NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NẤM MEN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY Ở VÙNG Ô NHIỄM DIOXIN SÂN BAY QUÂN SỰ ĐÀ NẴNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NẤM MEN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY Ở VÙNG Ô NHIỄM DIOXIN SÂN BAY QUÂN SỰ ĐÀ NẴNG Đào Thị Lƣơng, Trần Thị Lệ Quyên, Dƣơng Văn Hợp Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN MỞ ĐẦU Sân bay quân sự Đà Nẵng là điểm nóng về ô nhiễm dioxin với thời gian kéo dài gần 40 năm và dư lượng tồn đọng vẫn còn cao. Để khắc phục hậu quả khôn lường này, các cơ quan khoa học của Việt Nam đã và đang nghiên cứu các phương pháp lý, hóa, sinh học để loại bỏ đioxin khỏi môi trường. Sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu đất, nước nhiễm đioxin có một ý nghĩa quan trọng để chứng minh cho các giả thiết về sự thích nghi, biến đổi gen của quần thể vi sinh vật ở những vùng nhiễm độc cao. Các nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật trong đất ô nhiễm dioxin ở Đà Nẵng đã được nghiên cứu rất nhiều nhưng chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên bản lá cây sống ở vùng này có khác biệt so với ở các vùng không ô nhiễm. Trong bài báo này, chúng tôi báo cáo kết quả Nghiên cứu đa dạng sinh học của nấm men phân lập từ lá cây ở vùng ô nhiễm dioxin sân bay quân sự Đà Nẵng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Các mẫu dùng cho nghiên cứu Þa ióm lêy méu: ë 2 khu vùc «nhiôm næng nhêt trong s n bay qu n sù µ N½ng: Hå sen lµ n i cã vþ trý thêp nhêt trong s n bay n i gom n íc m a, lµ n i tëp chung l îng lín dioxin bþ röa tr«i; vµ vþ trý thø 2 lµ n i tëp kõt dioxin trong s n bay tr íc y. MÉu l : 20 mẫu lá cây (Kí hiệu DN1 DN20). Các chủng vi khuẩn kiểm định: Shigella flexneri, Bacillus subtilis, Sarcina lutea, E.coli của Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN. Môi trƣờng - Môi trường YM (g/l): glucoza- 10; pepton- 5; cao men- 3; cao malt- 3; thạch-18; ph- 6. - Môi trường xác định hoạt tính sinh enzym ngoại bào (g/l): cơ chất (tinh bột, kitin, casein, CMC)- 1; thạch- 18; ph- 7. - Môi trường nuôi vi khuẩn kiểm định (g/l): Cao thịt- 3, Pepton-10, NaCl-5, ph7 Phƣơng pháp - Phân lập nấm men. Theo phương pháp pha loãng [1]. - Hoạt tính enzym. Xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch sử dụng các cơ chất: Tinh bột (amylaza), CMC (cellulaza), kitin (chitinaza), cazein (proteinaza) và tween 80 (lipaza)[1]. - Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định. Theo phương pháp khuếch tán trên thạch [1]. - Xác định khả năng lên men. Quan sát thể tích khí CO 2 sinh ra trong ống Durham sau 24 giờ [1]. - Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại: Trình tự của rdna 26S đoạn D1/D2 được xác định theo phương pháp của Kurtman và Robnett, sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và đồng tác giả [4; 6]. Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura, sử dụng phương pháp của Saitou và Nei [3; 5]. 1

