983. LOPES CARDOZO (P.) - Atlas of Clinical Cytology. Targa bv, s-hertogenbosch, the Netherlands, 1975. RASKIN (R.E.), MEYER (D.J.) - Atlas of Canine and Feline Cytology. WB Saunders, Philadelphia, 2001. REBAR (A.H.) - Diagnostic cytology in veterinary practice; current status and interpretative principles. In: Kirk RW (ed), Current Veterinary Therapy VII, WB Saunders Co, Philadelphia, 1980, pp 16-27. TVEDTEN (H.) - Cytology of neoplastic and infl ammatory masses. In: Willard, Tvedten, Turnwald (eds), WB Saunders Co, Philadelphia,1989, pp 327-348.

GENERAL COMMISSIONED PAPER Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií E. Teske (1) ZHRNUTIE Podkožné opuchy, kožné nádory a kožné lézie sú výborne lokalizované pre cytologické vyšetrenie pomocou FNAB. Tieto lézie vo všeobecnosti môžeme poľahky aspirovať, sú bezbolestné alebo spôsobujú len minimum bolestivosti okrem procesov lokalizovaných na chodidle alebo na nose a aj pri týchto je len zriedkavo potrebný akýkoľvek typ anestézie. Z otvorených lézií možno ľahko odobrať odtlačok alebo zoškrab, avšak odporúčame odobrať aj FNAB z okrajov rany. V mnohých prípadoch môže cytologické vyšetrenie viesť k rýchlemu stanoveniu správnej diagnózy a môže mať rozhodujúci význam pri voľbe terapie a stanovení prognózy. Vďaka cytologickému vyšetreniu FNAB podkožných zdurenín a kožných nádorov často ani nie je potrebné histologické vyšetrenie. Histológia trvá dlhšie, je invazívnejšia a drahšia. Napriek tomu treba zdôrazniť, že následné histologické vyšetrenie takmer vždy ponúka riešenie v prípadoch, kedy je cytologické vyšetrenie nedostačujúce a sú procesy, ktoré vieme diagnostikovať len pomocou histológie. Cytologické vyšetrenie kožných tumorov a v menšej miere aj kožných lézií a podkožných zdurenín je dobrým odrazovým mostíkom pre veterinárov, ktorí sa chcú venovať cytológii. Mnohé diagnózy je vhodné verifikovať so skúseným cytológom alebo pomocou histologického vyšetrenia. Tento článok je postavený tak, aby pomohol neskúsenému cytológovi dopracovať sa rýchlo k prvej diagnóze, ale zároveň rozoznať preparáty, ktoré sú náročné na interpretáciu. Interpretáciu týchto je lepšie prenechať na skúseného cytológa. Zároveň odporúčam čitateľovi konfrontovať svoje nálezy s niektorou z mnohých dostupných učebníc cytológie, nakoľko v tomto článku sú z dôvodu publikačných limitov obsiahnuté len zhustené informácie. Pre neskúseného cytológa ponúkame niekoľko rád, ako sa vyhnúť stanoveniu nesprávnej diagnózy: 1. Vyhodnocujte len preparáty dobre rozotrené na sklíčko s bohatým zastúpením buniek. 2. Interpretáciu nálezu dávajte v čo najväčšej možnej miere do súvislosti s klinickými informáciami o pacientovi, ako sú najmä vek pacienta, história pacienta a, samozrejme, makroskopický obraz, štádium rastu a lokalizácia tumoru. 3. Overujte si svoje diagnózy, aj tie najjednoduchšie, buď so skúseným cytológom, alebo pomocou histologického vyšetrenia. Odlíšiť kožný nádor od podkožnej zdureniny môže byť náročné. Kožné nádory môžu prenikať do podkožia a podkožné lézie môžu, naopak, prenikať do kože a oba procesy môžu vytvárať kožné lézie. Pohmatom a adspekciou zväčša dokážeme správne lokalizovať proces ako taký. A toto je dôležité pri získavaní FNAB, nakoľko pôvod procesu môže poskytnúť špecifické indikácie na typ procesu (tab. 1). (1) Department Clinical Sciences Companion Animals, Veterinary Faculty, Utrecht University PO Box 80.154, NL- 3508 TD Utrecht. E-mail: e.teske@uu.nl

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií - E. Teske Príčiny podkožného opuchu Hematóm Cysta Zápal, absces Mezenchymálny nádor Lipóm, fibróm, hemangióm, Hemangiopericytóm, hemangiosarkóm, postinjekčný fibrosarkóm, liposarkóm, leiomyosarkóm, chondrosarkóm, osteosarkóm Malígny lymfóm Žľazovo-epiteliálne nádory Adenómy a adenokarcinómy mazových žliaz, potných žliaz, štítnej žľazy, slinných žliaz, perianálnych žliaz, mliečnej žľazy a análnych váčkov Kožné nádory Okrúhlo bunkové nádory Mastocytóm, melanóm, malígny lymfóm, plazmocytóm, histiocytóm, kondylóm Epiteliálne nádory Nádor bazálnych buniek, SCS, adenóm a adenokarcinóm Tabuľka 1 Podkožné opuchy Podkožné opuchy môžu pochádzať jednak zo štruktúr podkožia, rovnako ako aj z iných tkanív nachádzajúcich sa v podkoží, ako sú slinné žľazy, lymfatické uzliny, štítna žľaza, mliečna žľaza, chrupavky, kosti a pod. Nádory a zápaly mliečnej žľazy nebudú predmetom tohto článku. Cytológia mliečnej žľazy mačiek a obzvlášť psov je jedným z najnáročnejších odvetví klinickej cytológie spoločenských zvierat. Hematóm Preparáty, ktoré obsahujú veľa erytrocytov, treba pozorne preskúmať na prítomnosť aj iných buniek. Ak v preparáte nachádzame len zopár epiteliálnych alebo mezenchymálnych Obr. 1 Hematóm u psa. Na pozadí vidíme niekoľko voľných erytrocytov, ale aj fagocytované v makrofágoch a transformované na tmavý granulárny materiál. buniek a tieto pri vyšetrení so 100 x zväčšením nepreukazujú kritériá malignity, tak máme do činenia s 1) poškodenou cievou, 2) môže sa jednať o nádor buniek cievnej steny (napr. hemangióm, hemangiosarkóm) alebo 3) krv pochádza z hematómu. Na poslednú možnosť môže poukazovať aj skutočnosť, že krv zo staršieho hematómu neobsahuje trombocyty, ale obsahuje hnedé kryštály bilirubínu a makrofágy vykazujúce erytrofagocytózu a akumuláciu železitého pigmentu. Rovnako tu môžeme nájsť zopár zápalových buniek, ako sú neutrofily a lymfocyty (obr. 1). Tuk/lipóm Keď preparáty pred fixáciou a farbením obsahujú dostatočné množstvo sklovitého, tukovitého materiálu, ale po ofarbení obsahujú len nejasné pozadie s akýmisi prázdnymi okrúhlymi miestami rozličnej veľkosti, jedná sa pravdepodobne iba o tuk, ktorý sa rozpustil vo fixačnom alkohole. Niekedy môžeme pozorovať niekoľko pyknotických jadier tukových buniek a/alebo neporušené trojrozmerné zhluky prázdnych tukových buniek. Prítomnosť len čistého tuku indikuje buď neúspešnú aspiráciu (podkožný tuk), alebo aspiráciu z lipómu. Bunky lipómu vyzerajú úplne rovnako ako normálne tukové bunky. Cysty Nátery, ktoré obsahujú veľké, modré epiteliálne bunky bez jadier, sú zväčša kontaminované lupienkami keratínu z kože. Ak náter obsahuje takmer výlučne veľké množstvo keratínových lupienkov alebo amorfný modrý, alebo čierny materiál, pravdepodobne bola aspirovaná dermoidná (epidermoidná) cysta (obr. 2). Tieto cysty často obsahujú aj kryštály cholesterolu. Tieto môžu spôsobovať sekundárny zápal. Ak sa tu okrem keratínových lupienkov nachádzajú aj nedospelé jadrové bunky, tieto treba dôkladne vyšetriť na kritériá malignity. Preparáty môžu tiež obsahovať homogénnu ružovú vrstvu proteínov, v ktorej sa sporadicky vyskytujú epiteliálne alebo mezenchymálne bunky, alebo pomiešané krvné bunky. Tento nález indikuje, že sa jedná o aspirát z 1) edematózneho tkaniva, 2) veľmi slabo sa odlupujúci nádor alebo 3) serózna Obr. 2 Obsah epidermoidnej cysty. Pozorujeme niekoľko lupeňov keratínu s ich charakteristickou bledomodrou farbou. Taktiež je prítomný veľký kryštál cholesterolu.