Phân lập KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu thập 20 mẫu lá tại các vùng ô nhiễm Dioxin ở sân bay quân sự Đà Nẵng. Phương pháp pha loãng được sử dụng cho phân lập nấm men. Kết quả phân lập được thể hiện ở bảng 1. Trong số 20 mẫu lá thu thập ở sân bay Đà Nẵng, phân lập được 71 chủng nấm men. Có 3 mẫu (15%) không tìm thấy nấm men. Số lượng chủng nấm men phân lập trên một mẫu lớn hơn 9 ở 3 mẫu lá. Trung bình số chủng phân lập trên mẫu lá là 4,4. Kết quả này thấp hơn hẳn so với các kết quả chúng tôi phân lập từ các Vườn Quốc gia Cúc Phương và Vườn Quốc gia Phong Nha- Kẻ Bàng, trung bình 7 và 7,5 chủng nấm men/mẫu lá [2]. Như vậy, dioxin không những ảnh hưởng đến đa dạng của vi sinh vật trong đất mà còn ảnh hưởng đến các vi sinh vật trên bản lá cây sống ở trong vùng này. Bảng 1. Số lƣợng nấm men phân lập từ các mẫu lá STT Tên mẫu Tên lá cây SL chủng phân lập 1 DN 1 Duối nhám - Streblus asper Lour. 11 2 DN2 Gai toàn tơ - Boehmeria holosericea Blume 11 3 DN3 Phèn đen - Phyllanthus reticulatus Poir. 9 4 DN4 Cỏ lào- Eupatorium odoratum Lour. 6 5 DN5 Sảng - Sterculia lanceolata Cav. 2 6 DN6 Lại dạng ba gân - Jasminum subtrilinerve Blujme 1 7 DN7 Ổi - Psidium guiava Lour. 3 8 DN8 San cặp - Paspalum conjagatum Berg. 4 9 DN9 Trinh nữ - Mimosa pudica Lour. 3 10 DN10 Cói - Fimbristylis sp. 0 11 DN11 Muôi trắng - Melastoma septemnervium (Lour.) Merr. 0 12 DN12 Bòng bòng nhật - Lygodium japonicum Thunb. 2 13 DN13 Glochidion sp. 1 14 DN 14 Đơn buốt - Bidens pilosa Lour. 0 15 DN15 Ké hoa đỏ - Urenna lobata Lour. 5 16 DN16 Hoa ngũ sắc - Lantana camara Lour. 4 17 DN17 Cỏ lào - Eupatorium odoratum Lour. 1 18 DN18 Bình vôi - Stephania rotunda Lour. 2 19 DN19 Trinh nữ - Mimosa pudica Lour. 3 20 DN20 San cặp - Paspalum conjagatum Berg. 3 Tổng cộng: 71 chủng Khả năng sinh các hoạt chất sinh học của các chủng nấm men phân lập Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng nấm men phân lập 71 chủng nấm men được nuôi cấy và xác định khả năng phân giải các cơ chất tinh bột, cazein, kitin, xenluloza. Kết quả tuyển chọn 2 khả năng sinh enzym ngoại bào của nấm men được thể hiện ở bảng 2. Kết quả cho thêy kh n ng ph n gi i c c c chêt cña 71 chñng nêm men lµ kh c nhau; cao nhất lµ trên cơ chất CMC, sè chñng cã ho¹t týnh enzym m¹nh chiõm 28%. Trªn c chêt tinh bét, cazein vµ kitin, sè chñng cã ho¹t týnh enzym m¹nh chiõm 11-17%, y còng lµ tû lö lín v nêm men chñ yõu chø sö dông êng

cho sinh tr ëng, kh n ng sinh enzym ngo¹i bµo rêt Ýt. Trªn cơ chất tinh bét, cazein vµ kitin, sè l îng chñng kh«ng sinh enzym ph n gi i c c c chêt này chiõm 17-27 %, thấp nhất là CMC chiếm 4%. Trong 4 lo¹i c chêt trªn, c 71 chñng nêm men Òu sinh Ýt nhêt 1 lo¹i enzym. Khác hẳn với tỷ lệ thấp của các chủng được phân lập trên mỗi mẫu lá, số lượng các chủng nấm men có khả năng sinh enzym ngoại bào mạnh trong nghiên cứu này (8-20%) cao hơn hẳn so với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi (0-15 %) [2]. Bảng 2. Số lƣợng chủng nấm men có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất Khả năng sinh enzym Vòng phân giải cơ chất (D-d, mm) Tinh bột Kitin Cazein CMC Mạnh 8 (11 %) 12 (17 %) 11 (15 %) 20 (28 %) TB 17 (24 %) 18 (25 %) 48 (68 %) 32 (45 %) Yếu 27 (38 %) 24 (34 %) 0 (0 %) 16 (23 %) Không 19 (27 %) 17 (24 %) 12 (17 %) 3 (4 %) Tổng cộng 71 71 71 71 Chú thích: Mạnh D-d 20 ; Trung bình 10 D-d <20; Yếu 0 < D-d <10 Khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập Nuôi cấy và đánh giá khả năng lên men của 71 chủng nấm men. Kết quả cho thấy, các chủng nấm men phân lập từ các mẫu lá cây ở vùng này hầu như không có có khả năng lên men. Chỉ có 1/71 chủng có khả năng lên men yếu (chiếm 1,4 %). Khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm men phân lập Số lượng chủng nấm men có khả năng sinh kháng sinh kháng