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 cysta (seróm, hygróm). To, že aspirujeme z cysty, väčšinou rozoznáme už pri samotnej aspirácii. Pri mikroskopickom vyšetrení môžeme zväčša nájsť niekoľko jednojadrových buniek (makrofágy, bunky steny cysty) a kryštály cholesterolu. Slinné cysty je možné rovnako ľahko rozoznať (obr. 3). Okrem typickej lokalizácie a mukoidného charakteru obsahu cysty pozorujeme aj mikroskopicky typické zhluky a reťazce modrého amorfného materiálu (hlien), množstvo penovitých makrofágov, ktoré vyvíjajú veľmi výraznú fagocytárnu aktivitu, ktorá môže zahŕňať erytrocyty, bilirubínové kryštály a hemosiderín, pretože v slinných cystách je vždy prítomné nejaké množstvo krvi. Kvôli vysokej viskozite slín nachádzame erytrocyty často naskladané do radu. V preparáte môžeme občas nájsť aj určité množstvo buniek pochádzajúcich priamo zo slinnej žľazy. Tieto rozoznáme ľahko. Sú to zhluky buniek, ktoré vytvárajú jasnú acinárnu štruktúru a obsahujú veľké množstvo cytoplazmy a často bývajú obklopené tmavomodrými reťazcami hlienu. Preparáty z abscesov obsahujú veľké množstvo neutrofilov. Jednotlivo tu nachádzame aj lymfocyty, plazmacytárne bunky alebo makrofágy. V závislosti od vyvolávajúcej príčiny vykazujú neutrofily rôzne znaky degenerácie. V prvom rade sa treba sústrediť na baktérie uložené vo vnútri bunky. Zápal Zápalový proces bol vo všeobecnosti popísaný v predošlom článku (Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod, pozn. prekladateľa). Pri cytologickom vyšetrení rozoznávame niekoľko špecifických typov zápalového procesu: Plazmocytická pododermatitída Plazmocytická pododermatitída začína ako jemný opuch jedného alebo viacerých chodidlových vankúšikov. V aspiráte nachádzame veľké množstvo plazmacytárnych buniek. Občas nachádzame lymfocyty alebo neutrofily. Väčšina plazmacytárnych buniek je dobre diferencovaná. Nodulárna panikulitída Pri nodulárnej panikulitíde dochádza k vzniku sterilného zápalu podkožného tuku, pričom sa formuje jeden alebo viacero podkožných nodulov, ktoré môžu ulcerovať. Pre toto ochorenie je typický obraz pyogranulomatózneho Obr. 3 Slinná cysta so sekundárnym miernym krvácaním. Je vidieť množstvo veľkých modrých amorfných hlienových zhlukov s makrofágmi na pozadí aj v popredí preparátu. zápalu s obsahom nedegenerovaných neutrofilov, penovitých makrofágov a polyjadrových gigantických buniek. Na podklade pozorujeme tuk a môžu byť prítomné lipocyty. Nenachádzame žiadne mikroorganizmy. Eozinofilný zápal Bioptáty obsahujú veľké množstvo eozinofilných granulocytov. Tento typ zápalu sprevádza eozinofilný granulóm u mačiek, granulóm z rozlízania u psov, ale tiež parazitárne infekcie a alergické reakcie. Infiltráty eozinofilných granulocytov typicky infiltrujú aj mastocytómy. Mezenchymálne bunky vo FNAB Mezenchymálne bunky sa nachádzajú vo všetkých orgánoch, či už ako spojovacie a podporné tkanivá alebo ako súčasť krvných ciev. Taktiež sú základnou stavebnou jednotkou mnohých diferencovaných tkanív (spojovacie tkanivá, chrupavka, kosť, sval, cievna stena, tukové tkanivo). Mezenchymálne bunky sú rovnako takmer vždy zapojené do procesu nápravy poškodených tkanív, v ktorom môžu čiastočne nahradiť pôvodné tkanivo (mezenchymálne hyperplázia, jazva). Počas zápalového procesu sú mezenchymálne bunky stimulované k deleniu a proliferácii, aby tak napomáhali pri obnove tkaniva. Preto FNAB zo zápalového procesu obsahuje fibroblasty. Tieto môžu byť potom natoľko stimulované, že môžu budiť dojem malignity. A tak cytoplazma sa môže farbiť silno bazofilne a môžeme pozorovať značne veľké alebo mnohopočetné jadrá. Taktiež pozorujeme gigantické bunky s viacerými jadrami a rôznej veľkosti. Preto je prítomnosť alebo neprítomnosť zápalu tak dôležitým kritériom pri hodnotení mezenchymálnych proliferácií. Sporadicky môžeme pomocou FNAB aspirovať aj plne diferencované mezenchymálne bunky, ako napr. fibrocyty, ktoré pochádzajú zo spojovacích tkanív. Ak nachádzame fibrocyty vo veľkom množstve, môže sa jednať o fibróm. V takomto prípade nachádzame veľmi málo zápalových buniek. Malígne mezenchymálne nádory môžu mať histologickú charakteristiku pôvodného tkaniva (napr. fibrosarkóm, osteosarkóm, liposarkóm, chondrosarkóm, hemangiosarkóm, leiomyosarkóm). Nie vždy je možné odlíšiť typ mezenchymálneho nádoru cytologicky a občas môže byť dokonca ťažké odlíšiť, že malígny nádor je mezenchymálneho pôvodu. Je preto nevyhnutné stanoviť diagnózu malígneho nádoru len na základe prítomnosti dostatočného množstva kritérií malignity (Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod, pozn. prekladateľa) a rovnako vtedy, ak sú bunky nejasného mezenchymálneho pôvodu a proliferácia nádoru nemôže byť považovaná za zápalový proces. V nasledujúcom texte si podrobnejšie rozdiskutujeme niekoľko špecifických typov mezenchymálnych nádorov: V biopsiách osteosarkómov je zväčša dobrá celularita a často pozorujeme bunkové nekrózy. Pozorujeme malé až značné množstvo eozinofilných osteoidov pripomínajúcich substancie nachádzajúce sa v okolí osteoblastov. V závislosti od histologického podtypu môžeme taktiež nachádzať malé až značné množstvo fibroblastov. Osteoklasty sa vyskytujú menej často. Osteoblasty majú bledomodrú až modrú cytoplazmu s excentricky uloženými jadrami a s prejasnením cytoplazmy pripomínajúcim Golgiho aparát. Mier-

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií - E. Teske Obr. 4 Aspirát osteosarkómu psa. Je prítomných niekoľko slabo diferencovaných osteoblastov s niekoľkými bunkami s eozinofilnými granulami. na až značná eozinofilná granulácia cytoplazmy je jasným znakom malígnych osteoblastov (obr. 4). Nádorové osteoblasty nemávajú dostatočne dobre definovanú bunkovú stenu. Pozorujeme výrazné jadierka, zväčša viac ako dve v jednom jadre. Chromatín sa zobrazuje od sieťovitého po zhlukovitý vzor. Nachádzame aj ďalšie kritériá malignity, ako jadrá nepravidelného tvaru, anizonukleolióza, makronukleolizácia, poprehýbané jadro a aberantné mitózy. Dodatočné farbenie alkalickou fosfatázou je nápomocné pri odlíšení osteosarkómu od ďalších typov sarkómov. Hemangiopericytómy sú cievne nádory, o ktorých sa predpokladá, že vychádzajú z pericytov. Sú klasifikované spolu s nádormi nervových pošiev. Cytologicky majú veľmi jednoznačný obraz. Preparáty majú dobrú až výdatnú bunkovosť. Bunky nachádzame uložené jednotlivo, majú vretenovitý tvar a cytoplazma vykazuje protrúziu v tvare víru. Jadro má okrúhly tvar a môžu byť dve alebo aj viac, čím vytvárajú obraz buniek podobný hlave hmyzu alebo sa tiež nazývajú korunkové bunky (obr. 5). Postinjekčné sarkómy sú u mačiek lokalizované v hypoderme a vyznačujú sa vysokým bunkovým pleomorfizmom a vysokým mitotickým indexom. Veľa týchto nádorov je Obr. 6 Zhluk epiteliálnych buniek adenokarcinómu potnej žľazy. Prítomné sú viaceré kritériá malignity, ako anizokaryóza, hrubý chromatínový vzor, abnormálne tvary jadier a mnohopočetné jadierka. Obr. 5 Hemangiosarkóm. Pozorujeme niekoľko individuálnych buniek ako keby v roztvárajúcom sa víre, okrúhle jadrá a niekoľko viac jadrových buniek. Vpravo hore pozorujeme typický tvar korunky. spojených so zápalovým procesom. Zápalová reakcia je typická častou agregáciou lymfocytov a menším množstvom plazmacytárnych buniek. Vo vnútri, v bezprostrednom alebo vzdialenejšom okolí týchto nádorov, sa nachádzajú typicky veľké okrúhle makrofágy s modrosivou cytoplazmou, ktorú považujeme za fagocytovaný adjuvantný materiál. Nádory sú často obklopené granulačným tkanivom, ktoré ohraničuje oblasti nekrózy v mieste vakcinácie. Mnohojadrové gigantické bunky sú typickým nálezom u mačiek pri postvakcinačných fibrosarkómoch. Adenómy a adenokarcinómy Mnohé žľaznaté štruktúry v alebo pod kožou môžu byť miestom vzniku benígnych (adenómy) alebo malígnych nádorov (adenokarcinómy). U mnohých adenómov alebo adenokarcinómov je ťažké odlíšiť, či sa jedná o exokrinnú alebo endokrinnú žľazu, ale niekoľko nádorov nesie charakteristické vlastnosti, ktoré umožňujú odhaliť ich pôvod. Základnou diagnostickou črtou žľazových epiteliálnych nádorov je výskyt nádorových buniek usporiadaných do zhlukov, čo je pravidlom pri všetkých epiteliálnych nádoroch. Konkrétne je to acinárna štruktúra, ktorú sme schopní v bunkových zhlukoch rozlíšiť. Avšak pri silno malígnych Obr. 7 Zhluk epiteliálnych buniek z nádoru perianálnej žľazy. Typické hepatoidné bunky so zmnoženou a akousi granulárnou/penovitou cytoplazmou, okrúhlymi jadrami, ktoré občas obsahujú veľké jadierko.

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 nádoroch sa táto vytráca. Adenómy je horko-ťažko odlíšiť od normálneho žľazového tkaniva. Okrúhle alebo kubické bunky vykazujú minimálne rozdiely vo veľkosti, veľkosti jadra a v N/C pomere. Makroskopický obraz nádoru spolu s cytologickým nálezom zhlukov uniformných epiteliálnych buniek, ktoré môžu mať zľahka vyššiu bunkovú denzitu a trošku chaotické usporiadanie, sú konzistentné s diagnózou adenóm. Adenokarcinómy môžu tu a tam vykazovať určitý stupeň acinárnej štruktúry, ale zároveň vykazujú mnoho kritérií malignity článku (Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť I. Úvod, pozn. prekladateľa). Vo všeobecnosti môžeme povedať, že pre stanovenie malignity potrebujeme nájsť aspoň štyri kritériá (obr. 6). U dobre diferencovaných adenokarcinómov to však môže byť občas zložité. Perianálne adenómy/adenokarcinómy sú nádory perianálnych žliaz, s ktorými sa stretávame poväčšine u psov - samcov a len zriedkavo u súk. Lokalizujú sa v bezprostrednom okolí konečníka, ale príležitostne ich nachádzame aj na chvoste, na predkožke, v slabine a na chrbte. Zväčša sú benígne, ale môžu sa zvrhnúť do malignity. Občas ich nazývame aj hepatoidnými nádormi, pretože nádorové bunky svojou štruktúrou pripomínajú bunky pečeňového parenchýmu. Bunky väčšinou vytvárajú trojrozmerné zhluky, avšak na okraji týchto zhlukov sme schopní tieto bunky detailnejšie vyšetriť. Bunky sú pomerne veľké, často vajcovitého tvaru s excentricky uloženým jadrom, ktoré obsahuje jasne viditeľné jedno alebo dve jadierka. Cytoplazma sa javí ako granulárne penovitá (obr. 7). V preparáte môžeme nájsť aj zvyšky cytoplazmatických štruktúr. Perianálne nádory často ulcerujú a môžu byť preto infiltrované zápalovými bunkami. Občas v nich nachádzame kritériá malignity. Adenokarcinómy análnych váčkov sú malígne nádory, ktoré podobne ako nádory štítnej žľazy u psov nevykazujú vždy typické kritériá malignity. Veľmi často nachádzame v bioptátoch veľké množstvo jednotvarých buniek, zväčša bez zjavnej cytoplazmy. Pri podrobnom skúmaní preparátu však môžeme odhaliť acinárnu štruktúru. Rovnako pozorujeme často anizokaryózu ako jedno z kritérií malignity. Morfolo- Obr. 8 Aspirát karcinómu štítnej žľazy. Prítomné sú skupiny nahých jadier zoradené v acinárnej štruktúre. Jadrá sú okrúhle, veľmi uniformné a postrádajú zjavné kritériá malignity. gicky sú nádorové bunky u psov veľmi podobné adenokarcinómom štítnej žľazy. Nádory mliečnej žľazy nie sú vždy jednoznačne rozoznateľné bez cytologického alebo histologického vyšetrenia. Napriek tomu je cytológia nádorov mliečnej žľazy jednou z najnáročnejších vo veterinárnej cytológii a nie je predmetom tohto článku. Nádory štítnej žľazy pozostávajú z epiteliálnych buniek, ktoré majú veľmi bohatú cytoplazmu. Bunky sa ľahko odlučujú a rovnako ľahko praskajú. Preparáty obsahujú často veľa krvi. Ak aj dôjde k aspirácii malého množstva krvi, stále dokážeme pozorovať typickú acinárnu štruktúru, rovnako ako voľné jadrá na homogénnom pozadí bohatom na proteíny. Voľné jadrá dosahujú veľkosť lymfocytov a nesmieme si ich s nimi zamieňať. FNAB zo štítnej žľazy za žiadnych okolností nesmie obsahovať časti lymfatickej uzliny. Tu a tam sú evidentné zhluky buniek s acinárnou štruktúrou. Jadrá vykazujú len sporadicky kritériá malignity, ako sú anizokaryóza a mnohopočetné jadierka (obr. 8). Napriek tomu sú však tieto nádory u psov vždy považované za zhubné. U mačiek sa väčšinou jedná o benígnu hyperpláziu (adenóm). Kožné nádory a kožné lézie Kožné nádory sú pomerne dobre identifikovateľné. Niekedy je do procesu zapojené podkožie, niekedy ho sprevádza nádor a niekedy sa jedná o proces pochádzajúci z hlbších vrstiev infiltrujúci kožu. Diferenciálna diagnóza sa tak stáva rozsiahlejšou a ťažšou. Cytologickým vyšetrením sa napriek tomu vieme dopracovať k diagnóze, za predpokladu, že zachytíme dostatočné množstvo charakteristických buniek. Nádory samostatne stojacich okrúhlych buniek Niekoľko typov nádorov je charakteristických uniformnou populáciou okrúhlych nádorových buniek, ktoré sú zjavne navzájom spojené len minimálne alebo vôbec. FNAB z takýchto nádorov je zväčša bohatá na bunky, lebo na rozdiel od mezenchymálnych nádorov sa bunky uvoľňujú pri aspirácii ľahko. Do tejto skupiny, nazývanej tiež nádory diskrétnych buniek, patria mastocytómy, malígne lymfómy, Obr. 9 V tomto aspiráte mastocytómu pozorujeme niekoľko veľkých samostatných buniek. Bunky obsahujú mnoho červených granúl vo svojej cytoplazme.

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií - E. Teske Obr. 10 Nádorové bunky v tomto mastocytóme postrádajú charakteristické červené granuly. Iba v jednej bunke naľavo pozorujeme malé množstvo granúl. Okrem nádorových buniek pozorujeme niekoľko eozinofilov. kožné plazmacytárne histiocytómy, melanómy a transmisívne venerické tumory (TVT). Mastocytómy sú obvykle ihneď identifikovateľné vďaka prítomnosti mnohých červeno sa farbiacich cytoplazmatických granúl. Bunky sú veľké a okrúhle. Jadro buniek je často ťažké rozoznať, lebo sa slabo zafarbuje a je zastreté granulami, ktoré absorbujú veľkú časť farbiva (obr. 9). Občas môžeme pozorovať veľké množstvo eozinofilov a fibroblastov. U nízko diferencovaných mastocytov je červených granúl menej, prípadne až môžu chýbať. Napriek tomu nie je vhodné pomocou cytológie stanoviť grade nádoru. Diferenciálne diagnózy: Sú mastocytómy, ktoré obsahujú veľmi málo granúl (obr. 10). Tieto sa diagnostikujú ťažko. Prítomnosť eozinofilov môže posilniť podozrenie na mastocytóm. Zápalový proces môže sťažovať diferenciálnu diagnózu, pretože v ňom môžu byť obsiahnuté aj mastocyty, aj eozinofily. V zápaloch je však napriek tomu evidentne vyšší počet zápalových buniek voči mastocytom. Aj melanómy sa môžu zamieňať s mastocytómom. Bunky melanómu môžu byť rovnako ako mastocyty okrúhleho tvaru a obsahovať pigmentové granuly. Napriek tomu však melanómy Obr. 12 Melanóm typologicky tvorený bunkami tvaru pečate u mačky. Pozorujeme veľa amelanotických buniek, často s mnohopočetnými jadrami. Obr. 11 Aspirát melanómu u psa. Okrem niekoľko nahých jadier pozorujeme aj zopár veľkých melanómových buniek vyplnených čiernymi melanínovými granulami. vo väčšine prípadov obsahujú aj vretenovité nádorové bunky. Na dôvažok sú pigmentové granuly v melanómoch rôzneho tvaru, veľkosti a intenzity farbenia v závislosti od hrúbky vrstvy pigmentu od sivomodrej po zelenočiernu. Melanómy sú nádory zložené z buniek, ktoré produkujú melanín. Melanómy patria do skupiny okrúhlo bunkových nádorov, ktoré sa navzájom nespájajú, pretože vo veľkej miere spĺňajú charakteristiku tejto skupiny nádorov. Okrem oválneho tvaru nachádzame aj vretenovité bunky, ktoré môžu dominovať celému obrazu. Môžu sa vyskytovať aj bunky bizarného tvaru a gigantické bunky. Množstvo melanínu v bunkách sa môže zásadne líšiť. Jadro v bunkách melanómu často nie je možné vidieť, nakoľko je zastreté granulami melanínu (obr. 11). Granuly sú modrej až čiernozelenej farby, nepravidelného tvaru a rôzneho množstva. Melanómy môžu byť malígne alebo benígne. Ak je viditeľné jadro, môže odhaliť definitívne kritériá malignity. Melanómy, ktoré ledva nejaký pigment obsahujú, sú takmer vždy malígne. Takéto amelanotické melanómy je ťažké diagnostikovať ako také, avšak pri dôkladnom prezretí preparátu vždy odhalíme aspoň nejaké bunky s obsahom melanínových granúl. Makrofágy s fagocytovaným melanínom môžu byť dobrou smernicou pri odhaľovaní pôvodu Obr. 13 Kožný malígny lymfóm u mačky. Prítomných je niekoľko veľkých nedospelých lymfoidných nádorových buniek a niekoľko zrelých reaktívnych lymfocytov.