lại 4 loại vi khuẩn kiểm định là rất ít (19,7 %). Nhận xét: Từ các kết quả trên cho ta thấy số lượng chủng nấm men phân lập trên bản lá ở vùng ô nhiễm dioxin thấp hơn so với các vùng khác, nhưng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học lại cao hơn hẳn. Phân loại các chủng nấm men phân lập Dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc đã chọn 50 trong số 71 chủng nấm men phân lập, để xác định trình tự ADNr 26S. ADN tổng số của 50 chủng nấm men lựa 3 chọn đã được tinh sạch. Nhân đoạn ADN chứa đoạn D1/D2 với cặp mồi N1, N4. Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động 3 Avant. Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal W 1.83, chương trình NJplot được dùng xây dựng cây phân loại. TÝnh to n bootstrap îc thùc hiön dùa trªn 0 nhãm ngéu nhiªn, chø cã nh ng gi trþ trªn 50% îc thó hiön. M sè GenBank i kìm sau tªn loµi. Các c y ph hö được x y dựng dựa trªn tr nh tự ADNr 26S đoạn D1/D2 của c c chủng nghiªn cøu với các loài gần gũi nhất với các loài đã biết thuộc c c chi Bullera, Candida, Cryptococcus, Jaminaea, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporisorium, Pseudozyma, Trichosporon,Ustilago. Kết quả ở các hình 1-5 và bảng 3 cho thấy, 50 chủng nấm men nghiên cứu thuộc 9 chi, 23 loài khác nhau, trong đó có 10 loài được nghi ngờ là loài mới. Số lượng chủng phân lập được chủ yếu tập chung ở 2 chi Pseudozyma và Cryptococcus. Chi Pseudozyma có 20 chủng thuộc 3 loài đã biết, được phân lập từ 8 mẫu lá (chiếm 47%

số mẫu lá có nấm men). Đặc biệt là loài Pseudozyma hubeiensis chiếm số lượng chủng rất lớn 15/50 chủng (chiếm 30%), chúng được phân lập trên 7 mẫu lá thu thập (chiếm 41% số mẫu lá có nấm men). Chi Cryptococcus có 9 chủng được phân lập từ 5 mẫu lá, thuộc 6 loài, 3 loài nghi ngờ là loài mới. Tiếp theo là chi Rhodotorula có 5 chủng thuộc 4 loài đều nghi ngờ là loài mới (chiếm 40 % số loài nghi ngờ loài mới), được phân lập từ 4 mẫu lá. Chi Ustilago có 5 chủng thuộc 3 loài, 2 loài nghi ngờ là loài mới. Chi Rhodosporidium có 5 chủng thuộc 3 loài, 1 loài nghi ngờ là loài mới. Chi Jaminaea có 2 chủng thuộc 1 loài đã biết. Chi Sporisorium có 2 chủng thuộc 1 loài đã biết. Chi Candida có một chủng thuộc 1 loài đã biết. Chi Trichosporon có 1 chủng thuộc 1 loài đã biết. Trong nghiên cứu này, không tìm thấy nấm men sinh bào tử bắn, mặc dù chúng tôi phân lập được các nấm men thuộc chi Cryptococcus và Rhodotorula là 2 chi thường nằm đan xen với các chi của nấm men sinh bào tử bắn trong cây phát sinh chủng loại. Trong nghiên cứu trước đây và hiện nay (chưa công bố), chúng tôi phân lập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương và Vườn Quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng đều tìm thấy nấm men sinh bào tử bắn với số lượng lớn [2] DN3.8 0.05 DN3.6 Jaminaea angkoriensis_eu587489 DN3.1 64 DN4.1 Sympodiomycopsis paphiopedili_ DQ832238 Rhodotorula bacarum_af190002 53 Microstroma juglandis_eu069497 57 Rhodotorula hinnulea_af190003 98 Rhodotorula phylloplana_ AM748546 Rhodosporidium sphaerocarpum_ AF189919 DN15.3 87 Rhodotorula dairenensis_ AY033551 98 Rhodotorula glutinis_af459702 Rhodosporidium toruloides_ EF585193 52 DN2.11 Rhodosporidium diobovatum_ AF189914 Rhodosporidium babjevae_ AF189913 83 89 Rhodotorula graminis_af459704 70 DN16.2 DN16.1 99 DN17.1 Rhodosporidium paludigenum_ AF514863 97 DN3.9 Rhodotorula samaneae_ab055195 Rhodotorula cassiicola_ AB055197 Rhodotorula lysiniphila_ DQ538368 Rhodotorula pinicola_dq377682 Rhodotorula laryngis_ab078500 59 98 Moniliella mellis_af335519 Rhodotorula slooffiae_ab025994 DN15.2 86 DN7.1 76 Cystobasidium fimetarium_ AY512843 64 Rhodotorula nymphaeae_ab055194 Rhodotorula minuta_ab026000 Sporobolomyces symmetricus_ AY364836 Hình 1. Vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc các chi Jaminaea, Rhodosporidium và Rhodotorula 4