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 14 Zmes niekoľkých nádorových buniek histiocytómu spolu s niekoľkými neutrofilmi a lymfocytmi. Histiocyty sú tie veľké bunky s bledou sivomodrou cytoplazmou. nádoru. Kožné malígne melanómy u mačiek môžu byť taktiež melanotické a amelanotické. Rozoznávame päť typov melanómov: epiteloidné, vretenovité, pomiešané, bunky v tvare pečate a balónovité bunky. Kým všetky epiteloidné, vretenovité a pomiešané epiteloidné/vretenovité bunky vykazujú pigmentáciu, bunky v tvare pečate a balónovité bunky sú často amelanotické (obr. 12). Patologické bunky melanómu s obsahom granúl je pomerne ľahké odlíšiť od normálnych pigmentovaných buniek epitelu. Melanocyty a pigmentované šupinovité bunky majú veľmi jednotvárne tyčinkové granuly. Jadro môže byť degenerované alebo sa môže úplne strácať, ale určite nebude vykazovať kritériá malignity. Rozdiel medzi bunkami melanómu a mastocytómu bol prediskutovaný v predošlom texte. Melanocyty musíme taktiež odlíšiť od makrofágov s obsahom fagocytovaného melanínu (melalnofágy) alebo s obsahom hemosiderínu. Melalnofágy obsahujú zväčša hrubé zhluky melanínu spolu s vakuolami. Vyskytujú sa špeciálne v melanómoch, ale nachádzame ich aj v zápalových lymfatických uzlinách a pri niektorých kožných ochoreniach. Hemosiderofágy nachádzame v starých hematómoch. Tieto majú vakuoly, ktoré obsahujú železnatý pigment. Rovnako ako pigment melanín, má tento modrú až zelenočiernu farbu. Prítomnosť buniek s obsahom bilirubínových kryštálov a erytrocytofagocytóz napomáha pri rozlišovaní. Malígne lymfómy môžu byť primárne alebo sekundárne nádory kože. Primárne, zavše epiteliotropné lymfómy, sú zväčša charakterizované prítomnosťou veľkého množstva T-lymfoidných nádorových buniek. Tieto bunky sa môžu javiť viac diferencované, s istým stupňom vrúbkovania jadra a svetlou cytoplazmou. Na rozdiel od nich sú B-lymfoidné tumory charakteristické prítomnosťou veľkých, blastických buniek s tmavomodrou cytoplazmou a okrúhlym jadrom s jasne prominujúcimi jadierkami (obr. 13). (Muko)kutánne plazmocytómy sú v princípe benígne nádory. Na rozdiel od ich protipólu - multipného myelómu - nie sú kombinované s paraneoplastickým syndrómom. Aspiráciou normálne získame veľké množstvo buniek. Bunky Obr. 15 Bunky TVT sú veľké, s jasnými okrajmi cytoplazmy a občas s jemnými vakuolami. Napravo vidieť mitózu a vľavo je prítomných niekoľko reaktívnych lymfocytov. občas vyzerajú ako typické plazmacyty, zatiaľ čo v iných prípadoch sú menej zreteľne diferencované. Najčastejšie sú to samostatne stojace bunky s jasnou cytoplazmatickou membránou a modrou cytoplazmou. Jadro môže byť uložené excentricky, môžeme občas pozorovať Golgiho aparát a môžeme pozorovať niekoľko buniek s dvoma alebo viacerými jadrami. Histiocytómy sú obvykle benígne. Vyskytujú sa najmä u mladých psov a môžu spontánne zmiznúť. Cytologicky ich charakterizuje populácia buniek s určitou variabilitou tvaru. Malé histiocyty pripomínajú lymfocyty, ale majú jemnejší jadrový chromatín a viac cytoplazmy (obr. 14). Väčšie histiocyty pripomínajú epiteliálne bunky, ale nie sú usporiadané do tkaniva. Cytoplazma je od sivej po bledomodrú, niektoré bunky ostávajú číre. Jadrá sú zväčša okrúhle, ale môžu byť vrúbkované. Obsahujú zopár malých, nie veľmi zjavných jadierok. Diferenciálna diagnóza: FNAB z histiocytómu obsahuje obvykle len zopár nádorových buniek na rozdiel od FNAB z iných nádorov samostatne stojacich okrúhlych buniek. Nakoľko histiocytómy často ulcerujú a bývajú sekundárne zapálené, môže byť naozaj ťažké odlíšiť nádorové bunky, ktoré pripomínajú lymfocyty, a epiteloidné bunky na pozadí zápalových buniek. Histiocytómy môžu zľahka pripomínať TVT (pozri nižšie). Transmisívne venerálne tumory (TVT) sa u psov vyskytujú v genitálnej oblasti, ale rovnako aj na hlave. Občas sa s nimi stretávame v severných štátoch Európy. Bunky pripomínajú histiocyty, ale nádor exfoliuje omnoho jednoduchšie, takže preparáty sú oveľa bohatšie na bunky. Taktiež cytoplazma je nepomerne ostrejšie ohraničená a občas v nej môžeme dosť jasne pozorovať vakuoly (obr. 15). Okrúhle alebo oválne jadro je uložené excentricky, občas je vrúbkované a môže mať veľké, viditeľné jadierka. Veľkosť buniek, veľkosť jadra a N/C pomer je rozmanitejší ako pri histiocytómoch. Zväčša pozorujeme množstvo mitotických figúr. Okrem nádorových buniek môžu TVT obsahovať pomerne veľa plazmacytov a makrofágov. Diferenciálna diagnóza: okrem histiocytómov treba brať do úvahy aj nádory bazálnych buniek (pozri nižšie).

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií - E. Teske Obr. 16 Typický lineárny zhluk buniek z aspirátu nádoru bazálnych buniek. Bazálne bunky sú vysoko monomorfné, s malými okrúhlymi jadrami a len s niekoľkými alebo žiadnymi kritériami malignity. Epiteliálne nádory V preparátoch z kožných nádorov, kožných lézií a podkožných zdurenín môžeme identifikovať rôzne typy epiteliálnych buniek. Môžu to byť šupinaté bunky, ale rovnako to môžu byť bunky žľaznatého pôvodu. FNAB z kožných lézií a sliznice obsahujú šupinaté bunky vo všetkých štádiách vývoja spolu s bunkami zápalu. Preparáty bohaté na bunky môžu obsahovať mnoho individuálnych epiteliálnych buniek, ale čo je pre epiteliálne bunky typické, je ich vzhľad v skupinách alebo v zhlukoch, ktoré často vytvárajú jednu vrstvu buniek (nazývanú tiež monolayer ). V závislosti od hĺbky lézie pozorujeme väčšie množstvo menej vyspelých epiteliálnych buniek. Tieto bazálne a parabazálne bunky sú okrúhle, tmavomodré a v porovnaní s dospelými epiteliálnymi bunkami sú menšie a majú vyšší N/C pomer. Dospelé šupinaté bunky, ktoré sú obyčajne najpočetnejšie, sa vyskytujú v rôznom štádiu keratinizácie. Najväčšie bunky obvykle už strácajú jadro (keratínové lupienky alebo lupiny) alebo ešte stále obsahujú scvrknuté, pyknotické jadro. N/C pomer je veľmi nízky a bunky majú hranatý tvar a často sú dvojito preložené. Čím viac je bunka keratinizovaná, cytoplazma sa Obr. 18 Aspirát z vezikuly u psa s pemphigus foliaceus. Popri veľkom množstve neutrofilov nachádzame niekoľko akantolytických buniek. Tieto bunky sú okrúhle, majú jadro a čiastočne vytvorenú halo zónu v jeho okolí. Obr. 17 Plne zrohovatené, ale okrúhle šupinaté bunky s obsahom jadier, rovnako aj bunky bez jadier, sú prítomné v preparáte. Okrem toho môžeme vidieť skupinu nízko diferencovaných buniek so známkami anizokaryózy, nepravidelne tvarovanými jadrami a mnohopočetnými a abnormálnymi jadierkami. farbí od tmavomodrej po bledomodrú. Bunky môžu taktiež obsahovať vakuoly ako príznak keratinizácie. Dospelé, ale ešte nie keratinizované epiteliálne bunky sú zľahka bazofilné, okrúhle až oválne a majú v strede uložené jadro s jasne definovanou štruktúrou chromatínu, ktorá pripomína jemnú sieť. Tak ako normálne, tak aj nádorové epiteliálne bunky sa ukladajú do charakteristických zhlukov. A hoci vo FNAB preparátoch z epiteliálnych nádorov nachádzame množstvo voľných buniek, zväčša nachádzame aj viacero jasne formovaných zhlukov. Ak je epiteliálny nádor žľazového pôvodu, zhluky buniek môžu mať aj acinárnu štruktúru (usporiadanie do skupiny alebo do kruhu s väčšinou viditeľným vývodom). V niektorých preparátoch dominujú zhluky alebo monolayery normálnych epiteliálnych buniek, ale dôkladné prehľadávanie preparátu taktiež odhalí jednoznačne malígne bunky. Nádory bazálnych buniek sú zriedkavé epiteliálne nádory, ktoré vyrastajú z bazálnej vrstvy epidermy. Histologicky ich vieme rozdeliť do viacerých variácií. Cytologická diagnóza môže byť náročná práve kvôli rôznym cytologickým príznakom. Bazálne bunky sú okrúhleho alebo predĺženého tvaru s jedným jadrom uloženým centrálne alebo bazálne, Obr. 19 Zrelo vyzerajúce plazmacyty z kefkového zoškrabu u mačky s plazmacytárnou gingivitídou.

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť II. Cytológia podkožných opuchov, kožných nádorov a kožných lézií - E. Teske s obsahom jemného chromatínu a jedného, zväčša ťažko detekovateľného jadierka. N/C pomer je 1:1 s uniformnou veľkosťou buniek v jednotlivých zhlukoch. Bazálne bunky môžu byť usporiadané v útržkoch tkaniva, poväčšine s typickým lineárnym alebo palisádovým vzorom (obr. 16). Okrem toho môžeme v preparátoch nájsť dobre diferencované fibrocyty a fibroblasty, rovnako ako pigmentované bazálne bunky a melanocyty. Okrem toho prítomnosť zopár šupinatých buniek v nádoroch bazálnych buniek z bazošupinatých oblastí môže zmiasť vyšetrujúceho ešte viac. Okrem toho v každom nádore môžeme pozorovať aj zopár zápalových buniek, ako sú neutrofily. Napriek tomu, že u niektorých nádorov sa môže vyskytovať výrazný pomer bazálnych buniek vykazujúcich kritériá malignity, ako anizokaryóza, anizonukleolióza a hrudkovitý vzor chromatínu, nádory s nižším stupňom diferenciácie sú považované za benígne. Karcinómy šupinatých buniek (squama cell carcinoma-scs) sú pomerne časté nádory, jednak u psov, ale aj u mačiek. Preparáty z SCS sú bohaté na bunky a obsahujú jednak voľné nádorové bunky, ako aj zhluky buniek. Znaky malignity môžu byť úplne zjavné, ale aj diskrétne. SCS pomerne ľahko ulcerujú a obsahujú potom mnoho zápalových buniek. Nakoľko aspiráty z SCS obvykle obsahujú jednak neoplastické, ako aj normálne šupinaté bunky vo všetkých vývojových štádiách, môžu byť kritériá malignity u vysoko diferencovaných buniek menej zjavné a diagnostika nádoru je preto pomerne náročná. Jedným z charakteristických znakov SCS je nesúlad medzi zrelosťou jadra a cytoplazmy (obr. 17). Nádorové bunky môžu obsahovať veľké množstvo vakuolizovanej cytoplazmy a zároveň kompletné nedotknuté nepyknotické jadro s dobrým detailom vnútornej štruktúry, ktorá môže vykazovať známky malignity. Vakuoly sa niekedy spájajú do jednej veľkej, čo vytvára značné prejasnenie okolo jadra, takže bunka sa podobá na stred terča. Toto je výrazný príznak malignity. Taktiež bunky naukladané jedna vedľa druhej, ktoré sú v rôznom štádiu dozrievania, alebo bunky s nápadne rozdielnou bazofíliou sú podozrivé. Kožné lézie V prvom rade musíme zdôrazniť, že kožné lézie môžu byť sekundárne infikované a zapálené. Ak odoberieme vzorku z takejto lézie, tak informácia o infekčnom zápale sama o sebe nemá veľkú výpovednú hodnotu, obzvlášť keď sa jedná o odtlačkový preparát, výnimkou je zobrazenie veľmi špecifického a závažného patogénu. Mikroorganizmy, ktoré môžu zohrávať úlohu v zápalovom procese, budú prediskutované v ďalšej kapitole. Prebiehajúci zápal a nekróza zásadným spôsobom sťažujú až znemožňujú odhaliť primárnu príčinu vzniku procesu. Preto je odporúčané neviazať sa len na nález z odtlačkového preparátu, ale zároveň odobrať FNAB z okraja lézie/opuchu, kde ešte neprebieha zápalový proces. Ak cytologické vyšetrenie z kožnej lézie nevedie k stanoveniu diagnózy, odporúčame konzultovať nález s dermatológom a/alebo previesť histologické vyšetrenie. Pemphigus foliaceus (PF) je autoimunitný proces, ktorý je namierený proti desmozomálnym adherínom keratinocytov, ktorých adhezívna funkcia je týmto narušená. Keď epidermálne bunky stratia svoje spojenia kvôli degenerácii ich vzájomných premostení, tvoria sa intradermálne rázštepy, vezikuly a buly. Izolované epidermálne bunky nazývame akantolytické bunky. Sú charakteristické svojou bazofilnou cytoplazmou a majú jasne definované okrúhle okraje (obr. 18). Niekoľko buniek má okolo jadra tzv. halo zónu. Jadro je trochu zväčšené a vykazuje drsný, nepravidelný chromatínový vzor. Občas pozorujeme jasné jadierko. Akantolýza je najčastejšie spojená s komplexom pemphigu. Akantolytické bunky sú zväčša obklopené neutrofilmi a/alebo eozinofilmi. Pokiaľ nedochádza k ulceráciám, nepozorujeme žiadne baktérie. (Lymfo)plazmacytárna gingivitída/stomatitída je ochorenie s nejasnou etiológiou a prejavuje sa mnohými spôsobmi u mačiek každého veku. Cytologickú vzorku môžeme získať kefkovou metódou a môže obsahovať plazmacyty, lymfocyty a niekedy aj neutrofily (obr. 19). Morfológia buniek je normálna. Pomer zastúpenia jednotlivých buniek individuálne varíruje od prípadu k prípadu. Odporúčaná literatúra BAKER (R.), LUMSDEN (J.H.) - Color Atlas of Cytology of the Dog and Cat. Mosby Inc, St. Louis. 2000. BARTON (C. L.) - Cytologic Diagnosis of Cutaneous Neoplasia: An Algorithmic Approach. Comp Contin Educ Pract Vet 1987, 9. COWELL (R. L.), TYLER (R. D.), MEINKOTH (J. H.), DENI- COLA (D. B.) -Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 3rd Ed. Mosby Elsevier, St. Louis. 2008. HALL (R. L), MAC WILLIAMS (P. S.) - The cytological examination of cutaneous and subcutaneous masses. Seminars in Veterinary Medicine and Surgery (Small Animal), 1988, 3: 94. PERMAN (V.), ALSAKER (R. D.), RIIS (R. C.) - Cytology of the Dog and Cat. Am Anim Hosp Assoc, South Bend, Indiana, 1979. RASKIN (R. E.), MEYER (D. J.) - Atlas of Canine and Feline Cytology. WB Saunders, Philadelphia, 2001. REBAR (A. H.) - Handbook of Veterinary Cytology. Ralston Purina Company, St. Louis, Missouri, 1979. REINHARDT (S.), STOCKHAUS (C.), TESKE (E.), RU- DOLPH (R.),BRUNNBERG (L.) Assessment of cytological criteria for diagnosing osteosarcoma in dogs. J Small Anim Pract, 2005, 46: 65. STOCKHAUS (C.), TESKE (E.) - Die zytologische Diagnostik von Umfangsvermehrungen der Haut, Unterhaut und Mundhöhle bei Hund und Katze - Eine retrospektive Untersuchung (1995). Kleintierpraxis, 1999, 44: 421. STOCKHAUS (C.), TESKE (E.), RUDOLPH (R.), WERNER (H. G.) - Assessment of cytologic criteria for diagnosing basal cell tumours in the dog and cat. J Small Anim Pract, 2001, 42: 582.

GENERAL COMMISSIONED PAPER Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť III. Cytológia lymfatických uzlín E. Teske (1) ZHRNUTIE Zo všetkých indikácií FNAB sú lymfatické uzliny tie najvďačnejšie. Vo všeobecnosti sú periférne lymfatické uzliny ľahko palpovateľné a fixovateľné jednou rukou, a preto ich môžeme poľahky aspirovať, odber vzorky je nebolestivý a množstvo diagnóz, ktoré prichádzajú do úvahy, nie je veľké. Nie je preto žiadnym prekvapením, že história cytológie lymfatických uzlín siaha až na počiatok minulého storočia. V roku 1904 Greig a Gray použili túto techniku na dôkaz trypanozóm a po publikácii Gurthrieho v roku 1921 sa táto technika začala využívať pri diagnostike takých systémových ochorení ako lymfóm. Klinický cytológ, ktorý vyšetruje FNAB z lymfatickej uzliny, by mal mať informáciu o tom, či daná lymfatická uzlina bola normálnej veľkosti, pravdepodobne zväčšená alebo jednoznačne zväčšená. Mierne zväčšenie lymfatickej uzliny je ťažké klinicky preukázať. Ak zväčšenie je dubiózne a cytologicky neboli odhalené žiadne abnormality, obvyklým záverom je konštatovanie, že uzlina je normálna. Ak je uzlina nespochybniteľne zväčšená, musí na to existovať dôvod. V takomto prípade by mal byť cytológ veľmi opatrný pri konštatovaní negatívneho nálezu a mal by odporúčať histologické vyšetrenie. Môže byť veľmi ťažko odlíšiť normálnu lymfatickú uzlinu od dobre diferencovaného lymfómu. Rovnako by mal mať cytológ informáciu o tom, či FNAB danej uzliny bola prevedená s konkrétnym zámerom. Ak je pacient podozrivý na leishmaniózu alebo na nádorové metastázy, bude preparát omnoho podrobnejšie vyšetrený na prítomnosť parazitov alebo nádorových buniek. Z rovnakých dôvodov je potrebné vedieť, či sa jedná o generalizovanú lymfadenopátiu alebo či je podozrivá len jedna uzlina a v takom prípade je tiež dôležité vedieť, či v oblasti, ktorú daná uzlina drénuje, bol alebo je nejaký nádor. Rovnako je dôležité vedieť, ktorá lymfatická uzlina bola aspirovaná. Mandibulárne uzliny sú často reaktívne, pretože veľa zvierat má zápalový proces v ústnej dutine. Ak sa teda jedná o pacienta s generalizovanou lymfadenopátiou, mandibulárne uzliny nie sú tie najlepšie na cytologické vyšetrenie. No a nakoniec by mal cytológ tiež vedieť, akú terapiu pacient má alebo mal nasadenú. Podanie kortikosteroidov spôsobuje lymfocytolýzu a utlmuje imunitnú odpoveď. To môže zásadným spôsobom skresliť cytologický obraz lymfatických uzlín. Normálny obraz a benígne zmeny Hoci normálnu lymfatickú uzlinu len zriedkavo aspirujeme, je nevyhnutné poznať cytológiu normálnej uzliny, aby sme boli schopní odlíšiť abnormality. Aj v normálnej lymfatickej uzline nachádzame miernu antigénnu stimuláciu a v princípe tak nachádzame B- a T-lymfocyty vo všetkých štádiách zrenia. Napriek tomu väčšinou (85 95 %) nachádzame malé B- a T-lymfocyty. Tieto bunky charakterizuje malé množstvo cytoplazmy, okrúhle jadrá bez jadierok a občas drsná štruktúra chromatínu (obr. 1). Veľkosť buniek (okolo 10 μm) je niekde medzi erytrocytmi a polymorfonukleárnymi granulocytmi. Cytoplazma lymfocytov je skôr krehká a môžeme ju nájsť vo voľných útržkoch pozdĺž celého náteru a nazývajú sa lymfoglandulárne telieska (obr. 1). Po ofarbení podľa May-Grünwald Giemsa sú svetlomodré. Lymfoglandulárne telieska sú typické pre lymfoidné tkanivo a ich prítomnosť je nápomocná pri odlíšení lymfoidných buniek od nediferencovaných malých nádorových buniek karcinómu. Normálna lymfatická uzlina tiež obsahuje aj iné vývojové (1) Department Clinical Sciences Companion Animals, Veterinary Faculty, Utrecht University PO Box 80.154, NL- 3508 TD Utrecht. E-mail: e.teske@uu.nl 1