98 67 99 72 78 Candida tropicalis_fj665624 Candida albicans_dq318808 Candida oleophila_af178051 98 Candida sojae_u71070 Candida neerlandica_dq655686 Candida maltosa_ab034686 Candida metapsilosis_dq213057 81 DN3.3 Candida parapsilosis_ef694608 Candida dubliniensis_u57685 Candida africana_ay342214 Pichia anomala_fj515235 Hình 2. Vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Candida 54 50 59 83 91 52 56 84 99 90 71 57 85 66 Cryptococcus flavescens_ AF459668 Auriculibuller fuscus_am748525 Bullera japonica_af444760 Cryptococcus anemochorus_ DQ384929 Papiliotrema bandonii_af416642 DN15.4 Cryptococcus nemorosus_ AF472625 Cryptococcus perniciosus_ AF472624 97 DN18.2 72 DN2.7 DN2.6 Bullera anomala_ef682504 Bullera haininhensis_ab325678 Cryptococcus paraflavus_ AY395799 Cryptococcus flavus_eu177572 DN15.1 DN20.3 DN20.2 Cryptococcus podzolicus_ EF068196 Bullera ninhbinhensis_ab261011 Cryptococcus heveanensis_ AF075467 Bullera hoabinhensis_ AB193347 Bullera pseudoalba_af075504 Cryptococcus cellulolyticus_ AF075525 Cryptococcus rajasthanensis_ AM262324 Cryptococcus laurentii_ EF068214 DN19.1 Bullera unica_af075524 Bulleromyces albus_dq377658 DN2.3 Tremella encephala_af189867 Cryptococcus cylindricus_ DQ513289 Cryptococcus oeirensis_ EU002801 Cryptococcus magnus_eu365888 0.05 Hình 3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc các chi Bullera, Cryptococcus 5

8 5 51 DN2.10 Trichosporon mucoides_af335988 60 Trichosporon dermatis_eu559351 Trichosporon middelhovenii_ AB180198 59 59 Trichosporon terricola_ AB086382 59 Trichosporon moniliiforme_ AF189873 97 Trichosporon debeurmannianum_ AY143554 69 Trichosporon cutaneum_aj749837 85 Trichosporon jirovecii_ AM900368 81 Trichosporon cavernicola_ AB180195 80 Trichosporon shinodae_eu833235 Cryptococcus arboriformis_ AB260936 Trichosporon guehoae_af105401 Trichosporon domesticum_ AF189874 Trichosporon montevideense_ EU862820 Cryptococcus laurentii_ EF068214 0.05 Hình 4. Vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Trichosporon DN3.4 58 DN12.2 DN1.11 58 DN1.1 DN4.4 58 DN1.8 58 DN1.6 58 Pseudozyma hubeiensis_dq008953 58 DN4.6 59 DN2.2 59 DN7.3 51 DN2.5 50 DN9.3 53 DN3.7 DN7.2 63 DN3.5 DN1.2 99 Sporisorium trachypogonis plumosi_ay740113 Ustilago filiformis_ay740120 Ustilago davisii_dq875374 83 Ustilago xerochloae_ay740150 DN1.10 80 DN20.1 DN5.1 DN2.4 78 Pseudozyma tsukubaensis_ AJ235297 Ustilago spermophora_ay740171 97 DN2.8 50 63 Ustilago austro-africana_ AY740115 67 96 DN16.4 Ustilago alcornii_ay740165 90 Ustilago echinata_ay740144 57 Ustilago crameri_ay740143 Ustilago affinis_af133581 Moesziomyces eriocauli_ AY740094 63 74 Pseudozyma parantarctica_ AB089357 55 DN8.2 84 DN8.3 Sporisorium destruens_ay747077 54 Sporisorium mishrae_ay740136 77 Pseudozyma flocculosa_ay745712 99 DN1.9 56 54 DN12.1 Sporisorium themedae arguentis_ay740140 75 Sporisorium loudetiae pedicellatae_ay740106 Rhodotorula phylloplana_am748546 Hình 5. Vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc các chi Sporisorium, Pseudozyma và Ustilago 6