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť III. Cytológia lymfatických uzlín - E. Teske Obr. 1 FNAB normálnej lymfatickej uzliny psa. Rovnorodá populácia malých lymfocytov. Ružová masa medzi bunkami je jadrový materiál z buniek poškodených pri zhotovovaní náteru. Malé modré fragmenty sú lymfoglandulárne telieska. štádiá buniek lymfoidnej rady, avšak nikdy nie viac ako 10-15 % celej bunkovej populácie. Medzi ostatné, nelymfoidné bunky, nachádzajúce sa v normálnej lymfatickej uzline, radíme polymorfonukleárne neutrofilné a eozinofilné granulocyty, makrofágy, histiocyty, mastocyty, erytrocyty a monocyty. Prehľad rôznych typov buniek nachádzajúcich sa v normálnej lymfatickej uzline je v tab. 1. Nelymfoidné tkanivo Najčastejšou chybnou diagnózou zväčšenej mandibulárnej lymfatickej uzliny je pri palpácii zámena za mandibulárnu slinnú žľazu, či už normálnu alebo zväčšenú (obr. 2). U psov a mačiek sa uzlina nachádza rostrálne od slinnej žľazy a u oboch sa dajú jasne palpačne odlíšiť. Bunky slinnej žľazy sú väčšie ako lymfoidné bunky, obsahujú viac cytoplazmy a vytvárajú acinárne (v tvare žľazy) štruktúry. Chýbajú tu lymfocyty a lymfoglandulárne telieska. U obéznych zvierat môžeme získať dojem, že uzlina je zväčšená, pretože je obklopená hrubou vrstvou tuku. Aspiračnou biopsiou získame prevažne tuk. Treba si však uvedomiť, že väčšina tuku sa rozpustí v alkohole, ktorý je fixačným roztokom vo väčšine používaných farbiacich metód. Tabuľka 1. Typy buniek v normálnej lymfatickej uzline. Obr. 2 Zhluk epiteliálnych buniek v acinárnej štruktúre s mukoidným pozadím. Normálna slinná žľaza. Reaktívna hyperplázia Najčastejšou príčinou generalizovanej lymfadenopátie je reaktívna hyperplázia, ktorou lymfatické uzliny reagujú na antigénny stimul. Dochádza k nej v dôsledku vírusovej, bakteriálnej alebo parazitárnej infekcie, alebo ako reakcia na nádorové antigény, cudzie telesá, kožné choroby alebo na odpadové produkty zápalového procesu kdekoľvek inde v tele. Reaktívna hyperplázia je cytologicky charakterizovaná zvýšeným počtom veľkých blastických buniek, ako sú imunoblasty a centroblasty, v pomere k malým, normálnym lymfocytom. Je tam taktiež viac mitóz a väčšie množstvo lymfoplazmacytoidných buniek (prechodné vývojové štádium medzi imunoblastom a plazmatickou bunkou) a plazmatických buniek (obr. 3). V plazmatických bunkách občas rozoznávame tzv. Russelove telieska, ktoré sa môžu nachádzať v plazmatických bunkách (nazývame ich vtedy Mottove bunky). Sú to vakuoly vyplnené imunoglobulínmi (obr. 4). Obr. 3 Bunkový vzor reaktívnej lymfatickej uzliny psa. Pozorujeme zmiešanú populáciu buniek lymfoidného pôvodu spolu s niekoľkými zrelými lymfocytmi, niekoľkými blastami a jednu plazmatickú bunku (vľavo hore). Taktiež je prítomné jedno nahé jadro histiocytárnej (epiteloidnej) bunky. Typ buniek Frekvencia (%) malý, zrelý lymfocyt 80-90 polymorfná bunka 5-10 mladé, blasty <5 plazmocyty 0-5 eozinofilné granulocyty 0,3 neutrofilné granulocyty 0,1 mastocyty 0,2 makrofágy/histiocyty 0,4 2

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 4 FNAB reaktívnej hyperplastickej lymfatickej uzliny psa. Prítomných je niekoľko plazmatických buniek s Russelovými telieskami. V závislosti od stimulujúcej príčiny tam môžeme nájsť aj iné typy buniek, ako sú makrofágy, polymorfonukleárne granulocyty, pri kožných ochoreniach najmä eozinofilné granulocyty, mastocyty. Lymfadenitída Obr. 6 Pes s leishmaniózou. Vo veľkých makrofágoch sú prítomné amastigoty, ale amastigoty pozorujeme aj samostatne v pozadí náteru. Prítomných je aj niekoľko plazmatických buniek. Obr. 5 Purulentná lymfadenitída. Zmes malých lymfocytov a množstva neutrofilov. V pozadí je niekoľko vláken degenerovaného jadrového materiálu. Prítomnosť veľkého množstva zápalových buniek v lymfatickej uzline nazývame lymfadenitídou. Purulentný a granulomatózny zápal lymfatickej uzliny odlíšime podľa typu zápalových buniek. Purulentná lymfadenitída je charakterizovaná prítomnosťou veľkého množstva polymorfonukleárnych granulocytov, obvykle spolu s veľkou populáciou reaktívnych lymfoidných buniek a niekoľkými makrofágmi. Odlíšiť purulentnú lymfadenitídu od reaktívnej hyperplázie môže byť občas ťažké alebo, naopak, pomerne jednoduché ako pri bakteriálnej lymfadenitíde. Pri tejto pozorujeme veľké množstvo polymorfonukleárnych granulocytov, nekrózy a niekedy baktérie (obr. 5). Lymfoidné bunky môžu úplne chýbať. Zvýšené množstvo eozinofilných granulocytov pozorujeme najmä pri alergických dermatitídach a pri parazitárnych infekciách je leishmanióza (obr. 6). Ak sú prítomné baktérie, tieto nachádzame zväčša v granulocytoch, parazity nachádzame väčšinou v makrofágoch. Granulomatózna lymfadenitída je taktiež obvykle charakterizovaná obrazom miernej lymfoidnej reakcie a spolu s ním aj prítomnosťou zvýšeného množstva makrofágov, epiteliálnych buniek a mnohojadrových gigantických buniek. Epiteliálne bunky sú bunky retikula s predĺženým oválnym jadrom, často na jednom konci vrúbkovaným, a obsahuje zľahka hrudkovitý vzor chromatínu. V preparátoch týmto bunkám často chýba cytoplazma. Niekedy sa tieto bunky nachádzajú v zhlukoch a môžu tak pripomínať metastázy karcinómu. Granulomatóznu lymfadenitídu pozorujeme pri toxoplazmóze, plesňových a kvasinkových infekciách a pri niektorých špecifických bakteriálnych infekciách (napr. infekcie Mykobaktériami) (obr. 7). Dermatopatická lymfadenopátia je granulomatózna lymfadenopátia, ktorá sa vyskytuje pri kožných ochoreniach, ktoré sa manifestujú najmä pruritom, šupinatením kože a poškodením kože ako takej. Bunkový obraz je charakteristický prítomnosťou veľkého množstva hnedočiernych melanínových granúl a zopár eozinofilných granulocytov. Taktiež sa tu vyskytujú dendritické bunky. Sú to histiocyty predĺženého tvaru so sieťovitým jadrom a charakteristicky vrúbkovaným jadrom (obr. 8). Obr. 7 V tejto FNAB granulomatóznej lymfadenitídy v dôsledku mykobakteriálnej infekcie u mačky pozorujeme niekoľko veľkých histiocytov s niekoľkými neofarbenými tyčinkami baktérií na ľavej strane obrázku. 3

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť III. Cytológia lymfatických uzlín - E. Teske Obr. 8 Dermatopatická lymfadenopátia u psa. Je tam niekoľko hnedočiernych granúl melanínu na pozadí, niekoľko zrelých lymfocytov a veľké jadro dendritickej bunky. Malígne zmeny Lymfatické uzliny filtrujú lymfu z konkrétnej časti tela a odstraňujú z nej obsiahnutý cudzorodý materiál. Aj nádorové bunky môžu byť zanášané do lymfatických uzlín. Imunitný systém dokáže v lymfatickej uzline rozoznávať špecifické antigény, ktoré nádorové bunky prezentujú na svojom povrchu, a následne ich odstraňovať. Niekedy však nádorové bunky dokážu uniknúť imunitnej polícii a pomnožiť sa priamo v lymfatickej uzline. Odtiaľto sa potom môžu metastázy šíriť do celého tela. Okrem metastáz nádorových buniek sa môže lymfatická uzlina zmeniť na nádor krvotvorných buniek, ktoré sa v lymfatickej uzline normálne nachádzajú. V nasledujúcom texte sa budeme venovať obom týmto malignitám, ktoré sa vyskytujú v lymfatických uzlinách. Metastatické malignity Kompletný výmer všetkých metastatických malignít v lymfatických uzlinách nemá význam menovať, ale principiálne všetky malígne nádory môžu metastázovať do regionálnych lymfatických uzlín. Sarkómy sa vo všeobecnosti rozptyľujú skôr hematogénnou cestou ako lymfogénnou. Karcinómy, melanómy a mastocytómy často nachádzame metastázovať do lymfatických uzlín, hoci toto závisí od histologického podtypu. Principiálne môžeme povedať, že ak v cytologickom preparáte nachádzame akékoľvek bunky, ktoré do lymfatickej uzliny normálne nepatria, jedná sa o podozrenie z malignity. Treba však brať do úvahy aj skutočnosť, že pri aspirácii z lymfatickej uzliny môžu byť aspirované aj nejaké bunky z okolitých tkanív mimo uzliny. Preto je vždy nevyhnutné posúdiť kritériá malignity cudzích buniek ešte pred tým, ako začneme hovoriť o malignite. Taktiež je možné, že v jednom aspiráte získame bunky primárneho nádoru spolu s bunkami lymfatickej uzliny, čo následne môže viesť k podozreniu na metastázu. K takejto situácii môže dôjsť vtedy, ak bioptujeme supramamárnu lymfatickú uzlinu simultánne s najkaudálnejšou jednotkou mliečnej žľazy, ktorá obsahuje nádor. Obr. 9 Metastáza adenokarcinómu mliečnej žľazy v predlopatkovej lymfatickej uzline u psa. Okrem abnormálnych buniek môže byť cytologický obraz lymfatickej uzliny s metastázou charakterizovaný benígnymi zmenami ako dôsledok reakcie imunitného systému na nádorové bunky. Ak sa v lymfatickej uzline nachádza metastáza, môžeme pozorovať zvýšené množstvo makrofágov, plazmatických buniek a mladých veľkých lymfoidných buniek. Cytologický obraz samotnej metastázy v lymfatickej uzline záleží vo veľkej miere na histologickom type primárneho nádoru. Pri anaplastickom karcinóme sú to prevažne jednotlivé bunky, ktoré nepatria do lymfatickej uzliny a môžu byť rôznej veľkosti a tvaru. Väčšinou nachádzame rôzne bunky, ktoré sú niekoľkokrát väčšie ako lymfoidné bunky a veľmi ľahko ich rozoznáme aj pri malom zväčšení. Nachádzame mnoho kritérií malignity, ako sú: rôzny N/C pomer, veľké jadrá, vysoký mitotický index, mnohopočetné a občas patologické jadierka. Pri karcinómoch s vyšším stupňom diferenciácie, ako sú napríklad adenokarcinómy, môžeme pozorovať zhluky buniek a občas dokonca aj bunky v acinárnej štruktúre (obr. 9). Makrofágy a epiteloidné bunky vytvárajú často agregáty a syncýciá, ktoré môžu pripomínať zhluk metastázujúceho karcinómu a nesmú sa s nimi zamieňať. Iným typom karcinómu, ktorý môžeme poľahky klasifikovať, je SCS (squama-cell-carcinoma, karcinóm šupinatých buniek). Pri tomto type nádoru pozorujeme malé zhluky malých buniek karcinómu so skôr malou, tmavomodrou cytoplazmou a popri nich bunky s veľkým množstvom cytoplazmy v rôznom štádiu keratinizácie. Pri farbení podľa May-Grünwald Giemsa je keratinizácia poľahky rozpoznateľná podľa jednotného zafarbenia cytoplazmy do bledomodra a niekedy obsahuje aj drobné kvapôčky. Na rozdiel od normálnej keratinizujúcej epiteliálnej bunky nestrácajú bunky karcinómu počas keratinizácie jadro, ale, naopak, ostáva prítomné po celý čas. V každej lymfatickej uzline sa nachádza zopár mastocytov, obzvlášť pri prebiehajúcich benígnych zmenách. Literatúra však uvádza, že ich počet nikdy neprekročí 3 % bunkovej populácie. Väčšie množstvo vytvára podozrenie na metastázujúci mastocytóm alebo dokonca na mastocytárnu leukémiu. Mastocyty môžu obsahovať veľké množstvo fialovomodrých granúl, ktoré sú občas natoľko početné, že 4

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 10 Metastázy mastocytómu do lymfatickej uzliny. Početné mastocyty sú rozdielnej veľkosti, majú vystupujúce jadierka a môžeme pozorovať dvojjadrové bunky. kompletne zakryjú bunkové jadro. Bunky však môžu byť len poriedko granulované, dokonca negranulované (obr. 10). Posledné menované je potom ťažké rozpoznať. Ďalším nádorom, ktorý niekedy metastázuje do lymfatickej uzliny, je malígny melanóm. Bunky tohto nádoru sú väčšie ako lymfoidné bunky, sú rôzneho tvaru od oválneho po vretenovitý a majú jemne oválne jadro. U malígneho melanómu pomerne často pozorujeme jednak mnohopočetné jadrá a jednak jadrá bizarného tvaru. Jadierko nie je vždy viditeľné. Bunky sú obvykle charakteristické prítomnosťou čiernych až hnedočiernych granúl v cytoplazme. Existujú však aj amelanotické melanómy. Obsahujú len malé množstvo alebo žiadne granuly a sú preto ťažko rozpoznateľné. Melanofágy si môžeme pomýliť s melanocytmi. Melanofágy sú fagocytujúce bunky, ktoré fagocytovali pigment a vyskytujú sa v lymfatických uzlinách, obzvlášť pri kožných ochoreniach sprevádzaných svrbením a poškodením kože. Tieto bunky zväčša nie je ťažké rozoznať, nakoľko ich cytoplazma obsahuje vakuoly a aj iný fagocytovaný materiál, ako melanín. Okrem toho nevykazujú žiadne kritériá malignity. Tabuľka 2. Zjednodušená klasifikácia lymfómov podľa buniek, postavená na Kiel klasifikácii podľa Lennerta, 1974. Lymfocytárny Imunocytárny Plazmacytárny Centrocytárny Centroblastický/centrocytárny Centroblastický čistý centroblastický anaplastický centrocytárny polymorfný centroblastický Lymfoblastický Imunoblastický Iný histiocytárny mnoholaločnaté bunky Obr. 11 Transformačná schéma normálneho lymfocytu (podľa Lennerta) (z: Van Heerde (P.) - Malígne lymfómy a histiocytárne nádory. Cytológia a iné diagnostické metódy. Dizertačná práca, Uitg Rodophi, Amsterdam, 1984). Lymfoidné malignity Primárna malígna transformácia lymfatickej uzliny poväčšine zahŕňa bunky lymfatického systému. Epiteliálne bunky a histiocyty sú len zriedka zahrnuté. U psov a mačiek sa tieto lymfoidné nádory nazývajú malígny lymfóm alebo lymfosarkóm. Sú porovnateľné s non-hodkinovským lymfómom. Nakoľko Hodkinovský typ lymfómu nebol doteraz u psov a mačiek preukázateľne potvrdený, lymfoidné nádory u týchto zvierat jednoducho nazývame malígne lymfómy. Cytologický obraz malígneho lymfómu sa líši od pacienta k pacientovi. Môžeme povedať, že každé vývojové štádium sa môže zvrhnúť do malignity či zablokovať ďalšiu diferenciáciu alebo autonómnu proliferáciu konkrétneho typu buniek (obr. 11). Preto sa bunky, ktoré sú malígne, neodlišujú od normálnych buniek v cytologickom preparáte. Cytologická diferenciácia sa opiera o prítomnosť monotónnej bunkovej populácie, zatiaľ čo v nelymfomatóznej lymfatickej uzline môžeme pozorovať všetky štádiá buniek lymfoidnej série. U ľudí bolo vyvinutých mnoho klasifikačných schém non-hodkinovského lymfómu. Tzv. Kiel klasifikácia (Lennert, 1974) je postavená kompletne na transformačnej schéme normálnych lymfocytov a je vysoko použiteľná pre potreby cytológie (tab. 2) (obr. 12). V literatúre bola táto Kiel klasifikácia úspešne aplikovaná na malígne lymfómy psov. Doteraz však nie sú k dispozícii informácie o obdobnej aplikácii tejto klasifikácie na malígny lymfóm mačiek. Pre čitateľa, ktorého táto tematika zaujíma, nasleduje nižšie detailnejší popis rôznych typov lymfómov. Sú to informácie zaujímavé najmä z vedeckého pohľadu a na ilustráciu rôznorodosti výskytu foriem malígneho lymfómu, ale z praktického hľadiska stanovenie diagnózy malígny lymfóm a jeho ďalšie triedenie na vysoký a nízky stupeň malignity je zväčša dostatočné. Ak aspirovaná populácia buniek pozostáva predovšetkým z charakteristických blastov, stanoviť diagnózu malígneho lymfómu nie je ťažké. Napriek tomu sú formy lymfómu, pri ktorých je najmä pre menej skúseného cytológa ťažké odlíšiť nádorové bunky od dospelých foriem lymfocytov. Tak 5

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť III. Cytológia lymfatických uzlín - E. Teske NÍZKO MALÍGNE NON-HODKINOVSKÉ LYMFÓMY VYSOKO MALÍGNE NON-HODKINOVSKÉ LYMFÓMY A MALÍGNE HISTIOCYTÓMY B-lymfocyt T-lymfocyt lymfoplazmacytárna bunka (plazmacytoidný lymfocyt) veľký centroblast (veľký nelipnúci) B-lymfoblast Burkittovho typu (malý nelipnúci) T-lymfoblast (stočený T) chlpatá bunka plazmocyt mycosis fungoides lymfoblast iný (nedefinovaný) B-imunoblast T-imunoblast malé centrocyty (malé lipnúce) veľké centrocyty (veľké lipnúce) mnoholaločnatá malígny histiocytárny nádor Obr. 12 Schematický nákres malígneho lymfómu podľa Kiel klasifikácie (podľa Lennerta) (z: Van Heerde (P.) - Malígne lymfómy a histiocytárne nádory. Cytológia a iné diagnostické metódy. Dizertačná práca, Uitg Rodophi, Amsterdam, 1984). Obr. 13 Lymfoplazmocytoidný lymfóm. Niekoľko malých lymfoidných buniek s hojnou cytoplazmou a mierne excentricky umiestneným okrúhlym jadrom. tomu môže byť napríklad v prípade lymfocytárneho alebo centrocytárneho lymfómu. Problematické sú aj prípady, kedy lymfóm zahŕňa viacero typov buniek, ako je tomu pri imunocytárnom alebo centroblastickom/centrocytárnom lymfóme. Pri mnohých takýchto prípadoch je rozhodujúca kombinácia zväčšenej lymfatickej uzliny a obraz nereaktívnej bunkovej populácie, najmä ak je táto jednotvárna. Ak v neistých prípadoch zaznamenávame prítomnosť plazmatických alebo iných zápalových buniek, odporúča sa konzultácia so skúsenejším odborníkom alebo treba diagnózu potvrdiť histologickým vyšetrením chirurgického bioptátu. Občas preparáty obsahujú takmer výlučne jadrá a rozmazaný jadrový materiál. K tomuto môže dochádzať jednak pri neodbornom zhotovení náteru, ale môže to byť aj v dôsledku nekrózy. Ak takýto preparát podrobne prehľadávame a obzvlášť nezanedbáme okraje preparátu, môžeme nájsť oblasti s neporušenými bunkami. Niekedy je väčšina týchto voľných jadier v preparáte tvorená konečnými pozostatkami jadierok. Toto budí podozrenie na malígny lymfóm, ale je riskantné postaviť diagnózu len na tomto príznaku. Obr. 14 Plazmacytárny lymfóm. Veľké, atypické plazmatické bunky. 6