Bảng 3. Đa dạng nấm men trên lá cây mọc ở Sân bay Qu n sù Đà Nẵng TT Chi Loài Số lượng chủng Tổng số chủng, loài trong chi 1 Candida Candida parapsilosis 1 1(1 b ) Cryptococcus flavus 3 2 Cryptococcus Cryptococcus nemorosus 1 9(6 b ) Cryptococcus laurentii 1 Cryptococcus sp. 4 (3 a ) 3 Jaminaea Jaminaea angkoriensis 2 2(1 b ) Rhodosporidium paludigenum 2 4 Rhodosporidium Rhodosporidium toruloides 1 5(3 b ) Rhodosporidium sp. 2(1 a ) 5 Rhodotorula Rhodotorula sp. 5 (4 a ) 5(4 b ) 6 Sporisorium Sporisorium elionuri 2 2(1 b ) Pseudozyma parantarctica 2 7 Pseudozyma Pseudozyma tsukubaensis 3 20(3 b ) Pseudozyma hubeiensis 15 8 Trichosporon Trichosporon mucoides 1 1(1 b ) 9 Ustilago Ustilago alcornii 1 5 (3 b ) Ustilago sp. 4(2 a ) Tổng cộng 50 (23 b ) a Số lượng loài được nghi ngờ là loài mới (có độ tương đồng gen ADNr 26S đoạn D1/D2 thấp hơn 99% so với các loài gần gũi nhất đã biết trong ngân hàng gen.) b Số lượng loài trong chi Tiếng Việt TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972). Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, Nxb Khoa Học và Kỹ thuật, Hà Nội 2. Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty (2007). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh enzym ngoại bào của hai chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5 (1), 99-108. Tiếng Anh 3. Kimura M (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16: 111-120. 4. Kurtzman CP & Robnett CJ (1997). Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene. J Clin Microbiol 35:1216-1223. 5. Saitou N & Nei M (1987). The neighborjoining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406-425. 6. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F & Higgins DG (1997). The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool. Nucleic Acids Res 25: 4876-4882. 7

Lời cảm ơn Công trình được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật. Các tác giả xin cảm ơn GS.TSKH. Trịnh Tam Kiệt đã đọc và góp ý cho bản thảo SUMMARY Study on biodiversity of yeasts isolated in leaves, collected in dioxin polluted area in Da Nang military airport Dao Thi Luong, Tran Thi Le Quyen, Duong Van Hop Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi From 17 of 20 leaf samples, which were collected in dioxin polluted area in Da Nang military airport, 71 yeast strains were isolated. All 71 yeast strains have ability to degrade at least one of the tested substrates (starch, casein, carboxymethyl cellulose (CMC), chitin, lipid). The highest number of strains with CMCase activity were recorded (28%), followed by the numbers of strains with degrading activities of starch, casein, and chitin (11-17%). Most of them are not fermentable. 19.7% of them exhibited antibacterial activity against four pathogenic bacterial types. Fifty of 71 yeast strains were identified based on the sequence analysis of D1/D2 domain of 26S rdna, They belong to 9 genera and 23 species, of which 10 were suspected as new species. These strains were mainly grouped into 2 genera of Pseudozyma and Cryptococcus (29/50 strains, 9 species). The other 15 strains belong to the genera of Rhodotorula, Ustilago and Rhodosporidium (10 species). The rest were identified as Jaminaea, Sporisorium, Candida and Trichosporon (4 strains, 4 species). 8