EJCAP - Vol. 18 - Issue 2 October 2008 Obr. 15 Centroblastický/centrolytický lymfóm. Zmiešaná populácia veľkých centroblastov, malých centrocytov (lipnúce bunky) a lymfocytov. Morfológia psích lymfómov podľa Kiel klasifikácie Lymfocytárny lymfóm Tento typ lymfómu pozostáva z monotónnej populácie malých, dozretých lymfocytov. Cytologický obraz je často ťažké odlíšiť od nereaktívnej, normálnej lymfatickej uzliny. Ak tento obraz nachádzame u jednoznačne zväčšenej lymfatickej uzliny bez akýchkoľvek príznakov reaktivity, jedná sa vysoko pravdepodobne o tento typ lymfómu. Ak lymfocytárny lymfóm pozostáva z B-lymfocytov, ktoré možno potvrdiť len stanovením príslušnosti pomocou imunotypizácie, majú tieto okrúhle jadrá a jemne drsnejší chromatínový vzor. Týmto sa líšia od T-lymfocytárnych lymfómov, ktorých jadro je jemne vrúbkované a majú hustý chromatínový vzor. Oba typy vykazujú nízky stupeň množenia buniek. S lymfocytárnym lymfómom sa u psa stretávame zriedkavo. Lymfoplazmocytoidný imunocytárny lymfóm Najdôležitejšou bunkou tohto lymfómu je imunocyt, malá lymfoidná bunka, ktorá obsahuje väčšie množstvo cytoplazmy ako bunky lymfocytárneho lymfómu a mierne excentricky uložené okrúhle jadro. Tento typ buniek sa vyvinul trochu viac v smere vývoja plazmatických buniek. Lymfóm sa nazýva lymfoplazmocytoidný lymfóm (obr. 13). Okrem toho tu nachádzame zopár centrocytov, imunoblastov a plazmatických buniek. Väčšinu však, samozrejme, tvoria malé lymfocyty. V takom prípade sa používa pojem imunocytárny lymfóm. Plazmacytárny lymfóm Výskyt plazmacytárneho lymfómu v lymfatických uzlinách je extrémne zriedkavý (obr. 14). Pri tomto type lymfómu nachádzame prevažne atypické plazmacyty v rôznych štádiách zrenia. Centrocytárny lymfóm Tento typ lymfómu pozostáva prevažne z centrocytov. Obr. 16 (Polymorfný) centroblastický malígny lymfóm. Monomorfná populácia okrúhlych centroblastov (s mnopočetnými malými jadierkami). Takisto sú prítomné makrofágy hviezdnej oblohy s bunkovým debris - farbiteľné telieska (jedná sa o farbiteľné granuly, ktoré sú fragmentami kondenzovaného chromatínu, pozn. prekladateľa). Centrocyty sú malé bunky s nepravidelným a občas vrúbkovaným jadrom. Cytoplazmu často nemajú alebo je veľmi svetlá. Chromatínový vzor je jemný a obvykle nepozorujeme jadierka. Centroblastický/centrocytárny lymfóm Ako napovedá samotný názov, tento typ lymfómu pozostáva z oboch typov buniek, centrocytov a centroblastov (obr. 15). Centroblasty majú veľké, okrúhle jadro s mnohopočetnými jadierkami, ktoré často ležia popri jadrovej membráne. Cytoplazmu tvorí tenký, tmavomodrý lem. Nachádzame mnoho mitóz. Ak je percento centroblastov vyššie ako 30 50 %, lymfóm sa nazýva centroblastický. Centroblastický lymfóm Najdôležitejšou bunkou tohto lymfómu je centroblast, ale môžeme tu nájsť aj niekoľko centrocytov. Existujú dve špecifické formy. Ak okrem centroblastov nachádzame aj imunoblasty, nádor sa nazýva polymorfný centroblastický lymfóm (obr. 16). Ak nachádzame viac ako 50 % imunoblastov, nádor je považovaný za imunoblastický lymfóm (pozri nižšie). Ďalšou špeciálnou formou je anaplastický centrocytárny lymfóm. Anaplastické centrocyty sú veľké centrocyty s veľkým, nepravidelne tvoreným jadrom. Cytoplazma sa často farbí omnoho svetlejšie ako u centroblastov. U psov sú centroblastický, polymorfný centroblastický a anaplastický centrocytárny lymfóm najčastejšie sa vyskytujúce lymfómy. Lymfoblastický lymfóm Lymfoblastický lymfóm je u psov zriedkavý. Lymfoblasty sú bunky strednej veľkosti okrúhleho až oválneho tvaru s tenkým lemom jemne až stredne bazofilne sa farbiacej cytoplazmy, ktorá môže byť vakuolizovaná. Jadro obsahuje chromatín s jemným vzorom a niekoľkými malými jadierkami. Môže byť prítomných mnoho mitóz. U ľudí môže tento typ lymfómu obsahovať makrofágy hviezdnej oblohy (obr. 16), ktoré sa považujú za typické jedného subtypu, nazývaného 7

Klinická cytológia spoločenských zvierat: Časť III. Cytológia lymfatických uzlín - E. Teske Obr. 17 Imunoblastický lymfóm u psa. Okrem nejakých nahých jadier je prítomná populácia monomorfných imunoblastov charakterizovaných veľkým, centrálne uloženým jadierkom. tiež Burkittov lymfóm. U psov sa však tieto typy makrofágov (veľké, vakuolizované s obsahom rôznorodého materiálu) vyskytujú v rôznych typoch lymfómov. Imunoblastické lymfómy Ak sa v preparáte nachádza aspoň 50 % imunoblastov, stanovujeme diagnózu imunoblastický lymfóm (obr. 17). Imunoblasty sú veľké bunky s veľkým okrúhlym a často excentricky uloženým jadrom. Ich jadro je charakteristické jedným veľkým, centrálne uloženým jadierkom. Imunoblasty majú hrubý lem modrej cytoplazmy. Okrem veľkých imunoblastov s mierne excentricky uloženým jadrom a veľkou cytoplazmou nachádzame u psov aj menší typ imunoblastov s menším jadrom uloženým centrálne v bunke. Spoločnou charakteristikou veľkých a malých imunoblastov je centrálne uložené veľké jadierko. Iné typy Medzi ostatné, sporadicky sa vyskytujúce typy lymfómov patria mycosis fungoides, histiocytárny lymfóm (obr. 18) a multilobárny lymfóm. Vo svetle ich zriedkavého výskytu im v tomto texte nie je venovaný väčší priestor. Obr. 18 FNAB lymfatickej uzliny s histiocytárnym sarkómom. Veľké bunky, občasne s malými cytoplazmatickými vakuolami s jadrami veľmi nepravidelného tvaru. Môžu byť prítomné jadrá prstencovitého tvaru a fagocytózy (nepozorujeme na tomto obrázku). Odporúčaná literatúra Fournel-Fleury C, Magnol JP, Guelfi JF. Colour atlas of cancer cytology of the dog and cat. Conference Nationale des Veterinaires Specialises en Petits Animaux, Paris, 1994, 221-321. Messick JB. The lymph nodes. In: Cowell RL, Tyler R.D, Meinkoth JH., Denicola DB.Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. 3rd Ed. Mosby Elsevier, St. Louis. 2008; p179-192. Mills JN. Lymph node cytology. Vet Clin North Am, Small Anim Pract. 1989; 19: 697-717. Teske E, Wisman P, Moore PF, van Heerde P. Histological classifi cation and immunophenotyping of caninen non-hodgkin s lymphomas. Unexpected high frequency of T-cell Lymphomas with B-cell morphology. Experimental Hematology. 1994; 22:1179-1187. Teske E, van Heerde P. Diagnostic value and reproducibility of fi ne-needle aspiration cytology in canine malignant lymphoma. Veterinary Quarterly. 1996; 18: 112-115. van Heerde (P.) Malignant lymphomas and histiocytic tumours. Cytology and other diagnostic methods. Thesis, Uitg Rodophi,Amsterdam, 1984. Thrall MA. Cytology of lymphoid tissue. Comp Cont Ed Pract Vet. 1987; 9: 104-111. Zinkl JG, Keeton KS. Lymph node cytology - I., California Veterinarian. 1979; 33(1): 9-11. Zinkl JG, Keeton KS. Lymph node cytology - II., California Veterinarian. 1979; 33(4): 20-23. Zinkl JG, Keeton KS. Lymph node cytology III, Neoplasia. California Veterinarian. 1981; 35(5): 20-23. 8